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Articolo metodologico

Assaying Circuit Specific Regulation of Adult Hippocampal Neural Precursor Cells

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DOI:

10.3791/59237

⸱

24 luglio 2019

 ,  ,  ,  , 
1Department of Pharmacology, University of North Carolina Chapel Hill, 2Neuroscience Center, University of North Carolina Chapel Hill, 3Neuroscience Curriculum, University of North Carolina Chapel Hill

In questo articolo

Sommario

L'obiettivo di questo protocollo è descrivere un approccio per l'analisi del comportamento delle cellule staminali/progenitrici neurali adulte in risposta alla manipolazione chemiogenetica di uno specifico circuito neurale locale.

Abstract

La neurogenesi adulta è un processo dinamico mediante il quale le cellule staminali neurali appena attivate (NSC) nella zona subgranulare (SG) del giro dentato (DG) generano nuovi neuroni, che si integrano in un circuito neurale esistente e contribuiscono a specifiche funzioni ippocampali . È importante sottolineare che la neurogenesi adulta è altamente suscettibile agli stimoli ambientali, che consente la regolazione dipendente dall'attività di varie funzioni cognitive. Una vasta gamma di circuiti neurali provenienti da varie regioni del cervello orchestra queste funzioni cognitive complesse. È quindi importante capire come specifici circuiti neurali regolano la neurogenesi adulta. Qui, descriviamo un protocollo per manipolare l'attività del circuito neurale utilizzando il recettore del designer attivato esclusivamente dalla tecnologia dei farmaci di design (DREADDs) che regola le NSC e la progenie neonatale nei roditori. Questo protocollo completo include l'iniezione stereotassica di particelle virali, la stimolazione chemiogenetica di specifici circuiti neurali, la somministrazione analogica della tiofina, l'elaborazione dei tessuti, l'etichettatura dell'immunofluorescenza, l'imaging confocale e l'imaging analisi di varie fasi delle cellule precursori neurali. Questo protocollo fornisce istruzioni dettagliate sulle tecniche di recupero degli antigeni utilizzate per visualizzare le NSC e la loro progenie e descrive un modo semplice, ma efficace per modulare i circuiti cerebrali utilizzando clozapina N-ossido (CNO) o acqua potabile contenente CNO e DREADDs-esprimere virus. La forza di questo protocollo sta nella sua adattabilità per studiare una vasta gamma di circuiti neurali che influenzano la neurogenesi adulta derivata dalle NSC.

Introduzione

La neurogenesi adulta è un processo biologico attraverso il quale nuovi neuroni nascono in un adulto e integrati nelle reti neurali esistenti1. Nell'uomo, questo processo si verifica nel giro dentato (DG) dell'ippocampo, dove nascono circa 1.400 nuove cellule ogni giorno2. Queste cellule risiedono nella parte interna della DG, che ospita una nicchia neurogenica, definita zona subgranulare (SG. Qui, ippocampal adulti cellule staminali neurali (NSC) subiscono un complesso processo di sviluppo per diventare neuroni completamente funzionali che contribuiscono alla regolazione di specifiche funzioni cerebrali, tra cui apprendimento e memoria, regolazione dell'umore, e la risposta allo stress3 ,4,5,6. Per influenzare i comportamenti, le NSC adulte sono altamente regolate da vari stimoli esterni in modo dipendente dall'attività rispondendo a una serie di segnali chimici locali e distale. Questi segnali chimici includono neurotrasmettitori e neuromodulatori e agiscono in modo specifico del circuito da varie regioni del cervello. È importante sottolineare che la convergenza su circuiti di questi segnali chimici sulle NSC consente una regolazione unica e precisa dell'attivazione delle cellule staminali, della differenziazione e delle decisioni sul destino.

Uno dei modi più efficaci per interrogare la regolazione dei circuiti delle NSC adulte in vivo è associare l'analisi dell'immunofluorescenza con manipolazioni a livello di circuito. L'analisi dell'immunofluorescenza delle NSC adulte è una tecnica comunemente utilizzata, in cui gli anticorpi contro specifici marcatori molecolari vengono utilizzati per indicare lo stadio di sviluppo delle NSC adulte. Questi marcatori includono: nestina come una cellula radiale glia e marcatore progenitore precoce, Tbr2 come marcatore progenitore intermedio, e dcx come un marcatore neurone neuroblast e immaturo7. Inoltre, somministrando analoghi di tiofina come BrdU, CidU, Idu ed Edu, le popolazioni cellulari in fase S possono essere etichettate individualmente e visualizzate8,9,10. Combinando questi due approcci, è possibile studiare una vasta gamma di domande che vanno dal modo in cui la proliferazione è regolata in fasi di sviluppo specifiche, al modo in cui i vari segnali influenzano la differenziazione e la neurogenesi della NSC.

Esistono diverse opzioni per manipolare efficacemente i circuiti neurali, tra cui la stimolazione elettrica, l'optogenetica e la chemiogenetica, ognuna con i propri vantaggi e svantaggi. La stimolazione elettrica comporta un'estesa chirurgia in cui gli elettrodi vengono impiantati in una regione cerebrale specifica che vengono successivamente utilizzati per trasmettere segnali elettrici per modulare una regione cerebrale mirata. Tuttavia, questo approccio manca sia di specificità cellulare che di circuito. L'optogenetica comporta la consegna di particelle virali che codificano un recettore attivo alla luce che viene stimolato da un laser emesso attraverso una fibra ottica impiantata, ma richiede ampie manipolazioni, costi generali e interventi chirurgici complessi11. La chemiogenetica comporta la consegna di particelle virali che codificano un recettore di design attivato esclusivamente da farmaci di design o DREADD, che vengono successivamente attivati da un ligando specifico e biologicamente inerte noto come clozapina N-ossido (CNO)12 . Il vantaggio di utilizzare dREADD per manipolare i circuiti neurali locali che regolano le NSC adulte sta nella facilità e nelle varie rotte dell'amministrazione CNO. Ciò consente un approccio meno dispendioso in termini di tempo con una gestione ridotta degli animali, facilmente adattabile per studi a lungo termine per modulare i circuiti neurali.

L'approccio descritto in questo protocollo è una raccolta completa di vari protocolli necessari per interrogare con successo la regolazione del circuito della neurogenesi ippocampale adulta che combina sia tecniche di immunofluorescenza che manipolazioni di circuiti usando la chemiogenetica. Il metodo descritto nel seguente protocollo è appropriato per stimolare o inibire uno o più circuiti contemporaneamente in vivo per determinare la loro funzione regolatoria sulla neurogenesi adulta. Questo approccio è meglio utilizzato se la domanda non ha bisogno di un alto grado di risoluzione temporale. Le domande che richiedono un controllo temporale preciso della stimolazione/inibizione ad una certa frequenza, possono essere affrontate meglio utilizzando l'optogenetica13,14. L'approccio qui descritto è facilmente adattabile per studi a lungo termine con una minima manipolazione animale, soprattutto quando lo stress è una delle principali preoccupazioni.

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Protocollo

Tutte le procedure, inclusi i soggetti animali, sono state approvate dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) dell'Università della Carolina del Nord Chapel Hill.

1. Iniezione stereotassica di particelle virali

  1. Determinare i circuiti neurali in questione. Questo determinerà il virus e la linea del mouse utilizzato per la seguente procedura.
    NOT: Per questo esempio, le proiezioni delle cellule muschio contralaterale vengono stimolate ad analizzare i suoi effetti sulla neurogenesi adulta. Le particelle virali codificanti AAV5-hSyn-DIO-hM3Dq-mCherry vengono consegnate alla DG dei topi 5ht2A-Cre15.
  2. Somministrare la melossicam (5 mg/kg, sottocutaneamente) almeno 30 min pre-operatoripermente per fornire analgesia preventiva a un topo eterozigous 5ht2A-Cre di 8 settimane.
  3. Anestesizzare il topo utilizzando una miscela di ossigeno isoflurano 4% fino a quando la sua respirazione rallenta e il topo è incosciente utilizzando una camera di isoflurane. Toe pizzicare il mouse per assicurarsi che non è reattivo.
  4. Posizionare il mouse nello stereotax su un piccolo pad di riscaldamento per animali per la regolazione termica e applicare il lubrificante per gli occhi per ogni occhio. Ridurre l'isoflurane all'1,5% una volta che l'animale è all'interno dello stereotax.
    NOT: Il posizionamento della barra dell'orecchio durante questa fase è importante. Assicurarsi che la testa sia livellata dopo il posizionamento della barra dell'orecchio. Istruzioni più dettagliate possono essere trovate in Geiger et al.16.
  5. Posizionare il prodotto per la depilazione sulla testa e lasciarlo sedere fino a 1 min massimo. Rimuovere i capelli asciugando la testa con salviette etanolo. Se i capelli non sono completamente rimossi, ripetere questo processo fino a quando la parte superiore della testa è senza peli.
  6. Disinfettare la zona senza peli con una soluzione povidone-iodio almeno 3 volte.
  7. Mettere la soluzione lidocaina topica sulla pelle senza peli della testa e attendere 1 min. Rimuovere lidocaine topica dalla testa e fare una piccola incisione sulla testa dall'inizio degli occhi all'inizio delle orecchie circa 2 mm utilizzando un bisturi chirurgico.
    NOT: Toe pizzicare il mouse per assicurarsi che sia completamente sedato prima di fare eventuali incisioni.
  8. Ritrarre il cuoio capelluto e pulire il tessuto connettivo sulla parte superiore della testa utilizzando tamponi di cotone sterilizzato fino a quando il bregma è facilmente identificabile.
  9. Individuare il bregma e regolare la testa in modo che il bregma e la lambda siano entrambi sullo stesso piano posizionando il trapano in entrambe le coordinate e assicurandosi che si allineino. Inoltre, allineare l'emisfero sinistro e destro posizionando il trapano a sinistra/destra di una regione tra bregma e lambda.
    NOT: Questo passo è molto importante; posizionamento della testa allineato in modo non corretto interromperà le coordinate stereotaxiche.
  10. Forare alle seguenti coordinate di bregma utilizzando una bit di perforazione da 0,5 mm: asse posteriore anteriore (AP) -2,00 mm, asse laterale mediale (ML) 1,50 mm. Creare un foro di perforazione da 0,5 mm a 1 mm di diametro.
    NOT: Modificare questo passaggio con coordinate specifiche per il circuito in questione. Questo esempio si rivolge a un giro dentato unilaterale contenente cellule muschio e determina il loro effetto sulle cellule staminali neurali adulte sul lato contralaterale.
  11. Cambia foratura su 5-L di siringa e 26-33 G di ago. A bregma e poi iniettare alle seguenti coordinate posizionando l'ago nel foro ad un asse posteriore posteriore anteriore -2,00 mm, asse laterale mediale -1,50 mm, asse ventrale dorsale -2,3 mm.
  12. Infondere 500 nL di virus adeno-associato (AAV) da un nucleo virale o fonte commerciale all'emisfero appropriato, a 50-100 nL/min utilizzando una pompa di infusione (Tabella dei materiali). Attendere almeno 5 min dopo l'iniezione prima di rimuovere lentamente l'ago dal cervello.
    NOT: Queste coordinate possono richiedere una regolazione in base all'età e alle dimensioni del mouse. Alcuni sierotipi virali hanno modelli di diffusione diversi, è meglio eseguire esperimenti pilota per testare la diffusione virale prima di un esperimento completo.
  13. Pulire il cuoio capelluto e la pelle intorno all'incisione salina, quindi sigillare l'incisione utilizzando l'adesivo del tessuto (Tabella dei materiali) tenendo la pelle insieme a una pinzetta. Eseguire tutte le procedure post-operatorie come il monitoraggio durante il recupero su una piastra di riscaldamento fino a quando il mouse è attivo, applicando analgesico sulla ferita e somministrando antidolorifici per due giorni.
    NOT: Molti esperimenti richiedono 2-4 settimane di attesa dopo l'infusione virale per una corretta espressione virale.

2. Amministrazione Clozapine N-ossido

  1. Preparare una soluzione CNO stock sciogliendo 10 mg di CNO in 100 L di solforo dimetilo (DMSO) e vortice.
    NOT: Se la soluzione non si scioglie completamente, aumentare il volume di DMSO, ma troppo DMSO può rendere l'acqua amara. Non superare lo 0,1% d'DMSO in soluzione idrica CNO o più di 200 -L di DMSO per una soluzione da 200 mL. La soluzione di stock CNO può essere conservata a -20 gradi centigradi per un massimo di due settimane.
  2. Aggiungete una soluzione di riserva di 10 mg/100 l'LNO a ogni 200 mL di acqua per una concentrazione finale di 1/5 mg/200 mL. Preparare la miscela di acqua CNO fresca ogni giorno.
    NOT: Alcuni gruppi hanno integrato fino a 1% saccarina in acqua per mascherare l'amarezza se i topi si astengono dal bere. Il circuito esaminato ha mostrato una risposta diversa in base all'entità dell'attivazione. In generale, 1 mg CNO/200 mL è sufficiente per stimolare la maggior parte dei circuiti17.
  3. Collocare la soluzione CNO in un contenitore coperto di lamina o protetto dalla luce durante la somministrazione ai topi due settimane dopo il recupero dall'iniezione stereotassica dal passaggio 1.13 per un periodo di 4 giorni.
    NOT: CNO è sensibile alla luce; ridurre l'esposizione alla luce durante l'intero processo.
  4. Misurare e registrare la soluzione di acqua CNO consumata ogni giorno durante la preparazione di una soluzione CNO fresca. In media, un topo adulto consumerà circa 4 mL di miscela di acqua CNO. Inoltre, registrare il peso del mouse ogni giorno per assicurarsi che stanno bevendo.
  5. Assicurarsi che vengano utilizzati controlli appropriati per ogni esperimento. Includere sia un controllo CNO che un controllo DREADD. Un esempio di un setup sperimentale potrebbe includere: (1) veicolo - veicolo anfibio autonomo (AAV) con reporter virale no DREADD, (2) CNO - AAV con reporter virale no DREADD, e (3) CNO - AAV DREADD.
    NOT: Tutti i gruppi includono DMSO nella soluzione. I controlli DMSO non sono inclusi perché gli animali ricevono meno dello 0,1% di DMSO, che non ha dimostrato di avere effetti negativi sulle cellule staminali neurali adulte nei topi. Se ci sono preoccupazioni per quanto riguarda l'uso di DMSO in acqua potabile, aggiungere un ulteriore nessun DMSO e controllo salina.

3. Etichette analogiche di timiina

  1. Il giorno della raccolta dei tessuti, 4 giorni dopo la somministrazione, etichettare le cellule che proliferano eseguendo una serie di iniezioni intraperitoneali analogiche della tiofona, 5-ethynyl-2'-deossiuridina (Edu).
    NOTA:     questo protocollo utilizza Edu. Tuttavia, ci sono diversi analoghi di timina che possono etichettare in modo efficiente le popolazioni di cellule che proliferano tra cui Brdu, Idu e Cidu8.
    1. Pesare Edu e sciogliere in grado veterinario 0.9% soluzione di iniezione di cloruro a 4 mg/mL vortice e mettendo su un rotore per 15 min.
      NOT: Gli analoghi della timina sono tossici e sensibili alla luce. Seguire le schede tecniche di sicurezza dei materiali (MSDS) durante la manipolazione e coprire la soluzione dall'esposizione alla luce utilizzando un foglio di alluminio.
    2. Somministrare Edu intraperitamente a 40 mg/kg o 0,1 mL/10 g di peso corporeo della soluzione 4 mg/mL Edu 4 volte ogni 2 h.
      NOT: Le dosi superiori a 50 mg/kg raggiungono livelli di saturazione prossima e non aumenteranno significativamente la quantità di cellule che proliferano etichettate18. E 'fondamentale che tutti i topi ricevono la stessa quantità di iniezioni Edu dal momento che l'etichettatura impropria può inclinare i risultati.

4. Preparazione e lavorazione dei tessuti

  1. Due ore dopo l'ultima iniezione di Edu, anestesizzare il topo utilizzando una camera isoflurane fino a quando la respirazione è significativamente ridotta e punta pizzica per garantire che sia completamente sedata.
  2. Fissare il mouse alla superficie utilizzando aghi e fare una piccola incisione esponendo il cuore. Inserire un ago da 25 G sull'aorta sinistro e tagliare il ventricolo destro per la perfusione transcardiale con soluzione salina tamponata da fosfati (PBS) ad una portata di 1,4 mL/min fino a quando il tessuto epatico non viene eliminato.
  3. Passare la soluzione di perfusione al 4% di paraformaldeide (PFA) e perfondere circa 15-20 mL per fissare il tessuto cerebrale.
    NOT: Istruzioni più dettagliate sul processo di perfusione sonodisponibili in Gage et al. I tremori animali saranno osservati se fatti correttamente.
  4. Rimuovere la testa con un paio di grandi forbici e quindi eseguire una serie di incisioni accurate per liberare il cervello dal cranio. Conservare il tessuto cerebrale a 4 gradi centigradi in 4% PFA durante la notte per continuare a fissarlo.
  5. Rimuovere il tessuto cerebrale dal 4% di soluzione PFA e mettere in una soluzione di saccarosio del 10% in PBS per crioproteggere il tessuto per 24 h a 4 gradi centigradi. Trasferire quindi il tessuto a una soluzione PBS di saccarosio del 30% per altre 24 ore a 4 gradi centigradi prima di sezionare.
    NOT: Il tessuto cerebrale affonderà nel saccarosio quando è pronto per la sezionamento del microtoma. Tessuto cerebrale può essere immagazzinato a lungo termine nel 30% saccarosio.
  6. Sezione tessuto cerebrale coronalmente in 40 sezioni m utilizzando un microtoma. Raccogliere le sezioni che iniziano all'inizio del giro dentato, a circa -1,20 mm da bregma, e terminano dopo che la piastra è completa con la prima sezione è la più anteriore e l'ultima sezione è la più posteriore. Consultare un atlante cerebrale del topo per identificare con precisione la DG e le coordinate iniziali della raccolta dei tessuti.
  7. Memorizzare in serie ogni sezione in file da 6 in una piastra 48 ben riempita con soluzione antigelo (Tabella 1).
Soluzione antigeloEtilene-glicol 150 mL - saccarosio 150 g di riempimento a 500 mL 0,1 M PB per una soluzione da 500 mL
Buffer citrate9 mL di scorte di acido citrico - 41 mL di tampone di citrato tri-sodio - 450 mL di ddH2O
Stock di acido citrico[0,1 M] Acido citrico 21 g/1 L ddH2O
Stock di citrati tri-sodio[0,1 M] Tri-sodio Citrato 29,4 g/1 L ddH2O
Tris Buffered Saline -Triton (TBS -Triton)0.05% 100-x Triton in TBS
Buffer di permeabilizzazione0,5% 100-x Triton in TBS
Buffer di blocco0,33 mL di siero d'asino in 10 mL TBS-Triton
Soluzione di reazione EduRealizzare una soluzione CuSO4x 5H2O aggiungendo 1 mg di CuSO4,5H2O in soluzione 4 mL di [0.1 M] Tris pH 8.5. Aggiungete quindi 1:40 di una soluzione aza488-Alexa488 da 600 M e 10 mg/mL di L-Na , ascorbate, alla soluzione CuSO45H2O prima di applicarla al tessuto.

Tabella 1: Soluzioni utilizzate per l'immunoistochimica.

5. Immunoistochimica

  1. Protocollo mobile di base
    NOT: Se si macchia la nidificazione, saltare la sezione 5.1 e passare alla sezione 5.2. Il protocollo galleggiante di base è per Tbr2 o doublecortin (DCX) solo senza timine analogica Colorazione Edu.
    1. Trasferire le sezioni dalla soluzione antigelo alla salina (TBS) con buffer Tris in ordine seriale in una piastra di 48 pozzetto.
    2. Lavare le sezioni due volte in TBS-triton (0,05% TBS-triton, tabella 1) per 5 min aspirando la soluzione ogni volta mentre agitava o su un rocker a velocità rlate.
    3. Permeabilize sezioni utilizzando buffer di permeabilizzazione (0.5% TBS-triton, Tabella 1) per 20-30 min mentre agitano a velocità lente.
    4. Creare il buffer di blocco aggiungendo 0,33 l di siero dell'asino a 10 mL di TBS-triton. Fare fresco e utilizzare entro 3 giorni.
    5. Buffer di permeabilizzazione aspirato e sezioni di incubazione nel buffer di blocco per 30 min a 1 h a temperatura ambiente (RT).
    6. Rendere la soluzione anticorpo primaria nel buffer di blocco e aggiungere a ogni pozzo. È sufficiente un'improvvisa sommerssità di 500 l/beh. Incubare pernottamento a RT su un rocker o shaker.
    7. Soluzione aspirata e risciacquare le sezioni in TBS-triton 3x per 10 min ciascuna per rimuovere tracce di anticorpo primario.
    8. L'incubazione nel fluoroforo ha coniugato anticorpi secondari contro anticorpi primari preparati in soluzione tampone di blocco per 2 h a RT su un rocker.
    9. Lavare le sezioni 3x per 5 min ciascuna in TBS-triton e poi incubare le sezioni in soluzione DAPI (4,6-diamidino-2-fenylindole) (300 soluzione M a 1:100) diluita in PBS per 15 min.
    10. Lavare le sezioni 3x in PBS e montare le sezioni mantenendo l'ordine seriale dall'anteriore al posteriore su uno scivolo caricato positivamente. Lasciare asciugare il tessuto a RT fino a quando l'umidità è visibilmente andato, di solito circa 2/5 min, prima di coprire con supporti di montaggio.
  2. Recupero dell'antigene
    NOT: Questa sezione è necessaria solo per nestin. In caso di colorazione nestin, eseguire questa sezione prima della colorazione analogica della timina (sezione 5.3). Salta per la colorazione Tbr2 o DCX con Edu.
    1. Posizionare le sezioni di tessuto in PBS e montare sezioni di 5-8 su uno scivolo caricato positivamente mantenendo l'ordine seriale dall'anteriore al posteriore. Lasciare asciugare le sezioni di tessuto a RT per aderire completamente ai vetrini, che richiede circa 2/5 min.
    2. Preparare il tampone di citrati (Tabella 1) in un contenitore, in genere una scatola di 1.000 pipette da 1.000.
    3. Riscaldare il tampone del citrato in forno a microonde (1.000 W) per 5 minuti fino a quando la soluzione non è in ebollizione. Mentre la soluzione è in riscaldamento, posizionare le sezioni montate in un supporto di scorrimento in vetro da 20 vetrini. Dopo 5 min, posizionare con cura il supporto scorrevole con sezioni nella scatola della pipetta.
    4. Impostare la potenza del forno a microonde al 50% e cuocere il tempo per 7 min. Durante questi 7 minuti, fermare il forno a microonde quando la soluzione inizia a bollire e continuare il forno a microonde dopo l'ebollizione si ferma.
      NOT: L'obiettivo di questo passaggio è quello di mantenere la temperatura dell'acqua proprio al di sotto della temperatura di ebollizione per 7 min. Istruzioni più dettagliate possono essere trovate in Hussaini et al.
    5. Estrarre la scatola calda con tampone di citrato e vetrini di tessuto e metterlo in un secchio di ghiaccio per raffreddare. Coprire per evitare che ghiaccio o altri materiali entrino nella soluzione. Attendere circa 30 min o fino a quando la soluzione è cool per toccare.
    6. Procedere al passaggio di colorazione analogica timidine 5.3.2 se si utilizza l'analogico di timiina.
  3. Colorazione analogica della timina
    NOT: Iniziare da qui se macchiare Edu e Tbr2 o Edu e DCX.
    1. Posizionare le sezioni di tessuto in PBS e montare sezioni di 5-8 su una diapositiva caricata positivamente mantenendo l'ordine seriale da anteriore a posteriore e lo stesso orientamento. Lasciare asciugare le sezioni di tessuto per aderire completamente ai vetrini e quindi disegnare un bordo utilizzando una penna idrofobica o penna PAP.
    2. Permeabilizzare le sezioni con buffer di permeabilizzazione (0,5% TBS-triton) per 20-30 min. Quindi lavare le sezioni 2x utilizzando TBS-triton per 5 min ciascuno.
      NOT: La permeabilizzazione aiuta la penetrazione degli anticorpi intracellulari. Il tempo di permeabilizzazione può essere regolato a seconda dello spessore del tessuto e dell'efficienza degli anticorpi. In alternativa, si può aumentare la concentrazione di detergenti per aumentare la potenza di permeabilizzazione. Tuttavia, occorre fare attenzione a non permeabilizzare per troppo tempo da quando la fragilità dei tessuti aumenta con tempi di permeabilizzazione prolungati.
    3. Preparare la soluzione di reazione Edu secondo la tabella 1. La concentrazione finale di Alexa488-azide è di 15 M in 1 mL di soluzione di reazione Edu.
    4. Incubare le sezioni nella soluzione di reazione Edu per 30 min a 1 h e poi lavare 3x in TBS-triton per 5 min ciascuno. Coprire i vetrini in un foglio di alluminio per proteggersi dalla luce dopo questo passaggio. In questa fase verificare se la reazione Edu funziona utilizzando un microscopio fluorescente. Le cellule etichettate Edu fluoresceranno al microscopio dell'epifluorescenza.
  4. Protocollo di sezione del tessuto montato
    1. Sezioni di tessuto a blocchi montate su un vetrino dal passaggio 5.3.4 utilizzando il buffer di blocco sollevato negli stessi animali dell'anticorpo secondario, ad esempio, il siero dell'asino, per 30 min a 1 h e quindi lavare 2x in TBS-triton per 5 min ciascuno.
    2. Preparare la soluzione anticorpale primaria (ad esempio, pollo anti-nestin) durante la fase di blocco mescolando gli anticorpi primari nella soluzione di blocco tampone a 1:200. È sufficiente una 250 LL per diapositiva per garantire che il tessuto sia completamente immerso nella soluzione.
    3. Incubare le sezioni di tessuto in una soluzione anticorpale primaria durante la notte a RT dopo il blocco autouris. Modificare questo passaggio in base all'anticorpo primario utilizzato.
      NOT: Se gli anticorpi hanno un background elevato o un legame non specifico, l'incubazione a 4 gradi centigradi invece di RT può migliorare i risultati. Gli anticorpi con scarsa penetrazione del tessuto possono essere lasciati incubare per 2 giorni se necessario.
    4. Incubare le sezioni del tessuto 3x in TBS-triton per 5 min per rimuovere l'anticorpo primario in eccesso. Poi incubare sezioni di tessuto in fluoroforo urtato anticorpi secondari (cioè Alexa 647 anti-pollo a 1:200) preparati in soluzione di blocco tampone per 2 h a RT.
    5. Incubare le sezioni del tessuto 3x in TBS-triton per 5 min per rimuovere l'anticorpo secondario in eccesso e applicare 300 soluzione DAPI a 1:100 in PBS per 15 min a RT.
    6. Incubare le sezioni di tessuto 3x in PBS per 5 min per rimuovere l'eccesso DAPI e rimuovere il cerchio di pap pen da tutto il tessuto utilizzando un tampone di cotone o una delicata pulizia del compito. Lasciare asciugare le sezioni e quindi applicare il supporto di montaggio e coprire lo slip. Lasciare asciugare i supporti di montaggio prima di creare scivoli.

6. Collezione di immagini

  1. Gruppi sperimentali ciechi da gruppi di controllo coprendo le etichette di scorrimento e l'immagine lo stesso lato della DG utilizzando un microscopio confocale (Tabella dei materiali) con lente ottica di ingrandimento dell'olio 40x a 1 dimensione di passo o uno zoom 20x 2x a 1 m.
    NOT: L'ingrandimento dell'olio 40x darà una maggiore risoluzione, ma richiederà più tempo rispetto allo zoom 20x 2x.
  2. Impostare obiettivo obiettivo a 40x e quindi fare clic sulla scheda di localizzazione nell'angolo in alto a sinistra nel software confocale (Tabella dei materiali) e impostare la sezione DG desiderata al centro del campo visivo.
  3. Individuare DG, passare alla scheda di acquisizione nell'angolo in alto a sinistra e selezionare le caselle seguenti: zo-stack, tile-scane position.
  4. Impostare le impostazioni del canale tra 60,750 guadagni, 1% e 1-10 di offset. Non superare il 20% di intensità laser per nessuno dei canali. Assicurarsi che nessun pixel sia sovrasaturato quando si imposta l'innsuma e l'intensità.
    NOT: Queste gamme variano a seconda dell'efficienza delle apparecchiature utilizzate e dell'efficienza di colorazione.
  5. Impostare i riquadri su 7 orizzontali per 3 verticali nella finestra di scansione dei riquadri e premere l'immagine di panoramica della scansione utilizzando le stesse impostazioni di quelle attualmente in uso. Ad esempio, utilizzare 7 orizzontale per 3 verticale e l'obiettivo 20x con lo zoom 2x.
  6. Assicurarsi che la DG sia completamente all'interno dell'immagine prevista dopo la scansione panoramica. In caso contrario, regolare la vista della DG fino a quando non è completamente nell'immagine panoramica poiché si tratta di un'immagine rappresentativa che si otterrà.
  7. Impostare la profondità di imaging scorrendo tra diversi stack di z utilizzando la manopola di messa a fuoco fine. Assicurarsi che l'intera DG sia all'interno dei punti di inizio e fine. Supponendo una dimensione di 1 m, ogni immagine dovrebbe essere di circa 40 passi.
  8. Impostare la velocità di scansione su 9 con scansione bidirezionale e nessuna media nella finestra della modalità di acquisizione. Quindi aggiungere la posizione nella finestra di posizione.
    NOT: Ripetete i passaggi da 6,3 a 6,8 per visualizzare più dG contemporaneamente. L'aumento della velocità di scansione riduce la qualità dell'immagine ma riduce i tempi di imaging complessivi. Se la qualità dell'immagine è troppo bassa, ridurre la velocità di scansione o aumentare la media.
  9. Fare clic sul pulsante Avvia esperimento quando è pronto. Scansione di 5 sezioni di DG per mouse lungo l'asse anteriore-posteriore. Ad esempio, se la DG sinistra è immagine della sezione uno, immagine della successiva DG sinistra più posteriore per la sezione due.
  10. Stitch immagini separate insieme per formare un'immagine completa del giro dentato utilizzando la funzione punto sotto la scheda di processo nel software confocale. In alternativa, usa FIJI (ImageJ) per unire le immagini per formare un giro dentato completo.
  11. Salvare le immagini cucite per la quantificazione.

7. Analisi dell'immagine

  1. Apri ogni immagine di ogni sezione del giro dentato usando FIJI sia come proiezione massima che come immagine composita con i canali uniti in colori distinti per visualizzare facilmente la colocalizzazione.
  2. Misurare l'area di DG per ogni sezione dell'immagine di proiezione massima utilizzando lo strumento di selezione poligono (terza casella da sinistra) e registrare per ogni sezione di ogni mouse. Questa sarà l'area della DG utilizzata per calcolare la densità.
  3. Registrare il numero di cellule in DG dall'immagine composita che hanno l'anticorpo primario co-localizzazione (cioè, nestin) e la tiofina analogica Edu, utilizzando il contatore cellulare plugin FIJI trovato sotto plugin . analizzare il contatore cellulare e il contatore cellulare. Inoltre, registrare il numero totale di cellule positive Edu e nestin con un processo radiale.
    NOT: Nel caso della nestina, è molto importante prestare attenzione alla morfologia. Se si quantificano le cellule staminali neurali, assicurarsi che vengano quantificate solo le cellule con un processo radiale. Quando si quantificano le sezioni di giro dentato, applicare gli stessi criteri a tutti, specialmente quando si visualizzano le celle al di fuori di un piano focale. Se le celle non sono all'interno del piano focale, non contarle. Si prega di consultare West et al.21 per istruzioni più dettagliate sulla quantificazione stereologica.
  4. Immettere i conteggi delle celle in un software per fogli di calcolo per compilare tutti i dati per l'analisi in un secondo momento.
  5. Calcolare la densità delle cellule colocalizzate per ogni sezione dividendo il numero totale di cellule colocalizzate per il volume totale per ogni sezione in ogni animale. Ad esempio, ottenere la densità delle cellule staminali dividendo la somma delle cellule nestin /edu in un animale per la somma del volume della DG in un animale. Calcolare il volume di ogni sezione moltiplicando l'area con incrementi totali di passo z supponendo che ogni passo sia di 1 m.
    NOT: In questo protocollo, i passi totali dovrebbero essere vicini a 40, poiché il tessuto è sezionato a 40 m. Assicurarsi che ogni animale sia un punto dati poiché l'obiettivo di questo approccio è quello di stimare la quantità totale di cellule colocalizzate in un emisfero di un ippocampo.
  6. Eseguire ulteriori calcoli necessari per la domanda uno sta cercando di affrontare. In questo esempio, calcolare il numero complessivo di cellule che proliferano, la popolazione totale di cellule staminali e la percentuale di cellule staminali che proliferano dopo aver stimolato le cellule di muschio contralaterale.

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Risultati

Seguendo le procedure sperimentali descritte sopra (Figura 1A,B), siamo stati in grado di determinare gli effetti di stimolare le proiezioni delle cellule muschio contralaterali sulla nicchia neurogenica all'interno dell'ippocampo. Utilizzando un virus DREADD stimolante accoppiato con un'etichettatura 5-HT2A Cre-line di cellule muschio dipendente dalla Creci, siamo stati in grado di attivare selettivamente proiezioni eccitatori da cellule muschiate sulla DG contralaterale e ...

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Discussione

L'obiettivo di questo protocollo è quello di valutare come la manipolazione di circuiti neurali specifici regola la neurogenesi ippocampale adulta in vivo utilizzando una serie di tecniche di immunoistochimica. Affermare che la regolazione dipendente dall'attività della neurogenesi adulta mediata da specifici circuiti neurali è una tecnica preziosa con un grande potenziale di modifiche per studiare una gamma diversificata di circuiti neurali. Il successo di questi tipi di esperimenti dipende da molteplici fattori tra cui...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

L.J.Q. è stato sostenuto dal National Institute of Mental Health dei National Institutes of Health sotto il Supplemento sulla Diversità R01MH111773 e da una sovvenzione di formazione T32NS007431-20. Questo progetto è stato sostenuto da sovvenzioni concesse a J.S. da NIH (MH111773, AG058160 e NS104530).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Piastra a 24 pozzettiThermo Fisher Scientific07-200-84
Piastra a 48 pozzettiDenville ScientificT1049
5-etil-2'-deossiuridina (Edu)CarbosynthNE08701
alcool 70% IsopropylThermo Fisher Scientific64-17-5
Tamponi per la preparazione dell'alcolThermo Fisher Scientific13-680-63
Alexa-488 AzideThermo Fisher ScientificA10266
Nidi Anti-PolloAvesNES; RRID: AB_2314882
Anti-Goat DCXSanta CruzCat# SC_8066; RRID: AB_2088494
Anti-Topo TBR2Thermo Fisher Scientific14-4875-82; RRID: Soluzione di AB_11042577
Betadine (iodio povidone)amazzonico
Stock [.1M] Acido citrico (21 g/L di acido citrico)Sigma-Aldrich251275
Clozapina N-ossidoSigma-AldrichC08352-5MG
Software confocale (Zen nero)Microscopia ZeissZen 2.3 SP1 FP1 (nero)
PentaidratoThermo Fisher ScientificAC197722500
Cotton SwabsAmazon
Vetrino coprioggettiDenville ScientificM1100-02
Delicate Task Wipe KimwipesKimtech Science7557
Punta da trapano 0,5 mmFine Science Tools19007-05
Glicole etilenicoThermo Fisher ScientificE178-1
Ago Hamilton 2 polliciHmailton Company7803-05
Hamilton Siringa 5 μ L Modello 75 RNHmailtonRif. azienda: 87931
Trapano ad alta velocitàForedom1474
Pompa di infusioneHarvard Apparatus70-4511
Soluzione salina iniettabileMountainside Health CareNDC 0409-4888-20
Siringa da insulinaBD Siringhe
IsofluranoHenry Schein29405
Stereotassa per piccoli animaliKOPF InstrumentsModello 942
Leica M80Leica
Microtomo LeicaSM2010 R
LSM 780Microscopia
Nair (Prodotto per la depilazione)Nair
Paraformaldaide 4%Sigma-Aldrich
Plus Vetrino caricatoDenville ScientificM1021
Soluzione tamponata con fosfato (PBS)Thermo Fisher Scientific10010031
Puralube Vet Unguento Puralube
Rack per vetrini 20 unità didiapositive Microscopia elettronica Science70312-24
Supporto per vetriniMicroscopia elettronica Scienza70312-25
Termoforo per piccoli animaliK& H
SaccarosioSigma-AldrichS0389
Super PAP Pen Punta da 4 mmPolySciences24230
Bisturi chirurgicoMedPride47121
Soluzione tamponata Tris (TBS)Sigma-AldrichT5912
Citrato trisodico Stock [0,1 M] Citrato trisodico (29,4 g/L citrato trisodicoSigma-AldrichC8532
Triton X-100Sigma-Aldrich93443
PinzettaAmazon
Vet Bond Adesivo per tessuti3M1469SB
Acido citrico Solfato di rame (II)da insulina ultrafiniZeiss158127 )

Riferimenti

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