Descriviamo qui il rilevamento ad alta velocità e la quantificazione degli oligosaccaridi del latte umano fucosylated (HMOs) utilizzando un biosensore di cellule intere. Inoltre dimostriamo qui, l'adattamento di questa piattaforma nei confronti di ceppi di produzione HMO, concentrandosi sul miglioramento del rapporto segnale-rumore.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
Analisi di Fucosylated Human latte trisaccaridi nel contesto biotecnologica utilizzando geneticamente codificato biosensori
In questo articolo
Sommario
Abstract
Gli oligosaccaridi del latte umano (HMOs) sono dei carboidrati complessi componenti del latte materno umano che presentano abbondanti benefici sulla salute infantile. Tuttavia, ottimizzazione della loro sintesi biotecnologica è limitata dalla relativamente bassa velocità effettiva di rilevazione e quantificazione di monosaccaride e collegamenti. Le tecniche convenzionali di analisi glycan includono metodi cromatografici/massa-spettrometria con velocità di trasmissione dell'ordine di centinaia di campioni al giorno senza automazione. Qui, dimostriamo un biosensore batterico geneticamente codificato per la rilevazione di alto-rendimento, specifiche del sollevatore e quantificazione delle strutture fucosylated HMO, 2'-fucosyllactose e 3-fucosyllactose, che abbiamo raggiunto via eterologa espressione di fucosidases. Come la presenza di lattosio nel latte o in processi biotecnologici potrebbe portare a falsi positivi, dimostriamo anche la riduzione del segnale da lattosio utilizzando diverse strategie. Dovuto l'alta velocità effettiva di questa tecnica, molte condizioni di reazione o bioreattore parametri potrebbero essere analizzati in parallelo in poche ore, consentendo l'ottimizzazione della produzione di HMO.
Introduzione
Gli oligosaccaridi del latte umano (HMOs) Sono oligosaccaridi lattosio-derivato, solitamente composto da tre a otto monomeri di zucchero. Essi hanno una riduzione del lattosio (Gal-β1, 4-Glc) fine e sono ulteriormente allungate da legami glicosidici (β-1,3 - o β-1,6-) di glucosio (cromatografia gaseoliquido), galattosio (Gal) o N-acetilglucosamina (GlcNAc). Inoltre, fucosio (Fuc, α-1,2 - o α-1,3-) o acido sialico (Sia o NeuAc, α-2,3 - o α-2,6-) residui vengono spesso aggiunti1.
Analisi corrente di oligosaccaridi e altri carboidrati sono limitato a velocità effettiva e la portata dalla necessità per spettrometria crom....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Protocollo
1. cella condizioni di cultura e induzione
Nota: Negli esperimenti seguenti, vengono utilizzati tre ceppi: e. coli BL21 (DE3) con un vettore vuoto, e. coli BL21 (DE3) con plasmidi pAfcA14 e pET28:green proteina fluorescente (GFP) ed e. coli BL21 (DE3) con plasmidi pAfcB14 e pET28:GFP. Tutti i ceppi sono coltivati in brodo di Luria-Bertani (LB) o media minimi con gli antibiotici adatti. Preparare soluzioni di riserva di 1.000 x kanamicina (50 mg/mL) e carbenicillina (100 mg/mL) in deionizzata (DI) di acqua.
-
Preparazione dei terreni
- Preparare i supporti LB ....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Risultati
Abbiamo progettato un biosensore intera cellula specifico a 2'-FL che può essere utilizzato in combinazione con la produzione biotecnologica dell'oligosaccaride. Questo si basa sulla scissione enzimatica specifica di modificare terminali zuccheri generazione di lattosio e quindi l'attivazione dell'operone lac , che conduce all'espressione di una proteina fluorescente reporter sotto un promotore inducibile di lattosio, in proporzione alla quantità di 2'-FL. Per dimostrare la sua s.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
Vi presentiamo una strategia ad alta produttività per la rilevazione di specifici del sollevatore di fucosylated gli oligosaccaridi del latte umano. Ciò è stata compiuta con la costruzione di biosensori di cellule intere di genetica e. coli che dopo induzione con specifici glicani rispondere con un segnale fluorescente. Il protocollo inoltre dettagli su come il biosensore può essere utilizzato per rilevare e quantificare HMOs in un metabolicamente derivati dal ceppo batterico.
Il nost.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto dai fondi di avvio di Iowa State University. F.E. è stato parzialmente finanziato dal NSF Trinect Fellowship e Manley Hoppe cattedra. T.J.M. è stato parzialmente sostenuto da Karen e Denny Vaughn Facoltà Fellowship. Gli autori ringraziano Iowa State University flusso Cytometry Facility e il laboratorio di ricerca metabolomica W.M. Keck per assistenza con fluorescenza e studi di LC-MS.
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 2'-fucosillattosio | Carbosynth | 41263-94-9 | |
| 3-fucosillattosio | Carbosynth | 41312-47-4 | |
| Agar | Fisher Scientific | BP9744500 | |
| Cloruro di calcio, diidrato | Fisher Scientific | C79-500 | |
| Carbenicillina | Fisher Scientific | BP26481 | |
| Destrosio (D-glucosio), anidro | Fisher Scientific | D16-1 | |
| Citometro a flusso | BD | FACSCanto Plus RUO | |
| HPLC | Agilent Technologies | Sistema HPLC serie 1100 | |
| Colonna HPLC | Luna | C18 Colonna a fase inversa | |
| Kanamicina | Fisher Scientific | ||
| libbra di brodo, mugnaio | Fisher Scientific | 12-795-027 | |
| Lattosio | Fisher Scientific | 64044-51-5 | |
| M9, sali minimi, 5x | Sigma-Aldrich | M6030 | |
| solfato di magnesio, anidro | Fisher Scientific | M65-500 | |
| MS | Agilent Technologies | Rivelatore SL a trappola selettiva di massa | |
| Cloruro di sodio | Sigma-Aldrich | 7647-14-5 | |
| Sodio fosfato bibasico | Sigma-Aldrich | 7558-79-4 | |
| Sodio fosfato monobasico | Sigma-Aldrich | 13472-35-0 |
Riferimenti
- Ninonuevo, M. R., et al. A strategy for annotating the human milk glycome. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 54 (20), 7471-7480 (2006).
- Kailemia, M. J., Ruhaak, L. R., Lebrilla, C. B., Amster, I. J. Oligosaccharide analysis by mass ....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
