Articolo metodologico

Visualizzazione di danno delle barriere endoteliali e gliali dell'unità neurovascolare durante l'encefalomielite Autoimmune Sperimentale In Vivo

DOI:

10.3791/59249

⸱

26 marzo 2019

 , 
1Theodor Kocher Institute, University of Bern

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Qui, presentiamo protocolli per studiare danno dell'unità neurovascolare durante l'encefalomielite autoimmune sperimentale in vivo. Ci rivolgiamo in particolare come determinare la permeabilità della barriera emato - encefalica e attività della gelatinasi coinvolti nella migrazione dei leucociti attraverso la limitans glia.

Abstract

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L'unità neurovascolare (NVU) è composto da cellule endoteliali microvascolari formando l'emato - encefalica (BBB), una membrana basale endoteliale con periciti incorporati, e la limitans glia composto da membrana dello scantinato parenchimatica e astrocitari alimentazione di testata che abbracciano l'aspetto abluminale di microvasi del sistema nervoso centrale (SNC). Oltre a mantenere CNS omeostasi il NVU controlla delle cellule immuni traffico nello SNC. Durante immunosorveglianza dello SNC basso numero di linfociti attivati può attraversare la barriera endoteliale senza causare BBB disfunzione o malattia clinica. Al contrario, durante la neuroinfiammazione come nella sclerosi multipla o il modello animale encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE) un gran numero di cellule del sistema immunitario può attraversare la BBB e, successivamente, la glia limitans raggiungendo alla fine il parenchima di CNS che conducono alla malattia clinica. Migrazione delle cellule immuni nel parenchima CNS è dunque un processo in due fasi che comporta una migrazione sequenza attraverso la barriera endoteliale e gliale di NVU che impiegano meccanismi molecolari distinti. Se dopo il loro passaggio attraverso la barriera endoteliale, cellule T incontrano loro antigene cognate su cellule presentanti l'antigene perivascolare loro riattivazione locale avvierà successivi meccanismi che portano all'attivazione focale della gelatinasi, che consentirà le cellule di T di attraversare la barriera glial e immettere il parenchima di CNS. Così, valutazione, permeabilità BBB e attività MMP in correlazione spaziale per accumulo di cellule immuni nel SNC durante EAE permette di specificare perdita di integrità delle barriere endoteliali e gliali la nvu. Mostriamo qui come indurre EAE in topi C57BL/6 di immunizzazione attiva e come analizzare successivamente permeabilità BBB in vivo usando una combinazione di traccianti fluorescenti esogeni. Più ulteriormente indichiamo, come visualizzare e localizzare attività della gelatinasi nei cervelli EAE in situ zymogaphy accoppiato al immunofluorescente stainings di membrane dello scantinato BBB e CD45 + cellule immunitarie invasori.

Introduzione

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Il sistema nervoso centrale (SNC) coordina tutto il corpo e funzioni mentali nei vertebrati, e l'omeostasi del CNS è essenziale per una corretta comunicazione dei neuroni. Omeostasi del CNS è garantito dall'unità neurovascolare (NVU), che protegge il sistema nervoso centrale da milieu cambiamento del flusso sanguigno. Il NVU è composto di cellule endoteliali microvascolari CNS, che sono biochimicamente unici e stabilire l'emato - encefalica (BBB) continuo crosstalk con periciti, astrociti, neuroni e componenti della matrice extracellulare (ECM), che istituisce due distinta delle membrane dello scantinato1. La membrana basale endoteliale che ensheathes l'aspetto abluminale delle cellule endothelial BBB ospita un elevato numero di periciti e si compone di laminina α4 e laminin α5, oltre ad altre proteine ECM2. Al contrario, la membrana basale parenchimatica consiste di laminina α1 e α2 laminina ed è abbracciata dai puntali astrocytic. La membrana basale parenchimatica insieme con i puntali Astrocita compone il limitans glia che segrega la rete neuronale CNS dal liquido cerebrospinale riempito perivascolare o spazi subaracnoidei3. Dovuto l'architettura unica del NVU, delle cellule immuni traffico nello SNC sono distinta da che nei tessuti periferici come richiede un processo in due fasi con le cellule immunitarie, violazione prima endothelial BBB e successivamente il limitans glia al fine di raggiungere il parenchima di CNS.

Sclerosi multipla (SM) è una malattia comune neuroinfiammatorie dello SNC, in cui un gran numero di cellule immuni circolanti immettere il CNS e causare neuroinfiammazione, demielinizzazione e perdita focale di BBB integrità4. Perdita di integrità BBB è un precoce segno distintivo della MS, come indicato dalla presenza di contrasto gadolinio aumentando le lesioni del SNC come visualizzati da formazione immagine a risonanza magnetica (MRI)5. Diapedesi nello SNC avviene a livello delle venule post-capillari; Tuttavia, i meccanismi precisi coinvolti nel processo di diapedesi delle cellule immuni attraverso la membrana dello scantinato BBB e successivamente la barriera glial rimangono per essere esplorato. Encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE) serve come modello animale per MS e ha contribuito in modo significativo alla nostra attuale conoscenza sulla patogenesi della SM. Per esempio, utilizzando il modello di EAE è stato scoperto che lo stravaso del leucocita si verifica in un processo a più fasi, tra cui un'acquisizione iniziale e rotolamento passaggio mediato da selectine e mucina-come molecole come ligando di glicoproteina P-selectina (PSGL) -1, seguita da arresto ferma integrina-dipendente e scansione di cellule T su cellule endoteliali BBB ai lati permissivi per diapedesi6.

Una volta che le cellule di T hanno attraversato il BBB endoteliale e la membrana basale endoteliale, hanno bisogno di incontrare il loro antigene cognate su macrofagi o cellule dendritiche strategicamente localizzate negli spazi leptomeningeal o perivascolare. Questa interazione induce focale produzione di mediatori pro-infiammatori che attivano i meccanismi successivi necessari per invasione del tessuto CNS di cellule del sistema immunitario tramite il glia limitans7,8,9. Attivazione focale di metalloproteinasi della matrice (MMP) -2 e MMP-9 altera l'attivazione delle chemochine e induce la degradazione dei recettori di matrice extracellulare Astrocita fine-piedi, che è un prerequisito per immunitario cellulare migrazione attraverso il limitans glia nella Parenchima di CNS e per indurre l'insorgenza di sintomi clinici di EAE10,11.

La combinazione di rilevamento del sistema nervoso centrale di infiltrazione delle cellule immuni con BBB perdite e gelatinasi attività in sezioni di tessuto di CNS fornisce preziose informazioni circa l'integrità funzionale della barriera endoteliale e gliale nel contesto del neuroinflammation. Per esempio, abbiamo recentemente studiato la perdita costitutiva della molecola di adesione giunzionale del molecola endoteliale stretta della giunzione (marmellata)-B delle cellule immuni traffico nello SNC nel contesto di EAE. Non rispetto ai topi C57BL/6 di selvaggio-tipo sani, sani littermates JAM-B-carente ha mostrato alcuna compromissione dell'integrità BBB come mostrato dalla valutazione di permeabilità in vivo mediante traccianti endogeni come pure esogeno12. Nel contesto di EAE, topi C57BL/6 JAM-B-carente ha mostrato sintomi di malattia migliorata, che è stato associato con intrappolamento delle cellule infiammatorie negli spazi leptomeningeal e perivascolare12. Per esaminare questo fenomeno abbiamo applicato in situ zymography, che consenta l'identificazione dell'attività della gelatinasi al fine di verificare se la mancanza di attività della gelatinasi in topi carenti-marmellata-B può essere responsabile per la riduzione del numero di cellule del sistema immunitario in grado di violare il glia limitans12.

Data la disponibilità di diversi geneticamente modificati del mouse modelli manca, ad esempio, diverse molecole di giunzione stretta BBB che potrebbero causare cambiamenti nella funzione BBB, metodologie per l'analisi di integrità BBB sono importanti. Inoltre, recentemente sviluppati farmaci potrebbero influire sugli ostacoli NVU. Qui vi mostriamo come indurre EAE in topi C57BL/6 di immunizzazione attiva con la glicoproteina del oligodendrocyte del myelin (MOG)-peptide aa35-55 a coadiuvanti di Freund completo. Spieghiamo quindi come localizzare l'infiltrazione delle cellule immuni attraverso le barriere endoteliali e gliali la NVU e come studiare l'integrità della barriera endoteliale e gliali in vivo di rilevazione in situ di traccianti esogeni e attività della gelatinasi, rispettivamente.

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Protocollo

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Tutti gli studi sono stati condotti sotto la Guida di riferimento secondo la legislazione svizzera sulla protezione degli animali e sono stati approvati dall'ufficio veterinario del Cantone di Berna, in Svizzera (numeri di autorizzazione: BE 31/17 ed essere 77/18).

1. alloggiamento dei topi C57BL/6 in condizioni di agente patogeno specifico gratuite (SPF)

  1. Ciclo di casa topi in gabbie individuali ventilate con un 12/12 h chiaro-scuro. Fornire cibo e acqua ad libidum. Per sorvegliare la qualità microbiologica dei topi, il gruppo sperimentale ha subito monitoraggio trimestrale da sentinelle di biancheria sporca segue il FELASA consigli13.
  2. Uso dell'orecchio pugni per contrassegnare individualmente topi C57BL/6 femmina 8-12 settimana di vita.

2. immunizzazione dei topi C57BL/6

  1. Preparazione di soluzioni14:
    1. Per adiuvante completo di Freund (CFA), mix 30 mL di adiuvante di Freund incompleto con 120 mg di calore appena si inattivato tubercolosi del micobatterio (H37RA) sotto una cappa aspirante. Conservare la soluzione di riserva a 4 ° C.
    2. Per la soluzione di riserva MOGaa35-55-peptide, sciogliere MOGaa35-55-peptide nel PBS sterile (4 mg/mL) e conservare a-80 ° C.
    3. Preparare il MOG-emulsione:
      1. Diluire CFA 1:2 con soluzione stock di MOG-peptide in una microprovetta da 2 mL.
      2. Sigillare la microprovetta con pellicola sigillante e difficoltà su un Vortex coprendo completamente il tubo con nastro adesivo. Emulsione di vortice per 4 h a 4 ° C.
    4. Preparare le siringhe con emulsione stabile:
      1. Prendere i conetti e ruota velocemente giù l'emulsione utilizzando una centrifuga di piccolo tavolo. Raccogliere emulsione in una siringa con un ago per iniezione 18 x 1½'' (1,2 mm x 40 mm).
      2. Secondo il numero di topi regolare il volume di emulsione nella siringa (100 µ l/topo) e sostituire l'ago da 18 G con un ago per iniezione 27 x ¾'' (0,4 mm x 19 mm). Sigillare l'ago per iniezione collegato alla siringa con pellicola sigillante.
    5. Per la soluzione di riserva di tossina (PTx) pertosse, sciogliere 50 µ g di liofilizzato PTx in 500 µ l di PBS sterile (100 ng / µ l). Conservare la soluzione di riserva a 4 ° C.
    6. Per la soluzione di lavoro di PTx, mescolare 97 µ l di PBS sterile con 3 µ l di soluzione madre di PTx (300 ng/100 µ l) per uso del mouse (iniezione intraperitoneale un ago 30 x ½'' (0,3 mm x 13 mm)).
  2. Induzione di EAE
    1. Anestetizzare topi C57BL/6 con isofluorano utilizzando un sistema di vaporizzatore. Per indurre l'anestesia in topi, esporre il mouse al 4,5% isofluorano in ossigeno in una camera di incubazione piccolo prima di trasferire il mouse in una maschera facciale con 2,1% isofluorano. Utilizzare un'unità di anestesia con rilievo di riscaldamento per prevenire l'ipotermia del mouse.
    2. Difficoltà il mouse anestetizzato in una mano e prima di iniettare per via sottocutanea 30 µ l di MOG35-55/CFA-emulsione in fianchi posteriori della gamba (Figura 1:1 + 2; in totale 60 µ l; sinistra fianco 30 µ l e fianco destro 30 µ l) nella prossimità vicina ai linfonodi inguinali.
    3. Posizionare il mouse sul suo ventre e iniettare 20 µ l di MOGaa35-55/CFA-emulsione nel tessuto adiposo softkey destro e sinistro alla radice della coda (Figura 1:3 + 4; in totale 40 µ l; lato destro e lato sinistro coda radice 20 µ l di coda radice 20 µ l) e una piccola goccia di MOGaa35-55/CFA-emulsione int o il collo del mouse (Figura 1: 5).
    4. Iniettare 100 µ l di soluzione di PTx intraperitonealmente nel mouse. Tenere la testa del mouse sotto il centro del corpo evitando iniezione nell'intestino.
    5. Sostituire la dieta di mantenimento (estruso principali sostanze nutritive: grassi greggi 4.5%, proteina greggia 18,5%; fibra grezza 4,5%; ceneri gregge 6,5%; amido 35%; energia metabolica: 13,1 MJ/kg) alla dieta di allevamento (estruso principali sostanze nutritive: proteina greggia 23,5%; grassi greggi 5,5%, fibra grezza 3%; ceneri grezze 5,7%; 36% di amido; energia metabolica: 14,3 MJ/kg) al fine di fornire i topi con cibo di maggiore contenuto energetico prima e durante la malattia clinica prevista.
    6. Rimuovere la maschera e trasferire il mouse alla sua gabbia a casa con un rilievo di riscaldamento. Assicurarsi che il mouse è completamente sveglio e motili dopo 10 minuti.
    7. Ripetere l'iniezione di PTx (2.2.4) 48 h dopo il primo trattamento.

3. Punteggio di topi EAE

  1. Controllare lo stato di salute dei topi EAE ogni mattina da un'occhiata all'interno delle gabbie.
  2. Punteggio ottenuto topi EAE ogni pomeriggio.
  3. Prendere ogni singolo mouse inclusi nell'esperimento EAE fuori la gabbia e verificare se la coda ha tonus spostandolo verso l'alto con un dito. Un topo sano vi permetterà di mantenere la sua coda (la coda ha un tonus). Se clinica EAE è iniziata, il tonus coda sarà inferiore, visibile da un graduale calo della coda. Alla fine il mouse non sarà in grado di sollevare la coda a tutti.
  4. Posizionare ogni singolo mouse inclusi nell'esperimento EAE sul banco pulito e osservare e documentare il comportamento a piedi. Vedere tabella 115 per criteri di classificazione per la valutazione della severità di malattia (il Punteggio di EAE).
  5. Valutare e documentare il peso di ogni mouse inclusi nell'esperimento.
  6. Per garantire un'alimentazione adeguata e l'assorbimento d'acqua dai topi visualizzati da una clinica EAE Punteggio di 1 fornitura cibo inumidito in un piatto di plastica sul fondo della gabbia e aggiorna ogni giorno.

4. test di permeabilità In vivo

  1. Preparazioni di soluzioni:
    1. Per soluzioni di riserva di destrano, sciogliere 10 mg di 10 kDa destrano Alexa Fluor 488, nonché 3 kDa destrano Texas Red in 500 µ l di soluzione di sodio cloruro 0,9% (20 mg/mL).
    2. Per la soluzione di lavoro di destrano, appena prima di iniezione dispensare 55 µ l di 10 kDa destrano Alexa Fluor 488 stock (20 mg/mL) di soluzione su un pezzo di pellicola sigillante e 55 µ l di 3 kDa destrano soluzione stock di Texas Red (20 mg/mL). Mescolare e raccogliere 100 µ l in una siringa monouso bene (concentrazione finale 2 mg/100 µ l).
    3. Per la la soluzione 10% formaldeide (PFA), unire 10 g di PFA extra puro in polvere, 100 mL di PBS e 200 µ l di NaOH 1N in un becher di vetro pulito e calore fino a precisamente a 56 ° C sotto agitazione con un agitatore magnetico; tenere a 56 ° C per 30 min fino a quando il PFA è completamente disciolto; raffreddare a temperatura ambiente; regolare il pH a 7.4; e filtrare su un filtro di carta. Conservare a - 20 ° C. La soluzione di riserva può essere diluita ulteriormente utilizzando PBS.
  2. Poco anestetizzare topi C57BL/6 sani o topi C57BL/6 affetti da EAE con isoflurano (il mouse verrà sedato per circa 1 min). Utilizzare un sistema automatico come descritto al punto 2.2.1 (topi saranno esposto al 4,5% isoflurane in ossigeno in un'aula di induzione e poi trasferiti in una maschera facciale con isoflurano 2,1%).
  3. Posizionare il mouse anestetizzato in posizione laterale sul tavolo, poi per via endovenosa (per esempio retrò-orbitally) iniettare 100 µ l di traccianti fluorescenti il mouse prima che il mouse si sveglia.
  4. Immediatamente rimuovere la maschera facciale e assicurarsi che il mouse è completamente sveglio e motili dopo l'anestesia breve. Lasciate che il tracciante circolare per 15 min.
  5. Procedere con il passaggio 5.1.

5. perfusione dei topi

  1. Per la valutazione della permeabilità in vivo:
    1. Iniziare la procedura di 15 min dopo l'iniezione del tracciante fluorescente attraverso l'induzione di anestesia profonda isoflurano. Per indurre l'anestesia profonda nei topi utilizzare 2,3% di isoflurane in ossigeno. Utilizzare il riflesso di ritiro della zampa per giudicare la profondità dell'anestesia (pizzicare la pelle tra le dita; mancanza di flessione indica una profondità sufficiente) e sonda i riflessi dell'arto anteriore sia del hindlimb nei topi sottoposti a EAE.
    2. Difficoltà il mouse sul dorso e il ventre a spruzzo con etanolo. Aprire il torace con una forbice e rimuovere il diaframma. Aprire l'atrio destro del cuore pulsante utilizzando una forbice e irrorare il mouse attraverso il ventricolo sinistro del cuore con 10 mL di PBS seguita da 10 mL di 4% PFA in PBS.
      Attenzione: Per evitare di inalare PFA, irrorare il mouse in una cappa aspirante.
    3. Passare alla sezione 6.
  2. Per in situ zymography:
    1. Inducono anestesia profonda isoflurano utilizzando isoflurano 2,3% in ossigeno in un mouse affetti da EAE e controllare la profondità dell'anestesia come descritto al punto 5.1.1.
    2. Successivamente, il mouse fix sul dorso e spruzzare la pancia con etanolo. Aprire il torace con una forbice e rimuovere il diaframma. Aprire l'atrio destro del cuore pulsante utilizzando una forbice e irrorare il mouse attraverso il ventricolo sinistro del cuore con 20 mL di PBS.
    3. Passare alla sezione 6.

6. dissezione e congelamento dei cervelli

  1. Preparazione del bagno di raffreddamento:
    1. Riempire un contenitore dewar piano con ghiaccio secco tritato e aggiungere 2-metilbutano (isopentano) fino a quando il liquido raggiunge circa 1 cm sopra il pacco di ghiaccio secco. Coprire con un coperchio sciolto – ad es., copertina di un secchiello per il ghiaccio.
  2. Clip la testa del mouse irrorato con forbici affilate e rimuovere la pelle e le orecchie utilizzando un insieme ridotto di forbici.
  3. Accuratamente sezionare il skullcap tagliando dal forame magno verso la parte anteriore a sinistra e la destra permettendo di upfold il skullcap sopra il cervello. Quindi, sollevare delicatamente il cervello intatto dalla base del cranio mentre recidere i nervi ottici con una spatola metallica piana.
  4. Mettere il cervello di alluminio e tagliare il cervello in tre pezzi (frontale del cervello, cervello medio e cervelletto + tronco cerebrale) inserendo due tagli coronali.
  5. Riempire un cryomold (25 x 20 x 5 mm) per il primo trimestre con matrice di taglio (t.o.c.) temperatura ottimale, posizionare fette del cervello con il lato anteriore di ogni pezzo di cervello rivolto verso il basso verso il cryomold e ricoprire il tessuto completamente con t.o.c. matrice.
  6. Posizionare il cryomold con il tessuto in un orientamento orizzontale nel bagno 2-metilbutano e assicurarsi che il tessuto si blocca dal basso verso l'alto entro 1 minuto evitando il blocco intero tessuto di immersione nella vasca da bagno.
  7. Trasferimento di tessuto congelato a-80 ° C per la conservazione e procedere con la sezione 7.

7. preparazione di sezioni di tessuto congelato

  1. Equilibrare la temperatura dal tessuto congelato da-80 ° C a-20 ° C a criostato per 30 min.
  2. Rimuovere il blocco di tessuto dal cryomold e montare il titolare di tessuto del criostato (impostato a-15 ° C) utilizzando o.c.t. matrice.
  3. Tagliare i bordi del blocco del tessuto sul supporto del criostato con un bisturi affilato e iniziare a tagliare nel blocco tessuto rimuovendo 20 µm sezioni con il coltello del criostato, fino a quando il tessuto è visibile.
  4. Per l'analisi di permeabilità in vivo di BBB:
    1. Tagliare sezioni di tessuto di 6-10 µm, raccoglierli su vetrini per l'adesione e la immagine immediatamente le sezioni coperte con un vetrino coprioggetto utilizzando un microscopio a fluorescenza.
    2. Valutare l'aspetto dei vasi sanguigni nel cervello (prestare attenzione a forti confini dei vasi sanguigni che non perde rispetto a diffondere modelli di fluorescenza osservati per i vasi sanguigni che perde). Come controllo positivo, verificare la perdita dell'elemento tracciante nello stroma degli organi circumventricolari o plesso coroideo che mancano un BBB.
  5. Per in situ zymography:
    1. Tagliare 6 µm sezioni di tessuto usando un criostato, raccoglierli sulle lastre di vetro di adesione e congelare a-20 ° C in una scatola di congelamento contenente gel di silice nel coperchio le sezioni di tessuto.

8. in situ zymography combinato con laminina/CD45 immunofluorescenza

  1. Preparare soluzioni:
    1. Preparare la soluzione di incorporamento:
      1. Mescolare 6 g di glicerolo (grado analitico), 2,4 g di poli (alcole vinilico), 6 mL di ddH2O e 12 mL di tampone Tris di 0.2 M, pH 8 e mescolare (agitatore magnetico) la soluzione per 4 h a TA.
      2. Trasferire la soluzione in una provetta da centrifuga 50ml e lasciarlo riposare per 2 ore a TA. Successivamente Incubare la soluzione per 10 min a 50 ° C (bagnomaria) e centrifugare per 20 min a 2.700 x g a temperatura ambiente.
      3. Prendere il surnatante e congelare in aliquote a-20 ° C.
    2. Preparare la soluzione di gelatina fredda:
      1. Sciogliere 0,1 g di gelatina fredda dalla pelle bovina in 10 mL di ddH2O.
      2. Lasciate macerare per almeno 1 giorno e conservare le aliquote a 4 ° C.
    3. Preparare metanolo ghiacciato (-20 ° C):
      1. Mettere il 100% di metanolo in una vaschetta di Coplin e raffreddare fino a-20 ° C.
    4. Preparare la soluzione di riserva di 10% sodio azide:
      1. Aggiungere 1 g di sodio azide a 10 mL di ddH2O e conservare a temperatura ambiente.
    5. Preparare la soluzione di lavoro di 0,1% sodio azide:
      1. Mix 99 µ l della ddH2O con 1 µ l di soluzione madre 10% sodio azide.
    6. Sciogliere 1 mg di fluorescina coniugata tintura-estiguuto (DQ) gelatina da pelle di maiale in 1 mL di sodio azide lavorando aliquote di µ l 100 soluzione e conservare al riparo dalla luce a 4 ° C.
    7. Sciogliere 30 mg di 1,10-fenantrolina monoidrato in 76 µ l di etanolo e conservare a-20 ° C.
    8. Preparare la soluzione di inibitore di proteasi: 25x:
      1. Aggiungere 1 compressa di inibitore di proteasi gratis EDTA a 2 mL di ddH2O. Conservare a-20 ° C.
    9. Appena prima dell'uso, preparare la soluzione di reazione (150 µ l/sezione):
      1. Centrifugare la soluzione di gelatina DQ 1 mg/mL per 5 min a 13.300 x g.
      2. µ L di mix 127,2 di ddH2O, 15 µ l di tampone di reazione (gelatinasi/collagenosi Assay Kit; Vedi Tabella materiali) 10x, 0,3 µ l di gelatina fredda 20 mg/mL, 1,5 µ l di gelatina DQ 1 mg/mL e 6 µ l di soluzione di inibitore di proteasi: 25x.
    10. Appena prima dell'uso, preparare la soluzione di reazione di controllo negativo di fenantrolina (150 µ l/sezione):
      1. µ L di mix 125,2 di ddH2O, 15 µ l di tampone di reazione, 0,3 µ l di gelatina fredda 20 mg/mL, 1,5 µ l di gelatina DQ 1 mg/mL, 6 µ l di 25 x inibitore della proteasi EDTA gratis: 10x e 2 µ l di 2 M 1,10-fenantrolina (inibitore della MMP).
    11. Appena prima dell'uso, preparare la soluzione di gelatina fredda controllo negativo (non fluorescente) reazione (150 µ l/sezione):
      1. µ L di mix 128,7 di ddH2O, 15 µ l di tampone di reazione 10x, 0,3 µ l di gelatina fredda 20 mg/mL e 6 µ l di inibitore di proteasi 25x privo di EDTA.
    12. Preparare cocktail per colorazione di contrasto, ad esempio l'anticorpo primario, 0,95 µ g/mL policlonali di coniglio anti-laminina anticorpo e 10 µ g/mL ratto policlonale anti-CD45 anticorpo in 1% BSA in PBS e isotype appropriato controllo cocktail di anticorpo primario.
    13. Preparare la soluzione di anticorpo secondario, ad esempio, 7,5 µ g/mL Cy3 capra anti-ratto + 15 µ g/mL anti-coniglio AMCA in 1% BSA in PBS (proteggere dalla luce).
  2. Scongelare 6 sezioni di tessuto di cervello non fissa di µm da topi EAE all'interno della scatola di congelamento in plastica contenenti gel di silice del coperchio in una cappa per evitare la ritenzione di acqua al tessuto e separare le 2 sezioni di tessuto su un vetrino disegnando linee con una penna di idrorepellente
  3. Preparare soluzioni di reazione (misure 8.1.9-8.1.11), centrifugare per 5 min a 13.400 x g a temperatura ambiente e pre-riscaldare a 37 ° C, utilizzando un bagno d'acqua.
  4. Reidratare le sezioni di tessuto per 5 min a 37 ° C, utilizzando 1x tampone di reazione. Quindi, versare il 1x tampone di reazione, aggiungere la soluzione di reazione su sezioni di tessuto e incubare per 4 h a 37 ° C. Lavare i vetrini 5 volte in ddH2O.
  5. Difficoltà sezioni per 5 min con metanolo ghiacciato a-20 ° C e successivamente lavare sezioni una volta con PBS a temperatura ambiente.
  6. Aggiungere le sezioni BSA 1% in PBS e incubare per 20 minuti a temperatura ambiente (proteggere dalla luce). Poi, scartare 1% BSA in PBS dalle sezioni lanciando le diapositive sul tessuto, aggiungere cocktail di anticorpo primario e incubare per 1 h a temperatura ambiente (proteggere dalla luce).
  7. Lavare sezioni due volte con PBS, aggiungere cocktail di anticorpo secondario e incubare per 1 h a temperatura ambiente (proteggere dalla luce).
  8. Lavare sezioni due volte con PBS, montare i vetrini con l'incorporamento di soluzione, lasciare montate sezioni asciugare tutta la notte a temperatura ambiente (proteggere dalla luce). Infine, analizzare sezioni di tessuto macchiato usando un microscopio a fluorescenza.

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Risultati

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Valutazione del decorso clinico di EAE in topi C57BL/6 dovrebbe risultare in una curva di malattia come raffigurato in Figura 2A e cambiamenti nel peso corporeo del mouse come presentato nella Figura 2B. C57BL/6 topi immunizzati con MOGaa35-55 solitamente iniziano a sviluppare i sintomi della malattia circa 10-12 giorno dopo immunizzazione attiva (Figura 1A). In genere, topi immunizzati mostrano un calo transitorio del peso corporeo...

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Discussione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Qui, presentiamo un protocollo per indurre e monitorare EAE in topi femminili C57BL/6. Le femmine sono preferenzialmente scelti, e c'è un'incidenza delle donne: gli uomini di 3:1 in MS. Per valutare la severità di EAE, abbiamo fatto uso di un foglio di Punteggio 3 punti. Gravità EAE è generalmente segnato per quanto riguarda la gravità delle disfunzioni motore. Topi con fasi avanzate di EAE, vale a dire che esibiscono un punteggio superiore a 2 dovrebbe essere sacrificata per evitare inutili sofferenze degli animali. Per...

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Dichiarazioni

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Conflitti di interesse non dichiarati.

Ringraziamenti

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Noi riconosciamo con gratitudine Lydia Sorokin, che ha condiviso il suo originale in situ zymography protocollo10 con noi.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
AMCA anticorpo anti-coniglioJackson ImmunoResearch111-156-045Negozio a 4 ° C; proteggere dalla luce
Anticorpo anti-CD45 (30F11)Pharmingen07-1401Conservare a 4 ° C
Anticorpo anti-lamininaDAKOZ0097Negozio a 4 gradi C
Mangime per l'allevamentoad es. PROVIMI KLIBA SA3336
Gabbie ventilate individualmente, linea blu Tipo II o III,ad es. Tecniplast 1145T, 1285L
BSA frazione VApplichemA1391Conservare a 4 gradi; C
Gelatina freddaSigma-AldrichG 9391
Barattolo Coplin + rastrelliera, ad es. Carl Roth GmbH + Co. KGH554.1; H552.1
Cy3 anticorpo anti-rattoJackson ImmunoResearch111-156-144Conservare a 4 gradi; C; proteggere dalla luce
Vetrini coprioggetti 24 x 40 mm # 1ad es. Thermo Scientific85-0186-00
Destrano Alexa Fluor 488 (10.000 MW)ad es. Sonde molecolariD22910Conservare a -20 ° C; proteggere dalla luce
Destrano Texas Red (3000 MW)InvitrogenD3328Conservare a -20 ° C; proteggere dalla luce
Kit per il dosaggio della gelatinasi/collagenasi EnzChek Thermo Fisher Scientifico; EnzCheckE12055Negozio a -20 C; proteggere dalla luce
Topi femmina C57BL/6J (8-12 settimane)ad es. Janvier LabsFemmine, 8-12 settimane
Scatola di congelamento per vetrini istologici, ad es. Carl Roth GmbH + Co. KG2285.1
18G x 1½ ’ ’ ago per iniezione (1,2 mm x 40 mm),ad es. BD, BD Microlance 3304622
27G x ¾ ’ ’ – Nr. 20 (0,4mm x 19mm) ago per iniezionees. BD, BD Microlance 3302200
30G x ½ ’ ’ ago per iniezione (0,3 mm x 13 mm),ad es. BD, BD Microlance 3304000
Freund' incompleto s adiuvante (IFA)es. Santa Cruz Biotechnologysc-24648Negozio a 4° C
Alimenti di manutenzione, ad es. PROVIMI KLIBA SA3436
MOGaa35-55 peptide, ad es. GenScriptStore a -80 ° C
vetrini per microscopio (Superfrost Plus )Thermo ScientificJ1800AMNZ
Mycobacterium tuberculosis H37RAes. BD231141Conservare a 4 gradi; C 
NaCl 0,9 %B. Braun3535789
composto O.C.T. (Tissue-Tek )Sakura4583
Omnican 50 30G x ½ ’ »B. Braun9151125S
ParaformaldeideMerck30525-89-4
Tossina della pertosse, ad es. Elenco laboratori biologici, Inc.180Negozio a 4 gradi C
poli(alcol vinilico) (Mowiol 4-88)Sigma-Aldrich81381
Inibitore della proteasi EDTA senza EDTA (Roche)Sigma-Aldrich 4693132001Negozio a 4 gradi; C
penna repellente, ad es. DAKO Penad es. DAKOS2002
pellicola sigillante, ad es. Parafilm M, ad es. Sigma-AldrichP7793
gel di silicead es. Carl Roth GmbH + Co. KG9351.1
Forbice per cucitureF.S.T15012-12
siringa, 1 ml, ad es. PRIMO62.1002
siringa da 10 ml, ad es. CODAN Medical Sistema2022-05
Univentor 400UNO. Bv
, , , , , , di vaporizzazione ApS

Riferimenti

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  3. Hannocks, M. J., et al. Molecular characterization of perivascular drainage pathways in the murine brain. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 38, 669-686 (2018).
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  28. Owens, T., Bechmann, I., Engelhardt, B. Perivascular spaces and the two steps to neuroinflammation. Journal of Neuropathology & Experimental Neurology. 67, 1113-1121 (2008).
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  30. Grewal, I. S., et al. CD62L is required on effector cells for local interactions in the CNS to cause myelin damage in experimental allergic encephalomyelitis. Immunity. 14, 291-302 (2001).

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