Qui, dimostriamo la risonanza magnetica (MR) guidata dalla convezione migliorata (CED) dei vettori virali nella corteccia come un approccio efficiente e semplificato per ottenere l'espressione optogenetica attraverso grandi aree corticali nel cervello macaco.
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Articolo metodologico
Convezione Consegna migliorata del vettore virale optogenetico adeno-associato alla Corteccia di Rhesus Macaque Sotto la guida di immagini MRI online
In questo articolo
Sommario
Abstract
Nell'optogenetica dei primati non umani (NHP), infettare grandi aree corticali con vettori virali è spesso un compito difficile e dispendioso in termini di tempo. Qui, dimostriamo l'uso di risonanza magnetica (MR) convezione avanzata consegna (CED) di vettori virali optogenetici in cortici somatosensoriali primari (S1) e motori (M1) di macachi per ottenere un'espressione corticale efficiente e diffusa di canali ionici sensibili alla luce. I vettori virali associati ad adeno (AAV) che codificano l'opsin C1V1 con spostamento rosso sono stati iniettati nella corteccia dei macachi rhesus sotto il CED guidato dalla RM. Tre mesi dopo l'infusione, l'imaging epifluorescente ha confermato ampie regioni di espressione optogenetica (>130 mm2) in M1 e S1 in due macachi. Inoltre, siamo stati in grado di registrare risposte elettrofisiologiche affidabili evocate dalla luce dalle aree che esprimono utilizzando array microelettrocorticografici. L'analisi istologica successiva e l'immunostaining contro il reporter hanno rivelato un'espressione optogenetica diffusa e densa in M1 e S1 corrispondente alla distribuzione indicata dall'imaging epifluorescente. Questa tecnica ci permette di ottenere l'espressione su vaste aree della corteccia entro un periodo di tempo più breve con danni minimi rispetto alle tecniche tradizionali e può essere un approccio ottimale per la consegna virale optogenetica in animali di grandi dimensioni come gli NNP. Questo approccio dimostra un grande potenziale per la manipolazione a livello di rete dei circuiti neurali con specificità di tipo cellulare nei modelli animali evolutivamente vicini agli esseri umani.
Introduzione
L'optogenetica è un potente strumento che consente la manipolazione dell'attività neurale e lo studio delle connessioni di rete nel cervello. L'implementazione di questa tecnica nei primati non umani (NHP) ha il potenziale per migliorare la nostra comprensione del calcolo neurale su larga scala, cognizione, e il comportamento nel cervello dei primati. Sebbene l'optogenetica sia stata implementata con successo negli NFP negli ultimi anni1,2,3,4,5,6,
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Protocollo
Tutte le procedure sono state approvate dall'Università della California, San Francisco Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) e sono conformi alla Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio. La seguente procedura è stata eseguita utilizzando due macachi rhesus maschi adulti di 8 e 7 anni di età, del peso rispettivamente di 17,5 kg e 16,5 kg (scimmia G e scimmia J).
NOTA: utilizzare tecniche asestetiche standard per tutte le procedure chirurgiche.
1. Imaging di base
- Sedare e intubare l'animale e mantenere l'anestesia generale sotto isoflurane (la concentrazione è cambiata tra 0 ....
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Risultati
Convezione Enhanced Delivery (CED) sotto MRI Guidance
La diffusione del vettore virale è stata monitorata durante l'infusione di CED sotto la guida delle immagini MR online (Figura 3A). In questo studio, S1 e M1 di due scimmie sono stati presi di mira (Figura 3B). I volumi di distribuzione tridimensionali sono stati stimati in un'analisi post-hoc delle .......
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Discussione
Qui, descriviamo una tecnica fattibile ed efficiente per ottenere espressione optogenetica su larga scala nella corteccia somatosensoriale e motoria di NHP da CED guidata da MR. L'uso del CED a guida MR presenta vantaggi significativi rispetto ai metodi tradizionali di infusione virale nel cervello NHP. Uno di questi vantaggi è la capacità di raggiungere l'espressione su grandi aree con meno infusioni richieste. Ad esempio, con i metodi convenzionali, iniezioni multiple di 1-2 L dell'espressione di rendimento vettoriale .......
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Dichiarazioni
PNS ha interesse finanziario in Neuralink Corp., una società che sta sviluppando terapie cliniche utilizzando la stimolazione cerebrale.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto dalla borsa di studio post-dottorato dell'American Heart Association (AY), dalla Defense Advanced Research Projects Agency (DARPA) e dalla Plasticity to Accelerate Injury Recovery (REPAIR; N66001-10-C-2010), R01. NS073940, e dall'UCSF Neuroscience Imaging Center. Questo lavoro è stato sostenuto anche dall'Eunice Kennedy Shiver National Institute of Child Health & Human Development dei National Institutes of Health sotto il premio Numero K12HD073945, il Washington National Primate Research Center (WaNPCR, P51 OD010425), e il Center for Neurotechnology (CNT, un National Science Foundation Engineering Research Center sotto Grant EEC-102872....
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Tubi per flebo ad alta pressione da 0,2 mL | Smiths Medical Inc., Dublino, OH, USA | 533640 | |
| Diametro interno di 0,32 mm, diametro esterno di 0,43 mm Tubi in silice | Polymicro Technologies | 1068150027 | |
| diametro interno di 0,45 mm, diametro esterno di 0,76 mm Tubi in silice | Polymicro Technologies | 1068150625 | |
| AAV2.5-CamKII-C1V1-EYFP | Penn Vector Core, Università della Pennsylvania | ||
| ABS plastica | Stratasys, MN, USA | ABSplus-P430 | |
| Telo antimicrobico per incisione | 3M | 6650EZ | Ioban Telo |
| dentale acrilico | Henry Schein, Inc. | 1013117 | Agente legante acrilico |
| Ascensori | VWR International, LLC. | 10196-564 | Elevatore Langenbeck, |
| sutura fine | McKesson Medical-Surgical Inc. | ||
| Gadoteridol | Prohance, Bracco Diagnostics, Princeton, NJ | 0270-1111-04 | |
| Laser per la stimolazione della luce | Omicron-Laserage, Germania | PhoxX 488-60 | |
| MR compatibile 3 cc siringa | Harvard apparato, Holliston, MA, USA | 59-8377 | |
| Software di imaging MR | Pixmeo | OsiriX MD 10.0 | |
| MR-Compatibile Pompa | Harvard apparato, Holliston, MA, USA | Harvard PHD 2000 | |
| Telaio stereotassico compatibile con la risonanza magnetica | KOPF | 1430M MRI | |
| Perifix Clamp Connettore per catetere | B-Braun, Bethlehem, PA, USA | N/A | |
| Viti in plastica | Plastica 1 | 0-80 x 1/8N | Viti in nylon |
| Viti in titanio | Crist Instrument Co., Inc. | 6-YCX-0312 | Viti ossee autofilettanti |
| Trephine | GerMedUSA Inc, | SKU:GV70-42 | |
| uPrinter SE Stampante 3D | Stratasys, MN, USA | N/A | |
| Capsula di vitamina E Pure | Encapsulations, LLC. | DE1 | |
| Gelatina assorbibile sterile umida | Pfizer Inc. | AZL0009034201 | Gelfoam |
Riferimenti
- Ruiz, O., et al. Optogenetics through windows on the brain in the nonhuman primate. Journal of Neurophysiology. 110 (6), 1455-1467 (2013).
- Diester, I., et al. An optogenetic toolbox designed for primates. Nature Neuroscience. 14 (3), 387-3....
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Ristampe e permessi
