Qui, presentiamo un lievito avanzato monoibrido protocollo per identificare i fattori di trascrizione (TFs) che possono essere associato ad una regione di DNA umana di interesse di screening. Questo metodo utilizza una pipeline di screening ad alta resa che può interrogare il legame di > 1.000 TFs in un singolo esperimento.
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Articolo metodologico
Schermi di monoibrido lievito avanzata per identificare il fattore di trascrizione associazione a sequenze di DNA umano
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Identificare i set di fattori di trascrizione (TFs) che regolano ogni gene umano è un compito arduo che richiede l'integrazione di numerosi approcci sperimentali e computazionali. Uno di questi metodi è il lievito monoibrido (Y1H) test, nelle quali interazioni tra DNA e TFs regioni vengono testate nell'ambito del nucleo di lievito utilizzando geni reporter. Y1H saggi riguardano due componenti: una 'DNA-bait' (ad es.., promotori, enhancers, silenziatori, ecc.) e una 'TF-preda,' che possa essere sottoposti a screening per l'attivazione del gene reporter. Più i protocolli pubblicati per l'esecuzione di Y1H schermi si basano sulla trasformazione TF-preda librerie o matrici in ceppi di lievito DNA-esca. Qui, descriviamo una pipeline, chiamato Y1H avanzata (eY1H) assays, dove interazioni TF-DNA sono interrogati dall'accoppiamento del DNA-esca ceppi con una collezione di serie di TF-preda ceppi utilizzando una matrice ad alta densità piattaforma robotica (HDA) che permette la proiezione in un 1.536 formato di Colonia. Questo permette un notevole aumento della velocità effettiva (60 sequenze di DNA-esca contro > 1.000 TFs richiede due settimane per ricercatore) e riproducibilità. Illustriamo i diversi tipi di risultati attesi dalla prova sequenze promotore umano contro una matrice di 1.086 umano TFs, nonché esempi di problemi che possono sorgere durante gli schermi e come risolverli.
Introduzione
Un problema centrale in campo biomedico consiste nel determinare i meccanismi con cui viene regolato ogni gene umano. Trascrizione è il primo passo nel controllo dei livelli di espressione genica, ed è regolato da un insieme di fattori di trascrizione (TFs) che sono unici per ogni gene. Dato che gli esseri umani codificano per > 1.500 TFs1,2, identificando il set completo di TFs che controllano l'espressione di ogni gene rimane una sfida aperta.
Due tipi di metodi possono essere utilizzati per mappare le interazioni TF-DNA: Metodi TF-centrato e DNA-centrato3 ....
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Protocollo
1. preparati
-
Piastre di SC −U −H (150mm di Petri)
Nota: Queste piastre verranno utilizzate per la coltivazione i ceppi di lievito DNA-esca.- Sciogliere il drop-out mix, lievito azoto base (YNB), adenina hemisulfate e solfato di ammonio in 920 mL di acqua e pH 5.9 con 5 M NaOH (circa 1 mL per litro di media; si veda tabella 2 per la composizione). Versare in un pallone da 2 L e aggiungere una barra per l'agitazione.
- In un secondo pallone da 2 L, aggiungere l'agar a 950 mL di acqua (non aggiungere un ancoretta come causerà l'agar a traboccare in autoclave).
- Autoclave per 40 min....
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Risultati
Tre fattori principali da considerare quando analizzando i risultati dalle analisi eY1H: l'attività del reporter sfondo del ceppo del DNA-esca, la forza dell'attività di giornalista corrispondente a interazioni TF-DNA e il numero di colonie positive. L'attività del reporter sfondo (cioè, autoactivity) del ceppo del DNA-esca si riferisce al colore delle colonie di lievito nella piastra di lettura, anche in assenza di un TF-preda e alla crescita complessiva. Idealmente, non autoactive ceppi mostrano un sfondo bianco o chia.......
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Discussione
L'approccio di screening degli amori robotici eY1H descritto qui notevolmente aumenta il throughput per identificare l'insieme di TFs che si legano ad una regione di DNA di interesse, rispetto al precedente screening libreria o screening allinearono approcci basati sulla trasformazione. Inoltre, le interazioni di TF-DNA rilevate da eY1H le analisi sono altamente riproducibili come il 90% delle interazioni rilevate sono testati positivi per tutte le quattro colonie in TF e 90% delle interazioni verificare nuovamente in un.......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere nessun concorrenti interessi finanziari.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato dal National Institutes of Health [R35-GM128625 a J.I.F.B.].
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 3-ammino-1,2,4-triazolo (3AT) ~95 % TLC | Sigma | A8056-100G | Inibitore competitivo per i prodotti del gene HIS3 |
| Adenina solfato (emisulfato), diidrato | US Biologicals | A0865 | Necessario per una corretta crescita del lievito |
| Agar Alta forza del gel - Grado batteriologico | American International Chemical | AGHGUP | Mezzi nutritivi per la crescita del lievito |
| Solfato di ammonio | US Biologicals | A1450 | Fonte di azoto in terreni di lievitazione sintetici |
| D+ Glucosio anidro | US Biologicals | G3050 | Richiesto per la crescita del lievito |
| Drop-Out Mix meno His, Leu, Tryp e Uracil, ricco di adenina senza base azotata del lievito | US Biologicals | D9540-02 | Terreno completo sintetico necessario per |
| il bordo di crescita del lievito PHmetro multiparametrico | Hanna Instruments | HI2020-01 | Per misurare il pH di mezzi selettivi |
| Stuzzicadenti piatti 750 ct | Diamante | Per striare lieviti su petridish | |
| Perle di vetro | Walter Stern | 100C | Per spreak lievito durante la produzione di prati |
| Glicerolo ≥ 99% | Millipore Sigma | G9012-1L | Necessario per produrre scorte di lievito congelate |
| L-Istidina | US Biologicals | H5100 | Per la selezione della crescita del lievito in terreni selettivi |
| L-Leucina | US Biologicals | L2020-05 | Per la selezione della crescita del lievito in terreni selettivi |
| L-Triptofano | Sigma | T-0254 | Per la selezione della crescita del lievito in terreni selettivi |
| N, N-dimetilformammide | Sigma | 319937-1L | Per fare la soluzione X-gal |
| Omnipense Elite | Wheaton | W375030-A | Per l'erogazione di volumi accurati di terreno nelle piastre Singer |
| Peptone, batteriologico | American International Chemical | PEBAUP | Fonte proteica necessaria per la crescita del lievito |
| Piastra di Petri, 150 mm x15 mm | VWR | 10753-950 | Per la coltivazione di esche di lievito per Singer |
| Instruments | PLU-003 | Per realizzare piastre rettangolari per agar da utilizzare con Singer Robot | |
| Precision Low Temperature BOD Refrigerated Incubator | ThermoFisher Scientific | PR205745R | Per incubare piastre di lievito a temperatura costante |
| RePads 1.536 corto | Singer Instruments | REP-005 | Per trasferire l'array di prede TF, accoppiare il lievito e trasferire il lievito alle piastre di selezione e lettura diploidi |
| RePads 384 short | Singer Instruments | REP-004 | Per trasferire l'array di prede TF da 384 a 1.536 formati di colonie |
| RePads 96 long Singer | Instruments | REP-001 | Per trasferire l'array di prede TF dal ceppo di glicerolo alla piastra di agar |
| RePads 96 short | Singer Instruments | REP-002 | Per trasferire l'array TF-prey da 96 a 384 colonie |
| Singer HDA Robot RoToR | Strumenti Singer Per | il trasferimento di lieviti ad alta produttività | |
| Idrossido di sodio (pellet/ACS certificato) | Fisher | S318-1 | Per la regolazione del pH di terreni selettivi |
| Fosfato di sodio bibasico eptaidrato | Santa Cruz Biotechnology | sc-203402C | Richiesto per l'attività del reporter LacZ su X-gal |
| Fosfato di sodio monobasico monoidrato | Santa Cruz Biotechnology | sc-202342B | Richiesto per l'attività del reporter LacZ su X-gal |
| Uracil | Sigma | U0750-100G | Per la selezione della crescita del lievito in terreni selettivi |
| X-gal (5-Bromo-4-cloro-3-indossil-beta-Dgalattopiranoside) | Gold Biotechnology | X4281C100 | β-galattosidasi trasforma in blu X-gal incolore per rilevare l'interazione proteina-DNA |
| Estratto di lievito | US Biologicals | Y2010 | Terreno nutriente per la crescita e la propagazione del lievito |
| Lievito azoto base (polvere) senza AA, carboidrati e senza AS | US Biologicals | Y2030 | Richiesto per una crescita vigorosa del lievito |
Riferimenti
- Vaquerizas, J. M., Kummerfeld, S. K., Teichmann, S. A., Luscombe, N. M. A census of human transcription factors: function, expression and evolution. Nature Reviews Genetics. 10 (4), 252-263 (2009).
- Lambert, S. A., et al. The Human Transcription Factors. Cell. 172 (....
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Ristampe e permessi
