Analisi dei complessi della catena respiratoria mitocondriale in cellule umane coltivate mediante elettroforesi in Gel di poliacrilammide nativo blu e Immunoblotting

Sommario

Questo protocollo dimostra l'analisi dei complessi della catena respiratoria mitocondriale mediante elettroforesi in gel di poliacrilammide nativo blu. Qui è descritto il metodo applicato alle cellule umane coltivate.

Abstract

La respirazione mitocondriale viene eseguita dai complessi della fosforilazione ossidativa (OXPHOS) all'interno dei mitocondri. Fattori interni ed ambientali possono perturbare il montaggio e la stabilità dei complessi della fosforilazione ossidativa. Questo protocollo descrive l'analisi dei complessi della catena respiratoria mitocondriale mediante elettroforesi Natale blu del gel di poliacrilammide (BN-PAGE) in applicazione alle cellule umane coltivate. In primo luogo, i mitocondri sono estratti dalle cellule utilizzando digitonina, quindi utilizzando lauryl maltoside, i complessi OXPHOS intatti sono isolati dalle membrane mitocondriali. I complessi OXPHOS quindi vengono risolti tramite l'elettroforesi del gel di pendenza in presenza del colorante caricato negativamente, Coomassie blu, che impedisce l'aggregazione proteica e garantisce la mobilità elettroforetica dei complessi della proteina verso il catodo. Infine, i complessi OXPHOS sono rilevati dall'immunoblotting standard. Così, BN-PAGE è una tecnica conveniente ed economica che può essere utilizzata per valutare l'assemblaggio di complessi OXPHOS intere, in contrasto con la base SDS-PAGE, permettendo lo studio di solo singoli OXPHOS complessa unità secondarie.

Introduzione

I mitocondri sono organelli multifunzionali che gioca un ruolo importante nella produzione di energia, regolazione del metabolismo cellulare, segnalazione, apoptosi, invecchiamento, ecc.^1,2,3. La produzione di energia nei mitocondri si basa sulla funzione di fosforilazione ossidativa che le coppie di respirazione con sintesi di ATP. Nelle cellule umane, il sistema di fosforilazione ossidativa mitocondriale (OXPHOS) è composto da cinque complessi. Complessi I-IV crea un gradiente elettrochimico protonico nello spazio intermembrana mitocondriale che viene utilizzato dal complesso V per produrre ATP. Ogni complesso OXPHOS è multimerici e, tranne II complesso, composto da subunità codificate da geni sia nucleari che mitocondriali. Eventuali difetti nei componenti principali dei complessi OXPHOS causati da mutazioni o stress ambientale possono perturbare l'assemblaggio e la funzionalità del sistema di fosforilazione ossidativa. Inoltre, il corretto assemblaggio dei complessi OXPHOS funzionale richiede un gran numero di assemblaggio fattori^4,5,6.

L'elettroforesi Natale blu del gel di poliacrilammide (BN-PAGE) è una tecnica fondamentale consentendo l'analisi dei complessi della proteina intatto e può essere usato per studiare l'assemblaggio di complessi OXPHOS. In primo luogo, i mitocondri sono isolati dalle cellule di digitonina, che è un detergente delicato che permeabilizes la membrana plasmatica delle cellule. Quindi, utilizzando lauryl maltoside, complessi di OXPHOS vengono rilasciati dalle membrane mitocondriali. Utilizzando l'elettroforesi del gel di pendenza, i complessi OXPHOS sono separati secondo la loro massa. Coomassie blu G-250 (non R-250) aggiunto per la sample buffer e il buffer di catodo blu si dissocia associazioni detergente-labile ma conserva catena respiratoria singoli complessi intatti⁸. Durante l'elettroforesi, il buffer di catodo blu contenente colorante viene sostituito dal buffer catodo senza tintura, che assicura il trasferimento efficiente dei complessi della fosforilazione ossidativa per la membrana PVDF⁸. Per visualizzare i complessi di OXPHOS, la membrana PVDF è in sequenza incubata con anticorpi corrispondenti per le subunità selezionate dei cinque complessi OXPHOS.

Il metodo descritto qui con alcune modifiche può essere applicato a qualsiasi cellule coltivate. Inoltre, questo metodo può essere utilizzato per l'analisi di complessi OXPHOS in mitocondri isolati da campioni di tessuto⁹. BN-PAGE richiede almeno 5-10 µ g di mitocondri per ciascun campione per corsa. Utilizzando il metodo descritto qui, 500.000 cellule ad esempio HEK293, SH-SY5Y coltivate o cellule 143B possono produrre circa 10 µ g di mitocondri. Tuttavia, una quantità sufficiente di cellule per l'analisi BN dipende dal tipo specifico delle cellule.

Il metodo più comune per lo studio di proteine mitocondriali OXPHOS è SDS-PAGE e western blotting. Tuttavia, SDS-PAGE permette di studiare solo singole subunità OXPHOS e, in contrasto con BN-PAGE, non può essere utilizzato per valutare l'assemblaggio di complessi OXPHOS intero. Chiara nativo-pagina separa complessi di proteine in condizioni native senza la presenza di colorante caricato negativamente e ha una risoluzione significativamente inferiore rispetto ai BN-PAGE. Tuttavia, chiara nativo-pagina è più mite che BN-PAGE quindi può mantenere il labile assemblaggio supramolecolare dei complessi della proteina come supercomplessi OXPHOS che si dissociano sotto le condizioni di BN-PAGE¹⁰. In questo protocollo, il gel di pendenza viene utilizzato per separare i complessi; Tuttavia, in alternativa, separazione di gradiente non può essere utilizzato se il produttore di gradiente relativamente costoso non è disponibili¹¹.

Importante, il metodo qui descritto permette di analizzare l'assemblaggio di complessi OXPHOS, mentre la funzionalità dei complessi non è valutata. Un'alta risoluzione BN-PAGE seguita da attività in gel dosaggio¹¹ , nonché l'analisi spettrofotometrica attività enzimatica dei complessi mitocondriali¹² sono tecniche efficienti per l'analisi funzionale dei complessi OXPHOS. Tuttavia, entrambi questi metodi di analisi non l'assemblaggio di complessi OXPHOS.

Così, BN-PAGE è il metodo ottimo per indagare l'assemblaggio dei singoli OXPHOS complessi. Ad esempio, alcune patologie mitocondriali, come la neuropatia ottica ereditaria di Leber (LHON), encefalopatia mitocondriale con acidosi lattica e colpo-come gli episodi (MELAS), sono associati con montaggio alterato di uno o più componenti della OXPHOS sistema⁵. Utilizzando il metodo di BN-PAGE descritto qui, possono essere studiati i meccanismi molecolari delle malattie mitocondriali.

Protocollo

spaNOTE: questo protocollo è basato su una pubblicazione associata di Hilander et al.¹³ .

1. preparazione del buffer e soluzioni

Nota: Tutti i buffer e soluzioni utilizzate nel protocollo sono riassunti nella tabella 1. I volumi dato dei buffer sono sufficienti per preparare ed eseguire 10 campioni. Tutti i buffer possono essere conservati a + 4 ° C per fino a un anno.

1. Preparare 20 mL di tampone di gel contenente acido aminocaproico di 1,5 M, 150 mM Bis-tris in acqua distillata (dH₂O): 3x. Regolare il pH a 7.0.
2. Preparare 10 mL di acido aminocaproico 2m in dH₂O.
3. Preparare 1 mL di tampone mitocondriale combinando le seguenti: 0,5 mL di buffer di gel, 0,5 mL di acido aminocaproico 2 M e 4 µ l di 500 mM EDTA: 3x.
4. Preparare 1.000 mL di tampone di catodo contenente 15 mM di Bis-tris e 50 mM di tricine in dH₂O. regolare il pH a 7,0.
   1. Preparare 200 mL di buffer di catodo blu con l'aggiunta di 0,04 g di blu di Coomassie G-250 a 200 mL di buffer di catodo.
5. Preparare 1.000 mL di tampone di anodo contenente 50 mM Bis-tris in dH₂O. regolare il pH a 7,0.
6. Preparare 2,5 mL di tampone di campioni contenenti acido aminocaproico 750 mM e 5% azzurro di Coomassie G-250 in dH₂O.

2. preparazione dei lysates mitocondriale

1. Piastra delle cellule il giorno prima della raccolta. Per cellule HEK293 o 143B, uso Dulbecco modificato medio dell'Aquila (DMEM) con 10% siero bovino fetale, 1% L-Glutammina, 100 mg/mL di penicillina e 100 mg/mL di streptomicina. Crescere le cellule in un'incubatrice di coltura cellulare a 37 ° C in atmosfera umidificata 5% CO₂ . Assicurarsi che ci siano almeno 500.000 cellule per ogni campione il giorno della raccolta.
2. Lavare delicatamente le cellule una volta con PBS ghiacciata. Evitare di staccare le cellule dalla piastra. Raschiare le cellule e appallottolarli a 800 x g per 10 min a + 4 ° C.
3. Lavare il pellet cellulare due volte con PBS ghiacciata e centrifugare come descritto al punto 2.2. Misurare la concentrazione di proteine con il metodo di Bradford utilizzando un kit commerciale. Agglomerare le cellule a 800 x g per 10 min a + 4 ° C.
   Nota: Dopo la raccolta delle cellule, eseguire tutti i passaggi a + 4 ° C e fare non vortice.
4. Preparare 20 mL di PBS con inibitore della proteasi aggiungendo 200 µ l di inibitore di proteasi x 100 a 20 mL di PBS. Tenere il ghiaccio. Risospendere le cellule in PBS con inibitore di proteasi a una concentrazione finale di proteine di 5 mg/mL.
   1. Per calcolare il volume di PBS con inibitore della proteasi necessaria per risospendere le cellule a 5 mg/mL, calcolare la quantità di proteina in ogni campione. Per questo calcolo, utilizzare la concentrazione nella proteina misurata al punto 2.3 e il volume di PBS utilizzato per risospendere le cellule dopo il lavaggio al punto 2.3.
5. Preparare 1 mL di 3,3 mM digitonina in PBS con inibitore della proteasi. Aggiungere della digitonina 3,3 mM ad una concentrazione finale di 1,65 mM. Mescolare bene e incubare in ghiaccio per 5 min.
   1. Per preparare 1 mL di 3,3 mM digitonina in PBS con inibitore della proteasi, sciogliere 4 mg di digitonina in 1 mL di PBS a 100 ° C fino a quando nessun precipitato è immediatamente visibile e fresco su ghiaccio. Aggiungere 10 µ l di inibitore di proteasi x 100 a 1 mL di soluzione di digitonina.
      Nota: Utilizzare solo una soluzione fresca di digitonina.
      Attenzione: Digitonina è tossica! Utilizzare un camice da laboratorio, guanti e mascherina facciale.
6. Consente di aggiungere il volume finale di 1,5 mL PBS con inibitore della proteinasi (preparata al punto 2.4). Centrifuga a 10.000 x g per 10 min a + 4 ° C. Eliminare il surnatante. In questo passaggio, i mitocondri sono pellettati.
7. Risospendere il pellet mitocondriale nel buffer mitocondriale. Il volume di tampone mitocondriale è la metà del volume di PBS nel passaggio 2.4.
8. Preparare fresco 10% lauryl maltoside in PBS contenente inibitore della proteasi (preparata al punto 2.4). 1 mL è sufficiente per 10 campioni. Aggiungere 10% lauryl maltoside alla concentrazione finale dell'1%. Incubare in ghiaccio per 15 minuti (questo passaggio può essere più lungo fino a un paio d'ore).
9. Centrifuga a 20.000 x g per 20 minuti a + 4 ° C. Raccogliere il surnatante in una nuova provetta. Misurare la concentrazione di proteine con il metodo di Bradford utilizza un kit. Aggiungere tampone del campione, un volume che è la metà del volume di lauril maltoside utilizzato nel passaggio 2.8. I campioni possono essere conservati a-80 ° C fino a 6 mesi.

3. preparazione del gel di pendenza per BN-PAGE

1. Versare il gel di pendenza per BN-PAGE a temperatura ambiente. Collocare il creatore di sfumato su un piatto di mescolare e collegarlo con il tubo flessibile alla pompa peristaltica. Allegare un'infusione impostato con l'ago al tubo. Posto un agitatore magnetico nella camera prossimale del gradiente maker. Lavare il tubo con dH₂O alla velocità massima della pompa per 10 min.
2. Svuotare il tubo e il creatore di gradiente. Utilizzare una pipetta per rimuovere qualsiasi residuo di dH₂O nel canale tra alloggiamenti del gradiente maker. Chiudere il canale e il tubo con la valvola.
3. Mediante morsetti e colata frame assemblare due lastre di vetro nel supporto, che ha un foro sul fondo, e posizionarlo sul cavalletto. Assicurarsi che è più o meno su una superficie diritta con un bilancio idrico. Posto l'ago collegato alla tubazione di tra le lastre di vetro.
4. Preparare soluzioni di gel 6% e 15% (tabella 2). Tenere il ghiaccio. Aggiungere ammonio persolfato (APS) e tetramethylenediamine (TEMED) (iniziano a polimerizzazione) ultimo. Mescolare delicatamente per evitare di fare aria bolle.
5. Caricare l'estremità prossimale dell'alloggiamento della tubazione gradiente-gel-miscelatore con gel di 6% e l'estremità distale con gel 15%. Il volume totale del gel deve essere uguale al volume del gel di separazione tra le lastre di vetro. Di conseguenza, è possibile utilizzare 2,6 mL di gel di 6% e 2,1 mL di gel 15% al mixer del gel di pendenza per gel uno 8,3 x 7,3 cm dimensioni.
6. Passare sull'agitatore magnetico e aprire il tubo e il canale tra le camere del gradiente maker. Accendere immediatamente la pompa peristaltica a 5 mL/min riempire le lastre di vetro e non consentono le bolle per inserire il gel. Rimuovere l'ago quando non c'è nessun gel della tubazione.
7. Sovrapposizione delicatamente il gel con dH₂O. Keep il gel a temperatura ambiente per almeno 1 h per la polimerizzazione.
8. Immediatamente dopo aver versato il gel, lavare il tubo di riempimento sfumature sezioni con dH₂O e utilizzando la pompa peristaltica a velocità massima. Quando si prepara il gel due e più, sempre di pulire il sistema in mezzo.
9. Preparare 1 buffer di gel x mescolando 3 mL di buffer di gel: 3x e aggiungere 6 mL di dH₂O. Remove dH₂O dalla superficie del gel con carta da filtro delicatamente. Lavare la superficie del gel con 1x buffer di gel. Rimuovere delicatamente 1 x gel tampone con carta da filtro.
   1. Evitare di fibre dalla carta da filtro sul gel. Per garantire questo, tagliare la carta in piccoli pezzi con le forbici, ma non strappare la carta.
10. Posizionate il pettine tra le lastre di vetro, ma non immergere completamente per essere in grado di versare il gel d'impilamento sotto il pettine. Preparare il 4% stacking gel (tabella 2). Aggiungere APS e TEMED ultimo come iniziano a polimerizzazione facilmente. Mescolare delicatamente evitando bolle d'aria.
11. Sovrapporre il gel d'impilamento, evitando le bolle sotto il pettine e immergere completamente il pettine. Lasciate che il gel d'impilamento polimerizzare per almeno 30 minuti togliere il pettine e lavare i pozzetti con 1x buffer di gel utilizzando una pipetta.
    1. Dopo polimerizzazione, il gel può essere conservato a + 4 ° C per un paio di giorni. Per memorizzare il gel, avvolgere il gel in carta imbevuto con plastica e dH₂O pellicola per evitare l'essiccazione del gel.

4. blu elettroforesi nativa

Nota: Per evitare il degrado di OXPHOS complessi eseguire l'elettroforesi a + 4 ° C. Utilizzare i buffer di pre-refrigerati.

1. Caricare il vassoio del gel con il buffer di catodo blu fino al fondo dei pozzetti. Caricamento dei campioni è più facile quando la cassetta non è riempita fino alla cima. Lavare i pozzetti con il buffer di catodo blu e poi riempire i pozzetti con il buffer di catodo blu utilizzando pipetta.
2. Caricare i campioni (5-30 µ g di proteina) nei pozzetti. Riempire delicatamente il vassoio del gel nella parte superiore con il buffer di catodo blu e il serbatoio con buffer di anodo.
3. Esegua il gel per 15 min a una tensione costante di 40 V. Quindi aumentare la tensione a 80 V (o usare una corrente costante di 6 mA), non superiore a 10 mA. Esegua il gel fino a quando il colorante raggiunge 2/3 della lunghezza del gel.
4. Sostituire il buffer di catodo blu con buffer di catodo e continuare elettroforesi fino a quando la parte anteriore della tintura è esaurita. In totale, l'elettroforesi dura circa 3 ore.
5. Recuperare le lastre di vetro e trasferire le proteine alla membrana del polivinilidene fluoruro (PVDF) semi-asciugare tamponando. Utilizzare una tensione costante di 25 V e una corrente limitata a 1.0 A per 30 min.
   1. In alternativa, utilizzare macchiare bagnato per trasferire i complessi OXPHOS ad una membrana PVDF.
6. Continuare con il blocco dell'incubazione della membrana e dell'anticorpo secondo il protocollo standard immunoblotting. Utilizzare gli anticorpi primari contro la subunità dei complessi OXPHOS in sequenza.
   Nota: ad esempio, utilizzare l'anticorpo anti-NDUFA9 (1: 2000) per il complesso I, anticorpi anti-SDHA (1: 2000) per complesso II, anticorpo anti-UQCRC2 (1: 1000) per complesso III, anticorpo anti-COX1 (1: 2000) per anticorpo complesso IV e anti-ATP5A (1: 2000) per V complessa. L'elenco degli anticorpi è presentato nella Tabella materiali.

Risultati

Usando BN-PAGE, difetti nell'assemblaggio di complessi mitocondriali OXPHOS possono essere studiati. Figura 1a Mostra l'assemblaggio di complessi della catena respiratoria in cellule di neuroblastoma umano (SH-SY5Y) trattate con cloramfenicolo, che specificamente inibisce la traduzione di mtDNA-messe subunità OXPHOS. Cloramfenicolo impoverito i complessi OXPHOS che conteneva mitochondrially codificato subunità (complessi I, III, IV; Figura 1A), mentre il complesso II, che è esclusivamente codificate da geni nucleari, era compensatorily sovraregolati. Complesso V non era immunoblotted qui.

Più cicli di gelo-disgelo distruggono complessi OXPHOS. Figura 1B dimostra la degradazione dei complessi OXPHOS dai cicli di gelo-disgelo. Complessi respiratori mitocondriali nell'esempio 3 che sono stati sottoposti a più cicli di gelo-disgelo hanno una minore intensità di banda e sono spostati in confronto gli stessi campioni, che sono stati congelati in una sola volta. Un'immagine non tagliata macchia occidentale di Figura 1B è illustrata nella integrativa Figura 1.

La qualità del gel è importante per le bande nitide e chiare. Figura C 1 Mostra un immunoblot da un gel che ha fatto non polimerizza bene. Stripping della membrana può colpire anche la rilevazione dei complessi della fosforilazione ossidativa. Nella Figura 1 D, complesso io stavo rilevato prima o dopo la sverniciatura. Il rapporto segnale-rumore è molto più basso dopo stripping.

Figura 1. BN-PAGE immunoblots dagli esperimenti di successo e sub-ottimali. (A) complessi di svuotamento di OXPHOS dall'inibitore della traduzione mitocondriale. Cellule di neuroblastoma umano (SH-SY5Y) sono state trattate con cloramfenicolo (CAP) per 48 ore. CTRL, cellule di controllo senza trattamento di cloramfenicolo. Il pannello inferiore mostra la quantificazione del immunoblot. Il valore del controllo è preso come 1 (visualizzata come una linea tratteggiata). I dati sono presentati come media ± DS, n = 3, * P < 0,0001 rispetto al controllo utilizzando spaiati t-test di Student. Complessi di rottura di OXPHOS ((B)) di più cicli di gelo-disgelo. Campioni 1-3 sono stati preparati dalle cellule di osteosarcoma umano (143B) nelle stesse condizioni. Numero di campioni 1 e 2 sono stati congelati e fuse in una sola volta, mentre il numero di esempio 3 ha subito quattro cicli di gelo-disgelo. (C) BN-PAGE immunoblots di complessi OXPHOS isolati da cellule HEK293. L'incollamento delle fasce è causato da scarsa qualità del gel. (D) effetto di stripping sulla rilevazione dei complessi della fosforilazione ossidativa. Rilevazione del complesso I in cellule di neuroblastoma umano (SH-SY5Y) prima e dopo la rimozione della membrana stessa. Complessi di OXPHOS sono stati rilevati usando l'anticorpo anti-NDUFA9 (complesso I), dell'anticorpo anti-SDHA (complesso II), anticorpo anti-UQCRC2 (complesso III) e l'anticorpo anti-COX1 (complesso IV). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Buffer o soluzione	Composizione	Ricetta
3 x gel tampone	1.5 acido aminocaproico M	3,94 g di acido aminocaproico
	150 mM Bis-tris	0,63 g di Bis-tris
	dH,2O	Aggiungere dH2O 20 mL
	pH 7.0	Aggiustare il pH a 7.0
Buffer di catodo	15 mM Bis-tris	3,14 g di Bis-tris
	tricine 50 mM	8,96 g di tricine
	dH,2O	Aggiungere dH2O a 1000 mL
	pH 7.0	Aggiustare il pH a 7.0
Buffer di catodo blu	0,02% coomassie blu G	0,04 g di Serva blu G
	15 mM Bis-tris	200 mL di buffer di catodo
	tricine 50 mM
	dH,2O
	pH 7.0
Buffer di anodo	50 mM Bis-tris	20,93 g
	dH,2O	Aggiungere dH2O a 2000 mL
	pH 7.0	Aggiustare il pH a 7.0
Buffer di mitocondriale	1,75 acido aminocaproico M	0,5 mL di buffer di gel: 3x
	75 mM Bis-tris	0,5 mL di acido aminocaproico 2m
	2 mM EDTA	4 µ l di 500 mM EDTA
	dH,2O	-
	pH 7.0	-
Tampone del campione	acido aminocaproico 750 mM	0,94 mL di acido aminocaproico 2m
	capoluogo di 5% blu G	0,125 g di Serva blu G
	dH,2O	Aggiungere dH2O 2,5 mL
Acido aminocaproico 2m	Acido aminocaproico 2m	2.62 g di acido aminocaproico
	dH,2O	Aggiungere dH2O 10 mL

Tabella 1. Buffer e soluzioni utilizzate per BN-PAGE.

Blu gel nativo	6% gel di separazione	15% gel di separazione	Stacking gel 4%
3 x gel tampone	3,3 mL	3,3 mL	1,64 mL
40% acrilammide/Bis 37.5:1	1,5 mL	3,75 mL	0,5 mL
dH,2O	5,14 mL	0,93 mL	2,77 mL
Glicerolo	0	2 mL	0
Persolfato di ammonio 10% *	60 Μ l	10 Μ l	60 Μ l
TEMED	4 Μ l	2 Μ l	6 Μ l
Volume totale	10 mL	10 mL	5 mL
* Rendere sempre fresco 10% ammonio persolfato in dH2O

Tabella 2. Ricette di gel per BN-PAGE.

Complementare Figura 1. immagine non tagliata macchia occidentale di Figura 1B. Per favore clicca qui per scaricare questa figura.

Discussione

Una delle parti più critiche del protocollo è quello di mantenere intatti complessi di OXPHOS durante la preparazione del campione, deposito ed elettroforesi del gel. Così, i mitocondri devono essere isolati a + 4 ° C e i campioni non dovrebbero subire cicli di gelo-disgelo. Complessi di OXPHOS possono tollerare solo un ciclo di gelo-disgelo durante l'intera procedura. Più cicli di gelo-disgelo distruggono complessi OXPHOS (Figura 1B). Controllo e campioni sperimentali che devono essere confrontati dovrebbero essere preparati in parallelo per evitare eventuali differenze nelle condizioni di conservazione, che potrebbero dare risultati fuorvianti. Se non è possibile eseguire tutti i passaggi del protocollo in parallelo con tutti i campioni, si consiglia di congelare palline delle cellule lavate a-80 ° C (passo 1.4 in questo protocollo) e successivamente svolgere il resto del protocollo per tutti i campioni insieme almeno fino al gel elec trophoresis. Particolare attenzione dovrebbe essere rivolta alla pulizia dell'apparato elettroforesi (serbatoio, cassetta). Se l'apparecchio stesso è usato per SDS-PAGE, lavare molto bene prima di BN-PAGE. Qualsiasi residuo SDS può provocare la dissociazione dei complessi OXPHOS durante l'elettroforesi.

Gel di alta qualità gradiente sono un'altra parte fondamentale del protocollo. Gel prefabbricati per PAGE nativo blu sono disponibili in commercio; Tuttavia, non è consigliabile utilizzarli, poiché i buffer utilizzati per gel commerciale potrebbero avere una composizione, che è diversa dai buffer di campione. Il gradiente del gel utilizzato qui (6-15%) è ottimo per la separazione dei singoli complessi OXPHOS. Per rilevare strutture supramolecolari di ordine superiore di OXPHOS, noto anche come respiratoire supercomplessi¹⁴, alcune ottimizzazione è richiesto¹¹.

Per la visualizzazione di OXPHOS complessi utilizzano anticorpi specifici in sequenza, in base alle loro proprietà. Ad esempio, utilizzare innanzitutto l'anticorpo che dà il segnale più debole e l'anticorpo con il segnale più forte Ultima. Ciò è importante poiché lo stripping indebolisce la rilevazione (Figura 1). La composizione dei complessi della catena respiratoria può essere studiata se dopo BN-PAGE gel viene sottoposto per la seconda dimensione SDS-PAGE¹⁵.

Il protocollo descritto qui suggerisce usando gli anticorpi contro i singoli complessi di OXPHOS in sequenza. Tuttavia, l'anticorpo OXPHOS commercialmente disponibile cocktail consente di rilevare contemporaneamente tutti e cinque i complessi OXPHOS. Tuttavia, per essere in grado di rilevare in modo incompleto assemblato OXPHOS complessi e definire la loro identità, anticorpi contro i complessi di OXPHOS individuali dovrebbero essere usati in sequenza. Questo passaggio è che richiede tempo; Tuttavia, può essere essenziale per la sperimentazione di modelli e nuove condizioni sperimentali.

La concentrazione di digitonina utilizzata per isolamento mitocondriale dovrebbe essere ottimizzata per il tipo di cella specifica. Come detergente, digitonina permeabilizes membrane cellulari. La concentrazione ottimale di digitonina permeabilizes efficacemente la membrana plasmatica delle cellule lasciando intatte le membrane mitocondriali. Concentrazione troppo bassa di digitonina causa elevata contaminazione degli estratti mitocondriali mentre concentrazione troppo elevata danneggia le membrane mitocondriali e riduce la resa totale mitocondriale. Il rapporto ottimale della digitonina/proteine (g/g) varia da 0,3 a 1. Analisi di Western blot di proteine estratte da surnatanti e pellet può essere utilizzato per testare la concentrazione ottimale di digitonina¹⁶.

Questo protocollo non include proteine caricamento controllo su immunoblot; di conseguenza, la concentrazione nella proteina di estratti complessi dovrebbe essere attentamente misurata almeno in triplici copie per garantire uguale carico. Inoltre, i campioni possono essere eseguiti in BN-PAGE in replicati. Se l'assemblaggio di complessi OXPHOS selettive è alterata, inalterati complessi possono servire come controlli di caricamento.

La stima della massa molecolare dei complessi proteici in BN-PAGE è impegnativo¹⁸. Il protocollo corrente non include il marcatore di peso molecolare; Pertanto, per stimare l'assemblaggio dei complessi OXPHOS, i campioni di controllo contenenti complessi inalterati dovrebbero sempre essere inclusi nell'analisi. I campioni di controllo per BN-PAGE sono di solito cellule di tipo non trattata o selvatici.

Il metodo qui presentato è ottimizzato per la rilevazione dei complessi della catena respiratoria mitocondriale; Tuttavia, può anche essere applicato per la valutazione dell'oligomerizzazione di proteine mitocondriali¹⁹. Inoltre, il tasso di assemblaggio dei complessi OXPHOS può essere studiato prima subunità mitocondriale codificato che esaurisce i complessi contenenti cloramfenicolo e seguendo le loro recupero dopo la rimozione del cloramfenicolo¹⁰. Così, BN-PAGE può essere utilizzato per valutare i livelli allo stato stazionario e l'assemblaggio di OXPHOS per diverse applicazioni tra cui diagnostica molecolare delle malattie mitocondriali umane^9,11.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Piastre cellulari da 100 mm	Thermo Fisher Scientific	130182
40% Acrilammide/Bis 37,5:1	Bio-Rad	161-0148
Acido aminocaproico	Sigma	A2504
Persolfato di ammonio	Sigma	A3678
Anti-ATP5A	Abcam	14748	Subunità del complesso V
Anti-MTCOI	Abcam	14705	Subunità del complesso VI
Anti-NDUFA9	Abcam	14713	Subunità del complesso I
Anti-SDHA	Abcam	14715	Subunità del complesso II
Anti-UQCRC2	Abcam	14745	Subunità del complesso III
Bis-tris	Sigma	B7535
Kit per il dosaggio delle proteine Bradford	BioRad	5000006
Raschietti cellulari	Fisher	11597692
Coomassie blu G250 (Serva Blue G)	Serva	35050
Digitonin	Sigma	D141
DMEM	Lonza	12-614F/12
EDTA	Life Technologies	15575-038
FBS	Life Technologies	10270106
Siero fetale bovino	Life Tecnologie	10270106
Glicerolo	(Sigma	G5516
Gradient maker	Bio-Rad	1654120
Lauryl maltoside (n-Dodecyl β-D-maltoside)	Sigma	D4641
L-glutammina	Life Technologies	25030024
L-glutammina	Gibco	25030
N,N,N′,N′-Tetrametiletilendiammina (TEMED)	Sigma	T9281
PBS	Life Technologies	BE17-516F
Penicillina/Streptomicina	Lonza	17-602E
Penicillina/streptomicina	Gibco	15140
Alimentatore	GE Healthcare	EPS 301
Inibitori della proteasi	Thermo Scientific	10137963
Trans-blot turbo mini PVDF	BioRad	1704156
Tricine	Sigma	T9784
Tripsina-EDTA	Gibco	15400054
Apparecchio per elettroforesi verticale	BioRad	1658004