Descriviamo un metodo per la generazione e amplificando geneticamente modificate virus sinciziale respiratorio (ad) e un saggio della placca ottimizzato per ad. Illustriamo questo protocollo creando due virus ricombinanti che rispettivamente permettono di quantificazione della replica di RSV e live analisi dei corpi di inclusione di RSV e dinamiche di granuli di corpi di inclusione-collegata.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
Generazione, amplificazione e titolazione del virus sinciziale respiratorio ricombinante
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'uso di virus ricombinanti è diventato cruciale in virologia di base o applicata. Genetica inversa ha dimostrata di essere una tecnologia estremamente potente, sia per decifrare i meccanismi di replicazione virale e per studiare farmaci antivirali o fornire la piattaforma di sviluppo per i vaccini. La costruzione e la manipolazione di un sistema di genetico inverso per un negativo-strand RNA virus come un virus respiratorio sinciziale (RSV), tuttavia, rimane delicate e richiede particolare know-how. Il genoma di RSV è un RNA single-strand, senso negativo di circa 15 kb che serve come modello per sia virale RNA replicazione e trascrizione. Il nostro sistema di genetica inversa utilizza una copia del cDNA del genoma di ceppo lunga RSV (HRSV). Questo cDNA, come pure di cDNA codificanti proteine virali della polimerasi complessa (L, P, N e M2-1), vengono inseriti in vettori di espressione individuale sotto sequenze di controllo della polimerasi di T7. La transfezione di questi elementi in cellule di BSR-T7/5, che esprimono stabilmente della polimerasi T7, consente la replica citoplasmatica e trascrizione di RSV ricombinante, dando origine a virioni geneticamente. Una nuova RSV, che è presente alla superficie delle cellule e nel surnatante cultura di BSRT7/5, si è riunita per infettare cellule HEp-2 per l'amplificazione virale. Due o tre cicli di amplificazione sono necessari per ottenere stock virali contenenti 1 x 106 a 1 x 107 unità formanti placca (PFU) / mL. Metodi per l'ottimale raccolta, congelamento e la titolazione degli stock virali sono descritti qui in dettaglio. Illustriamo il protocollo presentato qui creando due virus ricombinante rispettivamente esprimendo gratis proteina fluorescente verde (GFP) (RSV-GFP) o virale M2-1 fuso a GFP (RSV-M2-1-GFP). Vi mostriamo come utilizzare RSV-GFP per quantificare RSV replica e la RSV-M2-1-GFP per visualizzare strutture virali, come pure le dinamiche di proteina virale in cellule vive, utilizzando tecniche di microscopia dei video.
Introduzione
RSV umana è la principale causa di ricovero in ospedale per infezione acuta delle vie respiratorie nei neonati nel mondo1. Inoltre, RSV è associato a un onere notevole malattia negli adulti paragonabili all'influenza, con la maggior parte dell'ospedalizzazione e l'onere di mortalità in anziani2. Non esistono vaccini o farmaci antivirali specifici disponibili ancora contro RSV, ma promettendo nuovi farmaci sono in sviluppo3,4. La complessità e la pesantezza delle tecniche di quantificazione di moltiplicazione RSV ostacolare la ricerca di antivirali o vaccini nonos....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Protocollo
1. materiale preparazione
- Acquisto di media delle cellule (siero ridotto mezzi di comunicazione, minimo essenziale [MEM], 10 x MEM e Dulbecco s modified esente Eagle [DMEM]), reagente di transfezione e cellulosa microcristallina (Vedi Tabella materiali).
- Ottenere i seguenti vettori per genetica inversa: la genomica tutt'e i vettori di espressione che codifica la proteina di N e le proteine del complesso della polimerasi. I vettori genomici contengono il genoma completo del cDNA della RSV-GFP (GFP-RSV-p) e della RSV-M2-1GFP (p-RSV-M2-1GFP) a valle dal promotore del batteriofago T7 RNA polimerasi (T7 pol). I vettori di espressione (d....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Risultati
In questo lavoro, abbiamo descritto un protocollo dettagliato per produrre ricombinanti virus RSV che esprime una proteina fluorescente (Figura 2). OSPRO-GFP, il gene GFP è stato introdotto tra i geni P e M, come descritto per il gene della ciliegio in lavoro precedentemente pubblicato21. In OSPRO-M2-1-GFP, il gene di M2 è stato lasciato intatto e un ulteriore gene che codifica per M2-1-GFP è stata inserita tra i geni.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
Qui presentiamo un metodo di salvataggio del ricombinante ad da cinque plasmidi e la loro amplificazione. La capacità di manipolare il genoma del virus ha rivoluzionato la ricerca virologia per testare le mutazioni ed esprimere un ulteriore gene o una proteina virale taggata. La RSV abbiamo descritto e utilizzato come esempio in questo articolo è un virus che esprime un gene reporter, RSV-GFP (non pubblicati) ed esprime una proteina M2-1 fuso a un tag GFP12. Salvataggio di RSV è impegnativo e rich.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Gli autori ringraziano il Dr. Qin Yu da AstraZeneca R & D Boston, MA, USA, per la fornitura di droga AZD4316. Gli autori sono grati alla piattaforma Cymages per l'accesso al microscopio ScanR Olympus, che è stata sostenuta da sovvenzioni dalla regione Ile-de-France (DIM ONE HEALTH). Gli autori riconoscono supporto da INSERM e l'Università di Versailles Saint-Quentin.
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 35 mm & micro; piatto per l'imaging di cellule vive | Ibidi | 81156 | |
| A549 | ATCC | ATCC CCL-185 | |
| Avicel RC-591 | FMC BioPolymer | Avicel RC-591 | Informazioni tecniche e di altro tipo su Avicels sono disponibili all'indirizzo http://www.fmcbiopolymer.com. Conservare a temperatura ambiente. Il protocollo nella fase 4 è ottimizzato per questo reagente. |
| BSRT7/5 | non disponibile in commercio | Vedere riferimento 22. Buchholz et al. 1999 | |
| Soluzione di cristallovioletto | Sigma | HT90132 | |
| Microscopio a fluorescenza per osservazioni | Olympus | IX73 Microscopio | |
| fluorescenza per videomicroscopia | Olympus | ScanR Microscopio | |
| HEp-2 | ATCC ATCC | CCL-23 | |
| HEPES ≥ 99,5% | Sigma | H3375 | |
| L-Glutammina (200 mM) | ThermoFisher Scientific | 25030024 | |
| LIPOFECTAMINE 2000 REAGENT | Il protocollo ThermoFisher Scientific | 11668019 | al passaggio 2.3. è ottimizzato per questo reagente. |
| MEM (10x), senza glutammina | ThermoFisher Scientific | 11430030 | |
| MEM, GlutaMAX Integratore | ThermoFisher Scientific | 41090-028 | |
| MgSO4 ReagentPlus, ≥ 99,5% | Sigma | M7506 | |
| Opti-MEM I Terreno a siero ridotto | ThermoFisher Scientific | 51985-026 | |
| Soluzione acquosa di paraformaldeide, 32%, | Scienze della microscopia elettronica | 15714 | |
| Penicillina-Streptomicina (10.000 U/mL) | ThermoFisher Scientific | 15140122 | |
| Plasmidi | non disponibili | in commercioVedere riferimento 21. Rameix-Welti et al., 2014 | |
| See Saw Rocker | , VWR | 444-0341 | |
| Si RNA, GAPDH | Dharmacon | ON-TARGETplus, siRNA , D-001810-10-05 | SMARTpool e 3 dei 4 siRNA individuali progettati da Dharmacon. |
| Si RNA IMPDH2 | Dharmacon | ON-TARGETplus siRNA IMPDH2 Pool- Human L-004330-00-0005 | SMARTpool di 4 siRNA individuali progettati da Dharmacon. Riferimenti e sequenze individuali J-004330-06: GGAAAGUUGCCCAUUGUAA; J-004330-07: GCACGGCGCUUUGGUGUUC; J-004330-08: AAGGGUCAAUCCACAAAUU; J-004330-09: GGUAUGGGUUCUCUCGAUG; |
| Si RNA RSV N | Dharmacon | ON-TARGETplus siRNA personalizzato | UUCAGAAGAACUAGAGGCUAU e UUUCAUAAAUUCACUGGGUUA |
| SiRNA NT | Dharmacon | ON-TARGETplus Non-targeting Pool | |
| SiRNA reagente di trasfezione | Dharmacon | DharmaFECT 1 Rif: T-2001-03 | Il protocollo nei passaggi 5.1 e 5.1.2 è ottimizzato per questo reagente. |
| Bicarbonato di sodio soluzione 7,5% | ThermoFisher Scientific | 25080094 | |
| Spectrofluorimetro | Tecan Tecan | infinite M200PRO |
Riferimenti
- Shi, T., et al. Global, regional, and national disease burden estimates of acute lower respiratory infections due to respiratory syncytial virus in young children in 2015: a systematic review and modelling study. The Lancet. 390 (10098), 946-958 (2017).
- Falsey, A. R., Hennessey, P. A., Formica, M. A., Cox, C., Walsh, E. E.
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
Tag
Virus respiratorio sinciziale ricombinantesistema di genetica inversaamplificazione dello stock viralesaggio di titolazione per placchecellule BSR-T7/5infezione di cellule HEp-2tracciamento della fluorescenza GFPoverlay di cellulosa microcristallinacongelamento per il recupero viraleunità formanti placche
