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Articolo metodologico

Analisi di Fucosylated Human latte trisaccaridi nel contesto biotecnologica utilizzando geneticamente codificato biosensori

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⸱

DOI:

10.3791/59253

⸱

13 aprile 2019

 , 
1Department of Chemical and Biological Engineering, Iowa State University

In questo articolo

Sommario

Descriviamo qui il rilevamento ad alta velocità e la quantificazione degli oligosaccaridi del latte umano fucosylated (HMOs) utilizzando un biosensore di cellule intere. Inoltre dimostriamo qui, l'adattamento di questa piattaforma nei confronti di ceppi di produzione HMO, concentrandosi sul miglioramento del rapporto segnale-rumore.

Abstract

Gli oligosaccaridi del latte umano (HMOs) sono dei carboidrati complessi componenti del latte materno umano che presentano abbondanti benefici sulla salute infantile. Tuttavia, ottimizzazione della loro sintesi biotecnologica è limitata dalla relativamente bassa velocità effettiva di rilevazione e quantificazione di monosaccaride e collegamenti. Le tecniche convenzionali di analisi glycan includono metodi cromatografici/massa-spettrometria con velocità di trasmissione dell'ordine di centinaia di campioni al giorno senza automazione. Qui, dimostriamo un biosensore batterico geneticamente codificato per la rilevazione di alto-rendimento, specifiche del sollevatore e quantificazione delle strutture fucosylated HMO, 2'-fucosyllactose e 3-fucosyllactose, che abbiamo raggiunto via eterologa espressione di fucosidases. Come la presenza di lattosio nel latte o in processi biotecnologici potrebbe portare a falsi positivi, dimostriamo anche la riduzione del segnale da lattosio utilizzando diverse strategie. Dovuto l'alta velocità effettiva di questa tecnica, molte condizioni di reazione o bioreattore parametri potrebbero essere analizzati in parallelo in poche ore, consentendo l'ottimizzazione della produzione di HMO.

Introduzione

Gli oligosaccaridi del latte umano (HMOs) Sono oligosaccaridi lattosio-derivato, solitamente composto da tre a otto monomeri di zucchero. Essi hanno una riduzione del lattosio (Gal-β1, 4-Glc) fine e sono ulteriormente allungate da legami glicosidici (β-1,3 - o β-1,6-) di glucosio (cromatografia gaseoliquido), galattosio (Gal) o N-acetilglucosamina (GlcNAc). Inoltre, fucosio (Fuc, α-1,2 - o α-1,3-) o acido sialico (Sia o NeuAc, α-2,3 - o α-2,6-) residui vengono spesso aggiunti1.

Analisi corrente di oligosaccaridi e altri carboidrati sono limitato a velocità effettiva e la portata dalla necessità per spettrometria cromatografico/massa (MS) tecnologia di2,4,3,5, 6 , 7, che può durare circa un'ora per campione, per non parlare della necessità di attrezzature costose, colonne specializzate e agenti derivatizzanti e competenza sul funzionamento di questa apparecchiatura8. Oligosaccaride collegamenti sono particolarmente difficili da determinare, che richiede avanzate MS9,10 o di tecniche di risonanza magnetica nucleare (NMR)11. Rapida ottimizzazione di sintesi di questi oligosaccaridi è così limitato dalla velocità effettiva di questo lento passaggio analitico.

In questo studio, dimostriamo rilevazione sollevatore-specifica del trisaccaride fucosylated basati su lattosio HMOs, concentrandosi su 2'-fucosyllactose (2'-FL) che è il HMO più abbondante nel latte umano, utilizzando un codificato geneticamente Escherichia coli cellule intere biosensore con un limite di rilevazione 4 mg/l. Una caratteristica importante di questo biosensore è la sua capacità di distinguere tra trisaccaridi isomerica. Il principio di progettazione si basa sull'espressione di specifiche fucosidases in e. coli che liberare il lattosio da HMOs, la cui presenza è rilevata da operone lac , che a sua volta genera un segnale fluorescente. Raggiungiamo questo con la costruzione di un sistema di due-plasmide, uno che harboring il fucosidase specifiche del sollevatore e l'altra una proteina reporter fluorescente. Questa piattaforma di biosensore è adatta per high throughput screening di citometria a flusso o lettore di micropiastre. Inoltre dimostriamo l'utilizzo del biosensore nella quantificazione del 2'-FL prodotto da un ceppo derivati dal12. All'interno di questo studio, presentiamo anche tre strategie su rimozione selettiva di lattosio che può causare segnali positivi da biosensore, dato che il ceppo di derivati dal produttore viene coltivato il lattosio.

Presi insieme, i biosensori codificati geneticamente ci permettono di rilevare e quantificare HMOs in maniera sollevatore-specifica, che è difficile anche con cromatografica, MS, o NMR tecniche. Grazie alla sua alta produttività e facilità d'uso, questo metodo dovrebbe avere applicazioni diffuse nell'ingegneria metabolica e la sintesi di HMOs.

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Protocollo

1. cella condizioni di cultura e induzione

Nota: Negli esperimenti seguenti, vengono utilizzati tre ceppi: e. coli BL21 (DE3) con un vettore vuoto, e. coli BL21 (DE3) con plasmidi pAfcA14 e pET28:green proteina fluorescente (GFP) ed e. coli BL21 (DE3) con plasmidi pAfcB14 e pET28:GFP. Tutti i ceppi sono coltivati in brodo di Luria-Bertani (LB) o media minimi con gli antibiotici adatti. Preparare soluzioni di riserva di 1.000 x kanamicina (50 mg/mL) e carbenicillina (100 mg/mL) in deionizzata (DI) di acqua.

  1. Preparazione dei terreni
    1. Preparare i supporti LB aggiungendo 25 g di brodo in polvere LB a 1 L di acqua deionizzata. Sterilizzare in autoclave la soluzione a 121 ° C per 20 min sterilizzare. Attendere che la temperatura del fluido LB sterilizzata è inferiore a 60 ° C prima dell'aggiunta di 1 µ l di antibiotico stock ogni 1 mL di LB media.
    2. Per preparare piatti della libbra, aggiungere 15 g di agar ai media LB prima della sterilizzazione. Attendere che la temperatura di agar LB sterilizzata è sotto i 60 ° C prima dell'aggiunta di antibiotico.
    3. 1.1.3 per le celle di biosensori, preparare o piastre con antibiotici dual, kanamicina e carbenicillina.
  2. Induttori di carboidrati
    1. Preparare soluzioni di riserva di induttori di carboidrati al molari equivalenti a 20 g/L di lattosio: 29 g/L di 2'-FL e 3-FL.
      Nota: Ogni 200 µ l di cellule richiederà 20 µ l di 2'-FL o 3-FL.
    2. Indurre 200 µ l di cellule con 2,0 g/L di concentrazione finale di lattosio o 2,9 g/L di concentrazione finale di 2'-FL/3-FL. Incubare a 37 ° C con agitazione continua e lasciare che culture crescere durante la notte.
  3. Coltura cellulare
    1. Il giorno prima dell'esperimento del seme 5 mL di LB supplementato con kanamicina e carbenicillina da una colonia batterica fresca, utilizzando una tecnica sterile.
    2. Incubare tutte le colture a 37 ° C con agitazione e far crescere le colture durante la notte.
    3. Trasferire 50 µ l della coltura durante la notte in 5 mL di fresca LB/M9 media con kanamicina e carbenicillina. Incubare a 37 ° C con agitazione continua e crescere fino a quando la cultura ha raggiunto la densità ottica a 600 nm (OD600) di 0,5 – 0,7. In questa fase di Mid-registro, le cellule possono essere indotte.

2. misurazione della fluorescenza e limiti di rilevazione

  1. Preparazione delle cellule per citometria a flusso
    1. Trasferire le culture durante la notte per provette da 1,5 mL e centrifugare a 12.500 x g per 1 min.
    2. Eliminare il surnatante e risospendere il pellet in 500 µ l di soluzione 1x tampone fosfato (PBS; 6 mM Na2HPO4, 1.8 mM NaH2PO4, 145 mM NaCl in acqua deionizzata, pH 7.2) per preparare una sospensione di singola cellula e trasferire la singola cella sospensione in provette da 5 mL flusso cytometry.
    3. Mantenere le cellule al buio a 4 ° C fino a in esecuzione i campioni su un citometro a flusso. Per risultati ottimali, è necessario analizzare le cellule appena possibile.
    4. Selezionare 488 nm laser per eccitare la GFP. Raccogliere i livelli di fluorescenza della fluorescina isotiocianato di fluoresceina (FITC) (20.000-40.000 eventi, gated per dispersione avanti e laterali evitare i detriti e cellule aggregate) con un filtro passa-banda di 525/50 nm.
  2. Calibrare il biosensore
    1. Per rendere una curva di calibrazione, fare 8 – 10 diluizioni dello standard 2'-FL nel range 0-2.500 mg/L.
    2. Le cellule di biosensori di 2'-FL (contenente pAfcA e pET28:GFP) della cultura e indurli con le diluizioni standard, come descritto in precedenza nella sezione 1.3. Eseguire tre replicati biologici per ogni diluizione.

3. rilevazione e quantificazione della 2'-FL in un ceppo produttore

  1. Coltivazione del ceppo produttore
    1. Per rendere minimo media, preparare soluzioni separate di 1 M K2HPO4, FeSO4·7H2O, citrato di sodio e 1m tiamina-HCl. sterilizzare le soluzioni usando un filtro da 0,22 µm. Mescolare M9 media brodo in polvere con 1 L di acqua deionizzata. Autoclave la soluzione M9 a 121 ° C per 15 min. raffreddare la soluzione fino a 50 ° C. Aggiungere MgSO4, CaCl2, K2HPO4, FeSO4·7H2O, citrato di sodio e tiamina a concentrazioni finali di 2 mM, 0,1 mM, 12 g/L, 11 mg/L, 75 mg/L e 7,5 µ g/L, rispettivamente.
    2. Avviare una cultura della 2'-FL producendo ceppo, ad es., JM109 gwBC-F2, in 5 mL di LB media e lasciarlo crescere durante la notte a 37 ° C, come descritto in Baumgartner et al.12.
    3. Sottocultura all'1% come descritto in precedenza punto 1.3.3 in 250 mL dei media minimi preparati al punto 3.1.1. Aggiungere glicerolo a una concentrazione finale di 10 g/L e incubare la coltura a 37 ° C.
    4. Quando la cultura raggiunge un OD600 di 0,5 – 0,7, aggiungere isopropilico β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) ad una concentrazione finale di 0,5 mM e lattosio a una concentrazione finale di 2 g/L.
    5. Incubare a 37 ° C con agitazione continua e lasciare che culture crescere per 24 h.
  2. Estrazione di 2'-FL
    1. Trasferire le culture durante la notte a provette sterili da 50 mL e centrifugare a 900 x g per 15 min.
    2. 3.2.2 eliminare il surnatante e risospendere il pellet in acqua deionizzata. Ripetere il passaggio di lavare tre volte per rimuovere il lattosio residuo e infine risospendere in 5 mL di acqua deionizzata.
    3. Per lisare la sospensione cellulare, è necessario utilizzare un sonicatore al 30% di potenza, in 30 s Pulse. Mantenere le cellule sul ghiaccio in ogni momento.
    4. Centrifugare le cellule lisate per 25 min a 2.000 x g. Eliminare il surnatante, passare attraverso una sterile (ad es., da 0,22 µm) filtrare e conservare a 4 ° C fino all'analisi.
  3. Quantificazione con biosensore
    1. Inoculare una cultura di 2'-FL biosensoristica cellule e nella fase Mid-registro, indurre con equivalente lysate delle cellule alle concentrazioni stimate di 2'-FL utilizzato per rendere la curva di taratura come descritto nella sezione 2.2. Eseguire la calibrazione nell'ambiente stesso come il campione da analizzare (ad esempio, lisato cellulare) aggiungendo diluizioni di 2'-FL a controllo (cioè, non produttori) lysate prima di indurre le cellule biosensore filtrata delle cellule.
    2. Eseguire gli esempi su un citometro a flusso. Generare una curva dose-risposta tracciando l'output di fluorescenza rispetto alla concentrazione di oligosaccaride. Confrontare la risposta degli standard per il lysate delle cellule.

4. selettiva rimozione di lattosio

Nota: Le cellule di biosensori sono sensibili al lattosio ed è auspicabile che il biosensore rilevare selettivamente HMOs su lattosio. Una strategia include lavaggio delle cellule come descritto nella sezione 3.2. Tre altre strategie sono descritte di seguito.

  1. Trattamento con commerciale purificato β-galattosidasi
    1. Sciogliere il liofilizzato di β-galattosidasi per 1.000 (lattasi FCC) unità/mL, a 1 mM MgCl2 o uso commerciale di β-galattosidasi in soluzione.
    2. Per determinare la concentrazione ottimale di enzima necessaria, crescere un inoculo di cellule biosensoristica 2'-FL e indurre con 2 g/L lattosio e 2,9 g / L 2'-FL a metà fase di log.
    3. A 100 culture µ l, aggiungere quantità variabili di β-galattosidasi, fino a 12 unità e lasciare che le colture crescono durante la notte a 37 ° C con agitazione continua.
    4. Misurare la fluorescenza come descritto nella sezione 2.1 e calcolare le unità ottimale dell'enzima necessario determinando la concentrazione di enzima minimo per raggiungere desiderato attenuazione del segnale.
    5. A 2'-FL producendo cellule coltivate per 24 h, aggiungere unità ottimale di β-galattosidasi e incubare per una notte a 37 ° C. Procedere con il protocollo per la determinazione del titolo di 2'-FL come descritto nella sezione 3.3.
  2. Pre-trattamento con LacZ + ceppo
    1. Avviare una cultura di 25 mL di 2'-FL producendo ceppo e una volta indotta in fase di Mid-registro, incubare la coltura a 37 ° C per 24 h.
    2. Inoculare un e. coli BL21 (DE3) cultura in LB, crescere alla fase di Mid-registro a 37 ° C e aggiungere 50 mL della cultura (2:1) alla cultura 24h.
    3. Incubare a 37 ° C per 3 h. procedere con il protocollo per la determinazione del titolo di 2'-FL come descritto nella sezione 3.3.
  3. Precipitazione di lattosio con etanolo
    Nota: Questa sezione è adattata da Matsuki et al.12.
    1. Avviare una cultura di 25 mL di 2'-FL producendo ceppo e una volta indotta in fase di Mid-registro, incubare a 37 ° C per 24 h.
    2. Aggiungere due volumi di etanolo al 100% alla cultura, agitare bene e incubare a 37 ° C per 4 ore.
    3. Centrifugare la sospensione a 900 x g per 15 min. raccogliere il surnatante e incubare per una notte a 4 ° C, che precipita il lattosio.
    4. Rimuovere il lattosio precipitato passando la soluzione attraverso un filtro di carta (11 µm). Raccogliere il filtrato che rappresenta la cella lysata contenente la 2'-FL, che può essere quantificata dalla seguente sezione 3.3.

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Risultati

Abbiamo progettato un biosensore intera cellula specifico a 2'-FL che può essere utilizzato in combinazione con la produzione biotecnologica dell'oligosaccaride. Questo si basa sulla scissione enzimatica specifica di modificare terminali zuccheri generazione di lattosio e quindi l'attivazione dell'operone lac , che conduce all'espressione di una proteina fluorescente reporter sotto un promotore inducibile di lattosio, in proporzione alla quantità di 2'-FL. Per dimostrare la sua s...

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Discussione

Vi presentiamo una strategia ad alta produttività per la rilevazione di specifici del sollevatore di fucosylated gli oligosaccaridi del latte umano. Ciò è stata compiuta con la costruzione di biosensori di cellule intere di genetica e. coli che dopo induzione con specifici glicani rispondere con un segnale fluorescente. Il protocollo inoltre dettagli su come il biosensore può essere utilizzato per rilevare e quantificare HMOs in un metabolicamente derivati dal ceppo batterico.

Il nost...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato sostenuto dai fondi di avvio di Iowa State University. F.E. è stato parzialmente finanziato dal NSF Trinect Fellowship e Manley Hoppe cattedra. T.J.M. è stato parzialmente sostenuto da Karen e Denny Vaughn Facoltà Fellowship. Gli autori ringraziano Iowa State University flusso Cytometry Facility e il laboratorio di ricerca metabolomica W.M. Keck per assistenza con fluorescenza e studi di LC-MS.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
2'-fucosillattosio Carbosynth 41263-94-9
3-fucosillattosio Carbosynth 41312-47-4
AgarFisher ScientificBP9744500
Cloruro di calcio, diidratoFisher ScientificC79-500
Carbenicillina Fisher ScientificBP26481
Destrosio (D-glucosio), anidroFisher ScientificD16-1
Citometro a flussoBDFACSCanto Plus RUO
HPLCAgilent TechnologiesSistema HPLC serie 1100
Colonna HPLCLunaC18 Colonna a fase inversa
KanamicinaFisher Scientific
libbra di brodo, mugnaio Fisher Scientific12-795-027
LattosioFisher Scientific64044-51-5
M9, sali minimi, 5xSigma-AldrichM6030
solfato di magnesio, anidroFisher ScientificM65-500
MSAgilent TechnologiesRivelatore SL a trappola selettiva di massa
Cloruro di sodioSigma-Aldrich7647-14-5
Sodio fosfato bibasicoSigma-Aldrich7558-79-4
Sodio fosfato monobasicoSigma-Aldrich13472-35-0
11815024

Riferimenti

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