Method Article

Modello di matrice extracellulare tridimensionale dell'osso per Osteosarcoma

DOI:

10.3791/59271

⸱

April 12th, 2019

 ,  , 
1MOE Key Laboratory of Gene Function and Regulation, School of Life Sciences, Sun Yat-sen University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il modello di matrice extracellulare (BEM) dell'osso per osteosarcoma (OS) è ben consolidata e mostrato qui. Può essere utilizzato come impalcatura adatta per che imita tumore primario crescita in vitro e fornendo un modello ideale per studiare l'eterogeneità istologica e cytogenic del sistema operativo.

Abstract

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Osteosarcoma (OS) è il più comune e un tumore altamente aggressivo e primari dell'osso. È caratterizzato da variazioni anatomiche e istologiche assieme alle difficoltà diagnostica o prognostica. OS comprende cellule tumorali genotipico e fenotipico eterogenea. Elementi del microambiente dell'osso sono dimostrati di account per progressione di malattia e di eterogeneità del tumore. Matrice ossea extracellulare (BEM) conserva le matrici microstrutturali e componenti biochimici della matrice extracellulare nativa. Questa nicchia di tessuto-specifica fornisce un'impalcatura favorevole e a lungo termine per proliferazione e semina cellulare di OS. Questo articolo fornisce un protocollo per la preparazione del modello BEM e la sua ulteriore applicazione sperimentale. Le cellule OS possono crescere e differenziarsi in fenotipi più coerenti con la complessità istopatologica di campioni clinici di OS. Il modello consente inoltre la visualizzazione delle diverse morfologie e la loro associazione con alterazioni genetiche e meccanismi di regolazione sottostante. Come omologo umano OS, questo modello di BEM-OS possa essere sviluppato e applicato alla patologia e ricerca clinica del sistema operativo.

Introduction

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Osteosarcoma (OS) si presenta solitamente in zone, le metafisi delle ossa lunghe, in attiva crescita durante l'adolescenza. Più dell'80% dei siti colpiti da OS hanno preferenza per la metafisi della tibia prossimale e Omero prossimale, nonché sia distale e prossimale di femore, corrispondente alla posizione della crescita piastra1. OS comprende molteplici sottotipi di cellule con proprietà mesenchymal e considerevole diversità nelle caratteristiche istologiche e grado. Evidenze supportano le cellule staminali mesenchimali (MSCs), precursori impegnati osteoblasti e periciti come le cellule di origine2,3,4,5. Queste cellule possono accumularsi le alterazioni genetiche o epigenetiche e dar luogo a OS sotto l'influenza di determinati segnali microambiente osseo. Meccanismi sia intrinseci sia estrinseci causare l'instabilità genomica e l'eterogeneità del sistema operativo, con molteplici fenotipi morfologici e clinici6,7. Per terapie individualizzate o screening di nuovi farmaci, nuovi modelli devono essere generati per contro eterogeneità o altri disordini clinici.

OS è un tumore solido maligno intraosseo. La complessità e l'attività del microambiente elementi circostanti conferire differenze fenotipiche e funzionali sulle cellule OS in posizioni diverse di un tumore. Matrice ossea extracellulare (BEM) fornisce un'impalcatura strutturale e biochimica per deposizione minerale e rimodellamento osseo. La parte organica della matrice extracellulare (ECM) consiste principalmente di tipo I collagene secreto dalle cellule osteoblastic lignaggio, mentre la relativa parte mineralizzate è composto da fosfato di calcio sotto forma di idrossiapatite8. Il ruolo dinamico delle reti di ECM è di regolare adesione cellulare, differenziazione, cross-talk e tessuto funzione manutenzione9.

Demineralizzata idrogeli BEM ed ECM sono stati utilizzati con successo nella coltura delle cellule e possono migliorare la proliferazione delle cellule10,11. Sintetizzato osso-come ECM può regolare la dimensione del pool, le decisioni destino e progressione di lignaggio di MSCs12,13,14. Inoltre, risultati della prova relativa importanza clinica per fornire attività osteogenica di processi cellulari stimolanti durante osso formazione e rigenerazione15,16,17.

In questo articolo, il nostro gruppo costituisce un modello modificato e alternativa favorevole per tridimensionale coltura a lungo termine. Cellule di OS iniettate il BEM tessuto-derivato presentano un fenotipo eterogeneo mesenchymal prontamente rispetto alla plastica culture bidimensionale. BEM derivato da Visualizza site-specific del tessuto omologo relativo vantaggio drammatico come essendo una nicchia nativa per OS cellule in vitro e ha un grande potenziale nella ricerca teorica e clinica di OS. Questa piattaforma BEM caratterizzata è semplice ma efficiente per la ricerca in vitro e può essere prorogata nel modellare i cancri multipli.

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Protocol

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Uso e cura degli animali sono condotti secondo l'istituti nazionali di salute Guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio (pubblicazione NIH No. 80-23, riveduta nel 1996), previa approvazione del Comitato etica animale di Sun Yat-sen University.

1. osso preparazione

  1. Ottenere 4 ai topi BALB/c 6-settimana-vecchio (senza sesso-specifico requisito). Eutanasia di un mouse in modo asettico di dislocazione cervicale e tagliato di fresco perone, tibia e femore da un arto posteriore con forbici chirurgiche sterili. Staccare il tessuto epiteliale e quindi rimuovere tanto del tessuto molle possibili utilizzando forbici e pinzette.
  2. Sciacquare le ossa della gamba con soluzione fisiologica sterile 10 mM tamponato fosfato (PBS) due volte per rimuovere il sangue in un piatto di 6 cm. Immergere le ossa in etanolo di 75% per 3 minuti, poi sciacquare due volte con PBS. Le ossa pulite possono essere memorizzate in una provetta sterile da 50 mL con PBS sterile a-80 ° C per mesi fino a quando richiesto.
    Nota: PBS utilizzato in tutti i passaggi seguenti ha 10 mM PO43.

2. osso demineralizzazione e decellularizzati

  1. Scongelare le ossa surgelate a temperatura ambiente e poi congelare di nuovo a-80 ° C per 1 h. soggetti le ossa a più di 2 – 3 cicli di congelamento-scongelamento per la ripartizione del tessuto e lisi cellulare.
  2. Incubare le ossa in una provetta sterile 50 mL con 0,5 N HCl durante la notte a temperatura ambiente in un agitatore a dondolo piattaforma o orbitale con dondolo/agitazione delicata per garantire una copertura completa e anche delle ossa.
    Nota: Assicurarsi che le ossa sono interamente immersi durante il movimento nell'acido e non accontentano durante il processo. Il volume di HCl soluzione dovrebbe essere più di dieci volte a quella delle ossa.
  3. Dopo la decalcificazione, decantare la soluzione di HCl completamente e sciacquare sotto l'acqua corrente per 1 h. Quindi, lavare le ossa due volte per 15min per lavaggio con acqua distillata in un agitatore a dondolo piattaforma o orbitale.
    Nota: Assicurarsi di rimuovere completamente la soluzione o l'acqua tra un lavaggio e dopo il lavaggio finale con acqua distillata.
  4. Estrarre i lipidi nelle ossa demineralizzate con una miscela 1:1 di metanolo e cloroformio in una provetta da centrifuga 50ml avvolta con carta stagnola per 1 h a temperatura ambiente10.
  5. Quindi, trasferimento le ossa in un altro tubo di metanolo avvolto con carta stagnola per 30 min. rimuovere completamente il metanolo e sciacquare con acqua distillata acqua due volte per 15min con agitando delicatamente. Decantare acqua lavaggio finale e procedere con le seguenti operazioni in condizioni sterili.
    Nota: Durante la fase di estrazione, la luce deve essere evitata per prevenire la decomposizione di cloroformio. La miscela può essere conservata in contenitore resistente alla luce o una provetta da centrifuga avvolto con carta stagnola. Eseguire tutti i trattamenti e lavare passaggi sotto modesta rotazione o movimento.
  6. Sciacquare le ossa in un piatto di 6cm con PBS sterile per 3 minuti e poi trasferire le ossa in una nuova provetta 50 mL. Aggiungere 40 mL sterile 0,05% tripsina-EDTA (TE) nel tubo e incubare le ossa per 23 h in incubatore a CO2 a 37 ° C18.
  7. Scartare la soluzione TE e lavare due volte con PBS sterile completati con ampicillina μg/mL 90 e 90 μg/mL kanamicina. Dopo la decantazione finale lavare completamente il PBS, rifornito con 40 mL di PBS sterile. Lavare accuratamente per 24 h a temperatura ambiente con dolce dondolo o agitazione per ammollo antibiotico.
    Nota: Tutto il PBS sterile utilizzato in questa e le seguenti operazioni contiene 90 μg/mL ampicillina e 90 kanamicina μg/mL. Durante la notte lavaggio sotto rotazione o movimento vengono eseguite per immersione completa lunghi periodi con antibiotici per ottenere una sterilizzazione efficace degli spazi dei pori.
  8. Rimuovere il PBS e trasferire le ossa in una provetta da centrifuga fresca 50 mL riempita con PBS sterile. Il preparato demineralizzata e decellularizzate ossa sono chiamate matrice ossea extracellulare (BEM) e possono essere memorizzate a 4 ° C per 2 mesi fino a quando richiesto.

3. semina e coltura delle cellule

  1. Estrarre il BEM dal frigorifero a 4 ° C e immergerlo in etanolo di 75% per 30 s, quindi risciacquare con PBS due volte. Trasferire il BEM su una piastra di coltura cellulare pulito 6-pozzetti. Aggiungere 2 mL di terreno cultura completa (Dulbecco modificato medio/F12 dell'Aquila (DF12) contenente 5% di siero bovino fetale, 90 μg/mL ampicillina e 90 kanamicina μg/mL). Incubare il BEM pernottamento in un incubatore a CO2 a 37 ° C.
  2. Ottenere linee di cellule umane di OS (MNNG/HOS e MG-63). Sospendere circa 1,0 x 105 OS cellule con 100 μL PBS contenente rosso fenolo come indicatore.
    Nota: Per meglio monitorare e osservare le cellule multistrate all'interno il modello tridimensionale di BEM, MNNG/HOS e MG-63 sono infettati con vettore lentivirale esprimendo mCherry fluorescente e proteina fluorescente verde (GFP).
  3. Dopo il BEM è completamente imbevuto nel mezzo, iniettare le cellule OS nelle BEM da epifisi prossimale o distale, quando l'ago raggiunge la cavità midollare del BEM. Incubare il modello OS-BEM per un minimo di 2 h in un umidificata 5% CO2 atmosfera a 37 ° C per garantire le cellule iniettate aderiscano saldamente al BEM.
    Nota: Pre-riscaldare tutti i media utilizzati per la coltura cellulare. L'incubatore utilizzato per la coltura cellulare ha un umidificata 5% CO2 ambiente a 37 ° C.
  4. Aggiungere 1 mL di coltura completa nella piastra per rivestire completamente la superficie della cultura BEM pernottamento in un incubatore a CO2 a 37 ° C.
  5. Trasferire delicatamente il modello OS-BEM in un nuovo pozzo di 6 pozzetti con una pinzetta sterile e terreno di coltura fresco pila 1 mL. Il modello della coltura per 14 giorni in incubatore a CO2 a 37 ° C e aggiornare il terreno di coltura secondo la situazione di proliferazione delle cellule di OS.
  6. Monitorare lo stato delle cellule e di colore medio sotto il microscopio di fluorescenza invertito durante il processo di cultura. Quando le cellule OS espande alla piastra, trasferire delicatamente il modello OS-BEM a altro di nuovo bene con pinzette sterili.
    Nota: Il terreno di coltura è rosso brillante a pH 7.4, che è il valore di pH ottimale per la coltura cellulare più mammifero. Se il mezzo si trasforma in giallo arancia o addirittura, aggiornare immediatamente il mezzo per mantenere un ambiente sano per le cellule di OS.
  7. Trasferire il modello OS-BEM in un nuovo pozzo con pinzette e risciacquare delicatamente con PBS per rimuovere il terreno di coltura. Trasferire in una provetta da centrifuga da 15 mL, quindi fissare con formalina 10% tamponata per identificazione istologica.

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Results

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Dopo la demineralizzazione e decellularizzati, BEM sembra essere traslucido con maggiore resilienza e tenacia rispetto all'osso del mouse nativi. Un piccolo residuo di muscolo e lo spazio della cavità midollare può essere osservati chiaramente (Figura 1A, B). Per determinare l'effettiva decellularizzazione di BEM, BEM è inclusi in paraffina dopo la fissazione e quindi tagliata in 3 – 5 μm sezioni per la macchiatura dell'hematoxylin-eosina (H & E). La rimozione completa d...

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Discussion

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In generale, OS possono essere classificati come osteoblastica, chondroblastic e fibroblastic i sottotipi a seconda della sua dominante componente istologica. Relativa prognosi dipende non solo dai parametri istologici ma anche sul suo sito anatomico. Può verificarsi all'interno delle ossa (nel intramidollare o vano intracortical), sulle superfici delle ossa e in siti extraosseous19. L'emersione e l'eterogeneità del sistema operativo può essere delucidate come una coniugazione di eventi oncogenici ...

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Disclosures

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Gli autori dichiarano di non avere nessun concorrenti interessi finanziari.

Acknowledgements

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Gli autori di valore il supporto di Liuying Chen per la sua assistenza amministrativa e Zhao lungo per la sua eccellente assistenza tecnica durante la costruzione di ponteggi di matrice extracellulare dell'osso. Questo studio è supportato da sovvenzioni dal National Natural Science Foundation of China (31871413).

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Provetta da centrifuga da 15 mLGreiner188271
Provetta da centrifuga da 50 mLGreiner227270
Piastra per coltura cellulare da 6 cmGreiner628160
Piastra a 6 pozzettiGreiner657160
AmpicillinaSigma-AldrichA9393
C57-BL/6J topoSun Yat-sen Laboratorio universitario Centro
CO2 incubatoreSHEL LABSCO5A
Fosfato di sodio bibasicoGuangzhou Chemical Reagent FactoryBE14-GR-500G
DMEM/F12Sigma-AldrichD0547
Siero fetale bovinoHycloneSH30084.03
EmocitometroBLAU717805
KanamicinaSigma-AldrichPHR1487
MG-63Accademia cinese delle scienze, BancaLinea cellulare di osteosarcoma umano
MNNG/HOSAccademia cinese delle scienze, BancaLinea cellulare di osteosarcoma umano
Fenolo rossoSigma-AldrichP4633Una soluzione di rosso fenolo viene utilizzata come indicatore di pH: il suo colore mostra una transizione graduale dal giallo al rosso nell'intervallo di pH da 6,6 a 8,0.
Cloruro di potassioSangon BiotechA100395
Fosfato di potassio monobasicoSangon BiotechA501211
Cloruro di sodioSangon BiotechA501218
per animali cellulare di Shanghai cellulare di Shanghai

References

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