Mirati epigenome DNA modifica rappresenta un approccio terapeutico potente. Questo protocollo descrive la produzione, purificazione e concentrazione di vettori lentivirali all-in-one che harboring il transgene CRISPR-dCas9-DNMT3A per applicazioni di modifica epigenome in cellule staminali pluripotenti indotte umane (hiPSC)-derivato di neuroni.
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Articolo metodologico
Piattaforma di vettore lentivirale per la consegna efficiente di strumenti di editing Epigenome nelle umane indotte da modelli di malattia derivati da cellule staminali pluripotenti
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'uso di cellule derivate da hiPSC rappresenta un valido approccio per lo studio di malattie neurodegenerative umane. Qui, descriviamo un protocollo ottimizzato per la differenziazione di hiPSCs derivata da un paziente con la triplicazione del luogo del gene (SNCA) dell'alfa-synuclein nel morbo di Parkinson (PD)-popolazioni neuronali dopaminergici pertinenti. Raccogliendo la prova ha dimostrato che alti livelli di SNCA sono causativi per lo sviluppo del PD. riconoscere l'insoddisfatte necessario stabilire nuovi approcci terapeutici per PD, specialmente quelli targeting per la regolazione dell'espressione di SNCA , abbiamo recentemente ha sviluppato un sistema CRISPR/dCas9-DNA-metilazione-based per epigeneticamente modulano la trascrizione di SNCA arricchendo i livelli di metilazione presso la regione regolatrice di SNCA introne 1. A consegnare il sistema, costituito da un morto (disattivato) versione di Cas9 (dCas9) fuso con il dominio catalitico del 3A enzima DNA metiltransferasi (DNMT3A), viene utilizzato un vettore lentivirale. Questo sistema viene applicato alle celle con la triplicazione del locus SNCA e riduce la SNCA-mRNA e livelli della proteina di circa il 30% attraverso la metilazione del DNA mirato di SNCA introne 1. Il fine-tuned downregulation dei livelli SNCA Salva fenotipi cellulari correlati alla malattia. Il protocollo attuale, ci proponiamo di descrivere una procedura dettagliata per la differenziazione hiPSCs nella cellule progenitrici neurali (NPC) l'istituzione e la convalida di pyrosequencing saggi per la valutazione del profilo di metilazione in SNCA introne 1. Per strutturare in modo più dettagliato il sistema di lentivirus-CRISPR/dCas9 utilizzato in questi esperimenti, questo protocollo descrive come produrre, purificare e concentrare vettori lentivirali e per evidenziare la loro idoneità per applicazioni epigenome - e -editing genomico utilizzando hiPSCs e NPC. Il protocollo è facilmente adattabile e può essere usato per produrre lentivirus di alto titolo per applicazioni in vitro e in vivo.
Introduzione
Più piattaforme di editing-epigenome sono stati recentemente sviluppati per indirizzare eventuali sequenze di DNA nelle regioni che controllano l'espressione genica1,2. Gli strumenti di editing epigenome creati sono progettati per (i) regolare la trascrizione, (ii) modificare le modifiche post-traduzionali degli istoni, (iii) modificare la metilazione del DNA e (iv) modulano interazioni elemento regolatore. L'approccio di ancorare i modificatori di trascrizione/cromatina a un Cas9 (morto) disattivato (dCas9) generato da precedentemente sviluppati piattaforme epigenome di editing, come lo zinco dito proteine (Z....
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Protocollo
1. sistema progettazione e produzione di Virus
- Costruzione e progettazione di plasmide
Nota: La costruzione di un vettore di LV-gRNA-dCas9-DNMT3A all-in-one viene eseguita utilizzando una produzione- e cassetta di espressione espressione-ottimizzata pubblicato da Ortinski et al.30. La cassetta di vettore trasporta una ripetizione del sito riconoscimento del fattore di trascrizione Sp1 e un'omissione di state-of-the-art all'interno il non tradotte (U3') regione di un terminale 3'-lungo Ripeti (LTR) (Figura 2A)30,36
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Risultati
Convalida dei titoli di produzione dei vettori LV-dCas9-DNMT3A-GFP/Puro rispetto alla controparte GFP ingenuo
Abbiamo effettuato p24gag ELISA da confrontare tra titoli fisici di LV-dCas9-DNMT3A-GFP/Puro con le controparti GFP/Puro ingenuo. Risultati rappresentativi, presentati in Figura 5A, dimostrano che rese fisiche dei vettori, generati utilizzando il protocollo descri.......
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Discussione
LVs hanno cominciato ad emergere come il veicolo della scelta per l'editing di epigenoma, soprattutto nel contesto delle malattie genetiche, principalmente dovuto la loro capacità di (i) di ospitare grandi carichi utili di DNA e (ii) trasducono efficientemente una vasta gamma di divisione e cellule nondividing. L'efficacia di grande imballaggio del LVs è particolarmente utile per le applicazioni che coinvolgono imballaggio dei sistemi CRISPR/dCas9 che sono di grandi dimensioni. Da questa prospettiva, LVs rappresentano la.......
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Dichiarazioni
Duke University depositato una domanda di brevetto provvisorio relazionata a questo studio.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato finanziato in parte dal Kahn neurotecnologie Development Award (di O.C.) e istituti di salute nazionale Istituto nazionale dei disordini neurologici e colpo (NINDS/NIH) (R01 NS085011 di O.C.).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Equipment | |||
| Optima XPN-80 Ultracentrifuga | Beckman Coulter | A99839 | |
| 0.22 μ Unità filtro M, 1 L | Corning 430513 | ||
| 0,45-μ m unità filtrante, 500 mL | Corning | 430773 | |
| 100 mm Piastra di coltura trattata | TC Corning | 430167 | |
| 15 mL provette da centrifuga coniche | Corning | 430791 | |
| 150 mm Piastre per colture cellulari trattate TC da 150 mm con griglia da 20 mm | Corning | 353025 | |
| 50 mL provette da centrifuga coniche | Corning | 430291 | |
| piastre | a 6 pozzettiCorning | 3516 | |
| Aggrewell 800 | StemCell Technologies | 34811 | |
| Allegra 25R centrifuga da tavolo | Beckman Coulter | 369434 | |
| BD FACS | Becton Dickinson | 338960 | |
| Provette per ultracentrifugazione a fondo conico | Seton Scientific | 5067 | |
| Adattatori per provette coniche | Seton Scientific | PN 4230 | |
| Eppendorf Cell Imaging Slides | Eppendorf | 30742060 | |
| Piastre a 96 pozzetti ad alto legame | Corning | 3366 | |
| Microscopio a fluorescenza invertita | Leica | DM IRB2 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit (50) | Qiagen | 27104 | |
| Filtro reversibile | StemCell Technologies | 27215 | |
| Rotore SW32Ti | Beckman Coulter | 369650 | |
| VWR® Pipette sierologiche monouso, vetro, apirogene | VWR | 93000-694 | |
| VWR® Sistemi di filtrazione sottovuoto | VWR | 89220-694 | |
| xMark™ Lettore di piastre ad assorbanza per micropiastre | Bio-Rad | 1681150 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagenti per colture cellulari | |||
| Cellule 293T (HEK 293T) del rene embrionale umano | ATCC | CRL-3216 | |
| Accutase | StemCell Technologies | 7920 | |
| Soluzione di risciacquo antiaderente | StemCell Technologies | 7010 | |
| Anticorpo anti-FOXA2 | Abcam | Ab60721 | |
| Anticorpo anti-nestina | Abcam | Ab18102 | |
| Soluzione antibiotico-antimicotica, 100x | Sigma Aldrich | A5955-100ML | |
| Integratore di B-27 (50x), meno vitamina A | Thermo Fisher Scientific | 12587010 | |
| BES | Sigma Aldrich | B9879 - BES | |
| Frazione V di albumina bovina (soluzione al 7,5%) | Thermo Fisher Scientific | 15260037 | |
| CHIR99021 | StemCell Technologies | 72052 | |
| Corning Matrigel hESC Qualified | Matrix Corning | 08-774-552 | |
| Siero cosmico per vitelli | Hyclone | SH30087.04 | |
| DMEM-F12 | Lonza | 12-719 | |
| DMEM, terreni ad alto contenuto di glucosio | Gibco | 11965 | |
| DNeasy Blood & Kit di tessuti | Qiagen | 69504 | |
| Set di DNA per il controllo della PCR EpiTect | Qiagen | 596945 | |
| EZ | Zymo Research | D5001 | |
| Gelatina | Sigma Aldrich | G1800-100G | |
| Gentamicina | Thermo Fisher Scientific | 15750078 | |
| Reagente per dissociazione cellulare delicato | Tecnologie delle cellule staminali | 7174 | |
| GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| Tecnologie delle cellule staminali | umane ricombinanti bFGF | 78003 | |
| Ricombinante umano EGF | StemCell Technologies | 78006 | |
| Shh ricombinante umano (C24II) | StemCell Technologies | 78065 | |
| MEM Soluzione di aminoacidi non essenziali (100x) | Thermo Fisher Scientific | 11140050 | |
| mTeSR1 | StemCell Technologies | 85850 | |
| Integratore N-2 (100x) | Thermo Fisher Scientific | 17502001 | |
| Mezzo neurobasale | Thermo Fisher Scientific | 21103049 | |
| Aminoacido non essenziale (NEAA) | Hyclone | SH30087.04 | |
| PyroMark PCR Kit | Qiagen | 978703 | |
| RPMI 1640 media | Thermo Fisher Scientific | 11875-085 | |
| SB431542 | StemCell Technologies | 72232 | |
| Piruvato | di sodioSigma Aldrich | S8636-100ML | |
| STEMdiff Mezzo di induzione neurale | StemCell Technologies | 5835 | |
| STEMdiff Progenitore neurale Congelamento del mezzo | StemCell Technologies | 5838 | |
| Saggio TaqMan FOXA2 | Thermo Fisher Scientific | Hs00232764 | |
| Saggio TaqMan GAPDH | Thermo Fisher Scientific | Hs99999905 | |
| Saggio TaqMan Nestina | Thermo Fisher Scientific | Hs04187831 | |
| TaqMan Assay OCT4 | Thermo Fisher Scientific | Hs04260367 | |
| TaqMan Assay PPIA | Thermo Fisher Scientific | Hs99999904 | |
| Tripsina-EDTA 0,05% | Gibco | 25300054 | |
| Y27632 | StemCell Technologies | 72302 | |
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Comments |
| p24 Reagenti ELISA | |||
| Anticorpo monoclonale anti-p24 | Programma di ricerca e reagenti di riferimento NIH AIDS | 3537 | |
| Perossidasi di rafano anti-coniglio di capra IgG | Sigma Aldrich | 12-348 | Concentrazione di lavoro 1:1500 |
| Siero di capra, sterile, 10 mL | Sigma | G9023 | Concentrazione di lavoro 1:1000 |
| Standard HIV-1 | Programma di ricerca e reagenti di riferimento NIH AIDS | SP968F | |
| Siero di topo normale, sterile, 500 mL | Equitech-Bio | SM30-0500 | |
| Anticorpo policlonale di coniglio anti-p24 | Programma di ricerca e reagenti di riferimento NIH AIDS | SP451T | |
| Substrato della perossidasi TMB | KPL | 5120-0076 | Concentrazione di lavoro 1:10.000 |
| Nome | Azienda | Catalog Number | Comments |
| Plasmidi | |||
| pMD2.G | Addgene | 12253 | |
| pRSV-Rev | Addgene | 52961 | |
| psPAX2 | Addgene | 12259 | |
| Name | Company | Numero di catalogo | Comments |
| Enzimi di restrizione | |||
| BsmBI | New England Biolabs | R0580S | |
| BsrGI | New England Biolabs | R0575S | |
| EcoRV | New England Biolabs | R0195S | |
| KpnI | New England Biolabs | R0142S | |
| PacI | New England Biolabs | R0547S | |
| SphI | New England Biolabs | R0182S |
Riferimenti
- Hsu, P. D., Lander, E. S., Zhang, F. Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering. Cell. 157 (6), 1262-1278 (2014).
- Gaj, T., Gersbach, C. A., Barbas, C. F. 3rd ZFN, TALEN, and CRISPR/Cas-based methods for genome engineering. Trends in Biotechnology<....
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Ristampe e permessi
