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Articolo metodologico

Nuoto paralisi indotta a valutare dopamina segnalazione in Caenorhabditis elegans

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⸱

DOI:

10.3791/59243

⸱

3 aprile 2019

 ,  , 
1Harriet Wilkes Honors College, Florida Atlantic University, John D MacArthur Campus, 2Integrative Biology and Neuroscience program, College of Science, Florida Atlantic University, 3Brain Institute, Florida Atlantic University, 4Department of Biomedical Science, Charles E. Schmidt College of Medicine, Florida Atlantic University

In questo articolo

Sommario

Nuoto indotta paralisi (SWIP) è un'analisi comportamentale consolidata utilizzata per studiare i meccanismi di fondo di dopamina segnalazione in Caenorhabditis elegans (c. elegans). Tuttavia, manca un metodo dettagliato per eseguire il test. Qui, descriviamo un protocollo dettagliato per SWIP.

Abstract

Il saggio di nuoto descritto in questo protocollo è un valido strumento per identificare le proteine che regolano il dopaminergico sinapsi. Simili ai mammiferi, dopamina (DA) controlla diverse funzioni in c. elegans , tra cui attività di apprendimento e motore. Condizioni che stimolano il rilascio di DA (per esempio, trattamenti di anfetamina (AMPH)) o che impediscono DA liquidazione (ad es., gli animali manca il trasportatore DA (dat-1) che sono in grado di reaccumulating DA nei neuroni) generare un eccesso di extracellulare DA che si traduce nella locomozione inibito. Questo comportamento è particolarmente evidente quando animali nuotare in acqua. Infatti, mentre animali di selvaggio-tipo continuano a nuotare per un periodo prolungato, dat-1 mutanti e wild-type trattati con AMPH o inibitori del trasportatore DA depositano sul fondo del pozzo e non si muovono. Questo comportamento viene definito "Nuoto indotta paralisi" (SWIP). Anche se il dosaggio SWIP è ben consolidato, una descrizione dettagliata del metodo è carente. Qui, descriviamo una guida dettagliata per eseguire SWIP. Per eseguire il test, tardi larvali fase-4 animali sono posti in una lastra di vetro posto contenente soluzione di saccarosio di controllo con o senza AMPH. Gli animali sono notati per il loro comportamento di nuoto o manualmente da visualizzazione sotto uno stereoscopio o automaticamente registrando con una telecamera montata sullo stereoscopio. Video vengono poi analizzati utilizzando un software di monitoraggio, che produce una rappresentazione visiva di frequenza thrashing e paralisi sotto forma di mappe di calore. Entrambi i sistemi manuali e automatizzati garantiscono una lettura facilmente quantificabile di abilità nel nuoto degli animali e quindi facilitano lo screening per gli animali recanti mutazioni all'interno del sistema dopaminergico o per geni ausiliari. Inoltre, SWIP utilizzabile per delucidare il meccanismo d'azione dei farmaci di abuso come AMPH.

Introduzione

Animali eseguono una serie di comportamenti innati e complessi che sono mediati da diversi neurotrasmettitori coordinati da intricati processi di segnalazione. Il neurotrasmettitore dopamina (DA) media comportamenti altamente conservati tra le specie, compreso l'apprendimento, la funzione di motore ed elaborazione di ricompensa.

C. elegans, il nematode del terreno con un sistema nervoso relativamente semplice e ben mappato consistente solo 302 neuroni, Mostra comportamenti marcatamente complessi, compreso molti che sono disciplinati DA come accoppiamento, apprendimento, foraggiamento, locomozione e deposizione delle uova 1. tra le altre caratteristiche, ciclo di vita breve, facilità di manipolazione e la conservazione delle molecole di segnalazione, evidenziare i vantaggi dell'utilizzo di c. elegans come modello per studiare le basi neurali dei comportamenti conservati.

L'Ermafrodito di c. elegans contiene otto neuroni dopaminergici; Oltre a questi, il maschio contiene sei paia supplementare per scopi di accoppiamento. Come nei mammiferi, questi neuroni sintetizzano DA ed esprimere il trasportatore DA (DAT-1), una proteina di membrana presenti esclusivamente nei neuroni dopaminergici, che trasporta DA rimessi nella fessura sinaptica in neuroni dopaminergici. Inoltre, la maggior parte delle proteine coinvolte in ogni fase di sintesi e rilascio di DA imballaggi sono altamente conservata tra vermi e gli esseri umani e, come nei mammiferi, DA modula alimentazione comportamenti e locomozione in c. elegans2.

C. elegans per indicizzazione su superfici solide e nuota con un comportamento caratteristico thrashing in acqua. È interessante notare che, mutanti privi di espressione di DAT-1 (dat-1) scansione normalmente su superficie solida ma non riescono a sostenere nuoto quando immerso in acqua. Questo comportamento è stato definito nuoto indotta paralisi o SWIP. Precedenti esperimenti hanno dimostrato che SWIP, in parte, è causata da un eccesso di DA nella fessura sinaptica che in ultima analisi overstimulates i recettori postsinaptici D2-like (DOP-3). Anche se originariamente identificato nel dat-1 knockout animali3, SWIP è osservato anche in animali trattati con farmaci che bloccano l'attività del DAT (ad es., imipramina4) e/o indurre il rilascio di DA (ad esempio, anfetamina5). D'altra parte, manipolazioni farmacologiche o genetiche evitanti la sintesi ed il rilascio di DA e blocco della funzione del recettore DOP-3 prevenire SWIP6. Presi insieme, questi dati già pubblicati hanno stabilito SWIP come uno strumento affidabile per studiare gli effetti del comportamento causati da proteine mutate entro dopaminergici sinapsi3,4,7 e possono essere impiegati per avanti schermi genetici per l'identificazione dei nuovi meccanismi normativi nei DA segnalazione7,8,9,10,11,12. Inoltre, fornendo una lettura facilmente quantificabile di comportamento farmaco-indotta in animali viventi, SWIP consente la delucidazione dei meccanismi di azione delle droghe come anfetamina (AMPH) e azaperone presso dopaminergiche sinapsi5, 6 , 13 , 14 , 15.

Protocolli per eseguire i dosaggi SWIP sono state descritte prima16. Qui, descriviamo dettagliatamente la metodologia e il programma di installazione per eseguire l'analisi con l'obiettivo di fornire una guida visiva per la comunità di c. elegans svolgere efficacemente SWIP.

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Protocollo

1. preparazione delle soluzioni e dei Media

  1. Preparare il tampone di M9 sciogliendo KH2PO4 3,0 g (22,05 mM), Na2HPO4 6,0 g (42,2 mM) e NaCl 5.0 g (85,5 mM) in 1 L di acqua deionizzata in autoclave. Aggiungere 1,0 mL di 1 M MgSO4 (12 g in un volume finale di 100 mL di acqua deionizzata in autoclave) dopo la sterilizzazione in autoclave. Mix 100 mL di 10 x risultante M9 con 900 mL di sterilizzato nell'autoclave acqua deionizzata per rendere una soluzione 1x.
  2. Per rendere il buffer di uovo, sciogliere 6,896 g di NaCl (118 mM), 3,578 g di KCl (48 mM), 0,294 g di CaCl2-2 H2O (2 mM), 0,406 g di MgCl2-6 H2O (2 mM) e 5,958 g (25 mM) di HEPES in 1 L di acqua deionizzata in autoclave. Regolare il pH a 7.3 utilizzo NaOH.
  3. Preparare la soluzione di ipoclorito di sodio/NaOH fresco aggiungendo 1 mL di 5-6% di ipoclorito di sodio (candeggina) e 180 µ l di NaOH 10 N a 3,8 mL di acqua deionizzata.
  4. Pesare 60 g di saccarosio e sciogliere in acqua deionizzata in autoclave ad un volume finale di 100 mL per rendere la soluzione di saccarosio al 60%.
  5. Sciogliere 0,684 g di saccarosio in 10 mL di acqua deionizzata in autoclave per rendere saccarosio 200 mM. Controllare e regolare alla stessa un'osmolarità utilizzando Osmometro. Rendere le aliquote di 1 mL a 1,5 mL microcentrifuga e congelare a-20 ° C.
  6. Pesare 0,184 g di AMPH (peso molecolare 184.75 g/mol) e sciogliere in 10 mL di acqua deionizzata per rendere una soluzione stock di 100 mM. Mescolare 2 µ l di soluzione madre in 400 µ l di acqua per fare la soluzione di lavoro di 0,5 mM.
  7. Preparare nutrienti crescita piastre media (NGM)
    1. Mix 3 g di NaCl (52,65 mM), 20 g di peptone, 25 g di bacto-agar e 975 mL di acqua deionizzata in un matraccio di Erlenmeyer 2L. Includono un ancoretta magnetica ed autoclave (121 ° C, 15 PSI) per 1 ora con ciclo liquido.
    2. Raffreddare e mantenere la temperatura a circa 50 ° C posizionando il pallone su un radiatore continuando a mescolare. Aggiungere 0,5 mL di colesterolo (5 mg/mL in etanolo), 1 mL di 1 M MgSO4, 1 mL di 1 M CaCl2 e 25 mL di tampone di 1m potassio fosfato, pH 7,4 (108,3 g di KH2PO4, 35,6 g di K2HPO4 acqua deionizzata a 1 L).
    3. Pipettare 25 mL ciascuno in piastre di Petri di 100 x 15 mm e lasciare che i supporti a solidificare. Conservare le piastre capovolte a 4 ° C in una scatola per fino a 4 settimane.
  8. Preparazione del brodo di brodo (LB) di Lisogenesi
    1. Sciogliere 5 g di miscela della polvere LB in 200 mL di acqua deionizzata in un matraccio di Erlenmeyer. Ciclo di autoclave per 30 minuti utilizzando la sterilizzazione di liquida. Consentire il brodo si raffreddi. Conservare a temperatura ambiente per 1-2 settimane.
  9. Preparazione delle piastre batteriche NA22
    1. Utilizzare una pipetta sterile o un'ansa sterile batterica per inoculare una piastra LB con un piccolo volume di NA22 Escherichia coli batteri da Stock in glicerolo ed incubare la piastra capovolta in un incubatore a 37 ° C durante la notte per far crescere colonie isolate. Scegliere e introdurre una singola Colonia in 200 mL di brodo LB preparata al punto 1.8 e far crescere una notte a 37 ° C su una piattaforma d'agitazione.
    2. Per le piastre del seme, dispensare 200 µ l di coltura batterica sulle piastre NGM preparata in precedenza al punto 1.7 e si sviluppa con un bastone da hockey vetro sterile. Lasciate le piastre asciugare durante la notte o più a lungo sotto un cofano e conservare capovolta in una scatola ermetica a 4 ° C.
  10. Per rendere lo strumento ciglia/platino per prendere i vermi, colla una ciglia spesse o un filamento di platino in un bicchiere da Pasteur pipetta utilizzando colla super. Tagliare la punta del ciglio ad un angolo utilizzando una lama di rasoio. In alternativa, un bruciatore di Bunsen può essere utilizzato per fondere la punta della pipetta di vetro intorno il filamento di platino.

2. allevamento di c. elegans

Nota: Cultura di tipo selvatico N2C. elegans ceppo su Escherichia coli NA22 piastre. I metodi di cultura dettagliate sono descritti di seguito.

  1. Preparazione della cultura di vite senza fine
    1. Per rendere una coltura starter di vermi, tagliare un piccolo pezzo di agar da una piastra contenente animali ben nutriti e trasferirlo su un piatto di batteri NA22 Escherichia coli preparato al punto 1.9 usando una spatola sterile. Incubare le piastre a 20 ° C per 3-4 giorni. Microscopio stereo, confermare visivamente la presenza di adulti gravid.
  2. Preparazione della popolazione sincronizzata di vermi
    1. Raccogliere gravid adulti da almeno 2 piatti di erogazione dell'acqua deionizzata in autoclave tutto intorno la piastra utilizzando una spruzzetta. Agitare delicatamente la piastra per sloggiare i vermi e raccogliere i vermi in un tubo conico in polistirolo di 15 mL utilizzando una pipetta di plastica monouso.
    2. Rotazione verso il basso il tubo in una centrifuga a 140 x g per 2 minuti per pellet i vermi, poi aspirare il surnatante mediante una pompa a vuoto o con costruito nel vuoto di laboratorio.
    3. Risospendere e lavare i vermi da riempire il tubo con acqua deionizzata in autoclave e mix e centrifugare a 140 x g per 2 min. aspirare il supernatante e ripetere questo ultimo passo due volte o fino a quando i vermi sono chiare da batteri (acqua appare chiaro quando sono mescolati con i vermi).
    4. Aggiungere 5 mL di soluzione di ipoclorito di sodio preparata/NaOH (punto 1.3) al pellet di vite senza fine e mescolare rapidamente con un vortex. Incubare la provetta su un rocker per circa 4-8 min. Il tempo di incubazione con soluzione di ipoclorito di sodio/NaOH oscilla tra 4-8 minuti sulla base della qualità della soluzione stock di ipoclorito di sodio (candeggina).
    5. Mettere una goccia (2-50 µ l) di soluzione contenente vermi su un vetrino per microscopio e controllare ogni 2 min sotto il microscopio per lisi di verme. Quando circa il 70% dei vermi vengono lisate e uova vengono rilasciate, riempire il tubo con il tampone di uovo preparato al punto 1.2 e immediatamente Centrifugare per 1 min a 140 x g a pellet gli embrioni e le carcasse a vite senza fine.
    6. Aspirare il supernatante e lavare il pellet 3 più volte, il tubo di riempimento ogni volta con buffer di uovo. Si sono fermati a 140 x g per 1 min e rimuovere il supernatante ogni volta. Il pellet diventa bianco all'estremità di lavaggi.
    7. Dopo il lavaggio finale, è necessario separare gli embrioni dalle carcasse morte nella soluzione di saccarosio al 30%. Aggiungere 5 mL di acqua deionizzata in autoclave per il pellet, risospendere e aggiungere 5 mL di saccarosio al 60% preparata al punto 1.4. Mescolare accuratamente e centrifugare a 160 x g per 6 min.
    8. Utilizzare un pipetta Pasteur di vetro per trasferire gli embrioni fluttuante al menisco superiore in una provetta conica fresco 15ml. Non prendere più di 3-4 mL. Per rimuovere qualsiasi residuo saccarosio, lavare gli embrioni 3 volte con acqua in autoclave mediante centrifugazione a 140 x g per 3 min, rimuovere il supernatante e risospendere il pellet (e il tubo di riempimento) ogni volta.
    9. Ripetere i lavaggi con 1 tampone di x M9. Dopo il lavaggio finale, risospendere il pellet in 10 mL di M9. Lasciare le provette in un agitatore durante la notte (non più di 14 h) per le uova si schiudono in larve L1. Vermi rimarrà in fase larvale L1 dovuta alla mancanza di cibo.
    10. Larve di lavare il L1 3 volte con acqua in autoclave per rimuovere qualsiasi feromoni rilasciati dalle larve mediante centrifugazione a 140 x g per 2 min. Risospendere le larve in 1 mL di acqua. Rendere un 01:10 diluizione dei vermi in acqua, pipetta una goccia di 10 µ l su un vetrino, mettere un vetrino coprioggetto e contare il numero di vermi sotto uno stereoscopio. Ripetere l'operazione due volte e la media dei risultati ottenuti.
    11. Pipetta il volume di vermi che corrisponde a circa 1.000 vermi su un piatto di NA22 (che era precedentemente portato a temperatura ambiente) inserendo piccole gocce sul piatto. Lasciare la piastra semi-aperte fino a quando la goccia si asciuga. Quindi coprire la piastra e incubare a testa in giù in incubatrice di 20 ° C per circa 44-48 h o fino a raggiungono i vermi fase ritardata di L4, come confermato visivamente sotto un microscopio stereoscopico. Ora i vermi sono pronti per essere testati per SWIP.

3. SWIP

Nota: Descriviamo il metodo manuale di valutazione SWIP nel selvaggio-tipo vermi trattati con AMPH. Inoltre brevemente discutiamo il tracciamento delle viti senza fine e un'ulteriore analisi della cinetica di verme utilizzando un tracker di verme automatizzato e un software di monitoraggio che precedentemente sono stati descritti da Hardaway et al.10.

  1. Metodo manuale per testare per SWIP
    1. Aliquotare e 40 µ l di soluzione di saccarosio mOsm/L 200 con o senza 0,5 mM AMPH in una lastra di vetro posto. Sotto lo stereoscopio, pick fase tardo-L4 8-10 viti senza fine con un ciglio o platino pick e immergere lo scegliere la piastra che contiene la soluzione fino a quando il worm fa spostare il pick e nuotare nella soluzione. Prendere nota del numero di vermi scelto nel pozzo, avviare il timer, osservare e registrare il numero di vermi che esibiscono SWIP presso ogni minuto mark.
    2. Copiare i dati grezzi in un foglio di calcolo e calcolare la percentuale di vermi paralizzati dividendo il numero di vermi paralizzato ogni minuto per numero totale di vermi testato durante tutto il test e moltiplicare per 100. Copiare i valori percentuali in qualsiasi grafica e trama e software statistico i dati con i valori di percentuale sull'asse Y e l'ora utilizzando il grafico XY asse X formato.
    3. Eseguire ANOVA a due vie, seguita da analisi post-hoc (per esempio, Bonferroni post-test) per verificare la significatività statistica tra controllo, gruppi AMPH e tempi di trattamento.
  2. Analisi automatizzata di SWIP
    1. Eseguire l'analisi automatica su una vite senza fine in un momento. Il protocollo per impostare su fotocamera, il verme Tracking software e script per eseguire il software di monitoraggio analisi sono descritti in dettaglio in Hardaway et al.16.
    2. Brevemente, inserire un singolo ermafrodita di fase tardo L4 in una lastra di vetro posto utilizzando un prelievo di ciglia, come descritto nel metodo manuale nella sezione 3.1.2. Registrare video di nuoto di un verme al momento e utilizzare il software di tracking di verme per calcolare la frequenza delle curve del corpo.
    3. Seguire lo script fornito con il software di monitoraggio per ottenere verme thrashing frequenza e per generare mappe di calore dai dati thrashing verme.

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Risultati

Presentiamo un esempio di analisi SWIP indotta dal trattamento di AMPH. La figura 1 Mostra una rappresentazione schematica dell'apparato di test come descritto sopra. Per il saggio manuale, circa 8-10 anni, sincronizzato tardo L4 fase vermi vengono raccolti con una ciglia o platino pick e inseriti in una lastra di vetro posto riempito con 40 µ l di 200 mOsm/L saccarosio (soluzione di controllo) o saccarosio con 0,5 mM AMPH e testato per SWIP.

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Discussione

Qui, descriviamo un protocollo dettagliato per eseguire un'analisi comportamentale, SWIP, c.elegans. Questo protocollo è semplice e lineare con nessun principali ostacoli tecnici, rendendo questo test molto facile da usare. Tuttavia, ci sono alcuni aspetti critici che devono essere considerati al fine di svolgere efficacemente il dosaggio.

Prestare la massima attenzione per garantire che i vermi utilizzati per il dosaggio sono ben nutriti, dal momento che la restrizione dietetica colp...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Ringraziamenti

Gli autori vorrei ringraziare il dottor Osama Refai dal laboratorio del Dr. Randy Blakely per guida con l'analisi automatizzata di SWIP. Quest'opera è stata sostenuta da finanziamenti da NIH R01 DA042156 LC.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Fogliodi alluminio Reynolds wrap1091835
AnfetaminaSigma51-63-8   
Incubatore batterico per autoclave
New Brunswick scientificM1352-0000
Grado batteriologico, AgarLab Scientific, Inc  A466
Bacto (TM) PeptoneBDREF 211677
Cloruro di calcio (diidrato)Sigma-AldrichC3881
Fotocamera Centrifuga ThorlabsU-CMAD3
Eppendorf 5810R 15ampE215059
ColesteroloSigma-Aldrich57-88-5
Acqua deionizzataMilliporeZ00QSV0WWMilli-Q
Piastra spot in vetro a depressioneCorningCorning, Inc. 722085
Erlenmeyer palloneThermoFisher4103-0250PK
Ciglia
Vetrino Fisherbrand12-550-15
Software grafico e statisticoPrismGraphpad 5
HEPESSigma-AldrichRB=H3375 & H7006
IpocloritoHawkinsIpoclorito di sodio 4-6%, USP" 1 gal
LB Brodo, MillerFisherBP1426
Cloruro di magnesio (esaidrato)Sigma-AldrichRB=M0250500 g
Solfato di magnesio (eptaidrato)Sigma-AldrichM1880
Agitatore magneticoFisherbrand16-800-510 
Provette per microcentrifugaThermoFisher69715
NA 22 batteriCGC
NistatinaSigma1400-61-9
OsmometroAdvanced Instruments, IncModello 3320
Pipette PasteurFisherbrand13-678-20A
Piastre di PetriplatesFalcon351007
Misuratore di pHOrion VersaStar ProIS-68X591202-B 0514
Provette coniche in polistrinaFalcon352095
Cloruro di potassioSigma-Aldrich P9541
Diidrogeno fosfato di potassioSigma-Aldrich7778-77-0
Potassio fosfato - DIBASICOSigma-AldrichP-8281
Potassio fosfato - MONOBASICOSigma-AldrichP0662
Pipette sierologicheVWR10ml=89130-898
Shaker Reliable Scientific55S 12x16
Cloruro di sodioFisherRB=BP358-1
Sodio diidrogeno fosfatoFisherRB=S381
Foglio di calcoloMS officeMicrosoft Excel
StereomicroscopioZeissModello tlb3. 1 stemi2000
Sterili Puntali per pipetteVari02-707-400
SaccarosioSigma-AldrichRB = S5016
SupercollaLoctite1647358 .14 oz.
SwimR software10.18129/B9.bioc.SwimR
Tracker 2Worm Tracker 2.0www.mrc-lmb.cam.ac.uk/wormtracker/
Software di registrazione videoVirtualdubhttp://www.virtualdub.org/

Riferimenti

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