Questo studio segue le politiche e le linee guida del Programma di Protezione della Ricerca Umana dell'Indiana University Institutional Review Board.
1. Selezione della posizione
- Selezionare il numero di siti (n) in base ai diversi livelli di natura.
NOTA: Abbiamo scelto tre siti per il nostro lavoro. Utilizzando un continuum basato su livelli di "naturalità", il sito A è stato considerato il più naturale ed è composto da circa 1.200 acri di creste boscose confinanti con un lago e situato all'interno di una foresta decidua. Le attività più comuni includono passeggiate e osservazione della fauna selvatica. Il sito B era un parco municipale di 33 acri con sentieri, luoghi di ritrovo, parchi giochi e spazi aperti per attività ricreative causali. Il sito C era una struttura urbana di esercizio interno con il più basso livello di naturalezza. Tutti e tre i siti si trovano in una posizione relativamente vicina a una città di medie dimensioni (popolazione stimata di 46.000 persone) nel Midwest degli Stati Uniti.
2. Screening e preparazione dei partecipanti
- Completare il reclutamento dei partecipanti prima che i soggetti si impegnino in esperienze ricreative.
NOTA: Per i siti A e B, i soggetti sono stati avvicinati dal ricercatore nel parcheggio dell'ingresso del parco. Per il sito C, i soggetti sono stati avvicinati alla reception della struttura di esercizi al coperto. Per controllare le differenze di tipo di attività, i soggetti reclutati per entrambi i siti A e B erano prevalentemente escursionistici, mentre per il Sito C l'attività principale era correre o camminare sulla pista interna.
- Durante il reclutamento, ricordare ai soggetti di rispettare le linee guida relative alla raccolta di campioni di cortisolo salivare. Non devono mangiare o bere 10 min prima di fornire campioni di saliva.
NOTA: Va notato che in questo caso, i campioni di saliva non sono stati normalizzati per volume o diluizione (concentrazione) - cioè se i partecipanti erano adeguatamente idratati e/o hanno cambiato idratazione tra le collezioni campione.
- Dare bracciali rossi (o abbigliamento equivalentemente evidente) a ogni partecipante per consentire una facile identificazione quando emergono alla fine dei loro impegni.
- Assegnare un 30-40 min tempo di assegnazione in modo che tutti i soggetti attraverso i tre siti trascorrere una quantità simile di tempo in ogni sito. Escludere i soggetti che trascorrono sostanzialmente più o meno tempo rispetto al resto del campione.
- Mantenere coerente il tipo di attività impegnata.
NOTA: In questo caso, l'attività "media" era a piedi o a piedi. Sono stati esclusi dal campione i soggetti che si sono impegnati in attività sostanzialmente diverse da camminare o fare escursioni. Ad esempio, i soggetti che pescavano, facevano picnic o sollevavano pesi non erano inclusi nei rispettivi campioni.
3. Condizioni e progettazione sperimentale
- Utilizzare una progettazione pre-sperimentale pre-test/post-test.
- Dopo aver identificato le materie e aver accettato di partecipare, chiedi a ciascun soggetto di leggere e firmare un modulo IRB che spieghi la natura volontaria, lo scopo e le procedure dello studio.
- A seguito di questo processo, dare ai soggetti un indumento (ad esempio, bracciale rosso) per l'identificazione futura e ottenere misure fisiologiche e psicologiche dei livelli di stress (ad esempio, PSQ, 1-2 mL di saliva che viene sputata o sbavata in una provetta). Raccogliere campioni dal tardo pomeriggio alla sera presto.
NOTA: Questi dati sono stati raccolti dai ricercatori sia 1) appena prima che i soggetti entrassero nel sito e 2) immediatamente dopo aver terminato la visita al sito.
4. Campioni di saliva
- Per evitare la diluizione del campione, chiedere ai soggetti di non mangiare, bere o sciacquare le bocche 10 min prima di fornire campioni di saliva.
- Chiedere ai soggetti di fornire campioni di saliva da 1-2 mL (esclusa la schiuma) appena prima dell'esperienza ricreativa e subito dopo la conclusione dell'esperienza.
- Raccogliere campioni di saliva utilizzando un metodo di sbavatura passiva:
- Fornire ai soggetti un 2 in plastica bevuta per sbavare in un crioviale da 2 mL (vedi Tabella dei materiali).
- Istruire i soggetti a consentire alla saliva di poolarsi in bocca, poi sbavare giù la paglia e nel crioviale. Secondo la Saliva Collection and Handling Advice (2011), 1 mL (esclusa la schiuma) è adeguato per la maggior parte dei test.
- Campioni di etichette con un numero ID a 3 cifre assegnato (ad esempio, 001) e una lettera per indicare la tempistica della raccolta dei dati (cioè, A rappresenta il pre-test, B rappresenta il post-test; dove 001A rappresenta il campione di saliva fornito dal partecipante 001 prima di esperienza ricreativa).
- Dopo che il campione viene raccolto ed etichettato, dovrebbe quindi essere conservato temporaneamente congelato in una scatola di schiuma steroide piena di ghiaccio secco per non più di 2 h.
- Trasportare i campioni contrassegnati in un laboratorio e conservarli a -80 gradi centigradi fino all'analisi.
5. Quantificazione di z-amilasi
NOTA: In questo saggio, gli idrolizi di z-amilasi 2-cloro-p-nitrophenyl-z-D-maltotrioside a 2-cloro-nitrophenol e forma glucosio, 2-cloro-p-nitrophenyl-z-D-maltoside, maltotriose e glucosio. La reazione è monitorata con un assorbimento di 405 nm, che corrisponde all'attività di z-amylase nel campione. Questo test dimostra la linearità tra 0 e 2000 U/L.
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Materiali
- Usato un reagente liquido di amilasi (vedi Tabella dei materiali) per quantificare la z-amilasi nei campioni di saliva. Tutti i reagenti sono forniti come liquidi pronti all'uso e conservati a 0-4 gradi centigradi.
- Utilizzare un lettore multimodale (vedere Tabella deimateriali) in grado di leggere una densità ottica a 405 nm con una temperatura controllata a 37 gradi centigradi durante l'essenza.
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analisi
- Scongelare i campioni sul ghiaccio prima dell'analisi.
- Diluire i campioni 1:10 con 1x PBS (10 - L di saliva - 90 -L di PBS).
- Analizzare ogni campione in duplicato.
- L'amilasi reagente a 20-25 gradi centigradi per almeno 30 min.
- Aggiungere 0,1 mL di reagente di amilasi a una micropiastra ben 96 per ogni campione.
- Pre-incubare la micropiastra a 37 gradi centigradi per un minimo di 5 min.
- Aggiungere 2,5 l del campione al reagente di amilasi.
- Prendere una lettura iniziale dopo 60 s.
- Continua le letture ogni 60 s per un ulteriore 2 min.
- Calcolare la differenza di assorbimento medio al minuto (Abs/min).
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calcolo
- Per calcolare l'attività dell'amilasi, utilizzare la seguente formula:

Dove abs/min è la differenza di assorbimento al minuto; TV - volume totale del saggio (0,1025 mL); 1000 USD conversione di U/mL in U/L; L'absorptivity millimolare di 2-cloro-p-nitrophenol 12,9; SV - volume del campione (0,0025 mL); e LP - percorso della luce (1 cm). La sungazione dà:

Pertanto, moltiplicare il valore abs/min per 3178x il fattore di diluizione (10) per ottenere l'amilasi in U/L.
- Per i campioni superiori al 2000 U/L (linearità di analisi) diluire ulteriormente (almeno 2x utilizzando PBS) e ri-analisi, quindi moltiplicare il risultato di z-amilasi per il fattore di diluizione supplementare.
6. Quantificazione del cortisolo
NOTA: In questo test, il cortisolo libero viene quantificato nella saliva utilizzando una curva standard di cortisolo. Gli standard e i campioni diluiti vengono aggiunti a una piastra microtitera pre-rivestita con un anticorpo. Un coniugato cortisolo-perossidase viene aggiunto ai pozzi, seguito dall'aggiunta di un anticorpo monoclonale al cortisolo. La quantità di cortisolo/perossidasi coniugato rientra man mano che aumenta la concentrazione di cortisolo nel campione.
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Materiali
- Utilizzare un kit di Immunoassay enzimatico del cortisolo (vedi Tabella deimateriali) per quantificare il cortisolo nei campioni di saliva. Tutti i reagenti necessari per eseguire questo test sono inclusi nel kit. Tutti i componenti del kit sono immagazzinati a 0-4 gradi centigradi prima di raggiungere la data di scadenza.
- Utilizzare uno spettrofotometro in grado di leggere una densità ottica (OD) a 450 nm (vedere Tabella dei materiali), nonché un software in grado di utilizzare le registrazioni OD dal lettore di piastre per eseguire il raccordo a curva logistica a quattro parametri (4 PLC).
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Preparazione del reagente
- Lasciare che tutti i reagenti eclichino a 20-25 gradi centigradi per un minimo di 30 min.
- Diluire il buffer di analisi del cortisolo 1:5 usando l'acqua deionizzata.
- Diluire il buffer di lavaggio 1:20 utilizzando acqua deionizzata.
NOTA: I tamponi di analisi e lavaggio sono stabili per 3 mesi se conservati a 0-4 gradi centigradi.
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Preparazione del campione
- Scongelare i campioni sul ghiaccio prima dell'analisi.
- Diluire i campioni 1:10 con cuscinetto di assaggio di cortisolo (20 - L di saliva - 180 l di tampone) e utilizzare entro 2 h dalla preparazione.
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Preparazione delle norme
- Etichettare le provette di vetro #1-#7.
- Pipet 225 l di cuscinetto di assay in tubo #1 e 125 - L di buffer in tubi #2-#7.
- Aggiungere 25 -L della soluzione di brodo di cortisolo al tubo #1 e vortice.
- Togliere 125 l di tampone dal tubo #1 e aggiungerlo al tubo #2, quindi vortice.
- Ripetere le diluizioni seriali per i tubi #3 #7.
NOTA: le concentrazioni finali di cortisolo di ogni norma sono indicate nella Tabella 1.
- Le norme devono essere utilizzate entro 2 h dalla preparazione.
| scala di valori | #1 | #2 | #3 | #4 | #5 | #6 | #7 |
| Volume buffer di analisi (L) | 225 (di sistema) | 125 del sistema | 125 del sistema | 125 del sistema | 125 del sistema | 125 del sistema | 125 del sistema |
| oltre a qualcosa | Stock Std | #1 | #2 | #3 | #4 | #5 | #6 |
| Volume di addizione | 25 mi lato | 125 del sistema | 125 del sistema | 125 del sistema | 125 del sistema | 125 del sistema | 125 del sistema |
| Concentrazione finale (pg/mL) | 3200 | 1600 | 800 | 400 | 200 anni | 100 del sistema | 50 anni |
Tabella 1: tabella di preparazione della curva standard.
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analisi
- Utilizzare il layout della piastra riportato di seguito nella Figura 1 come guida per impostare la micropiastra.
- Si consiglia di utilizzare una pipetta multicanale per l'aggiunta di reagenti.
- Aggiungere 50 - L di campioni o standard nel numero appropriato di pozze nella piastra. I campioni e gli standard devono essere eseguiti in duplicato.
- Aggiungere il buffer di aste (75 ) nei pozzi di rilegatura non specifici (NSB).
- Aggiungete il buffer di prova (50 ) nei pozzi di rilegatura massima (B0) e i pozzi standard zero (vuoti).
- Aggiungete 25 l del cortisolo ajugate ad ogni pozzo.
- Aggiungere 25 l dell'anticorpo cortisolo ad ogni pozzo, ad eccezione dei pozzi NSB.
- Toccare delicatamente il lato della piastra per mescolare i reagenti.
- Coprire con il sigillante della piastra e agitare a temperatura ambiente (RT) a 20-25 gradi centigradi per 1 ora.
- Rimuovere il contenuto del pozzo e sciacquare ogni pozzo 4x con tampone di lavaggio (300 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Toccare la piastra per asciugare su asciugamani assorbenti tra i fuormi.
- Aggiungete il substrato TMB a ciascun pozzo (100 l).
- Incubare la piastra a 20-25 gradi centigradi per 30 min senza agitare.
- Aggiungete la soluzione di arresto in ogni pozzetto (50 o l).
- Leggere la densità ottica in ogni pozzo della micropiastra a 450 nm.
- Calcolare la media delle densità ottiche per ogni standard, quindi campionare e sottrarre la densità ottica media per i pozzi NSB.
- Calcolare la percentuale associata (B/B0) per tutti i campioni utilizzando i controlli di rilegatura massima (B0).
- Creare una curva standard utilizzando un software in grado di adattarsi a quattro parametri della curva di regressione logistica, calcolato dalla curva %B/B0.
- Moltiplicare il risultato per il fattore di diluizione (10) per ottenere i valori di cortisolo in pg/mL.
- I campioni con densità ottiche che salgono al di sopra dello standard più elevato dovrebbero essere ulteriormente diluiti con il tampone di analisi e ri-analisi, quindi il risultato dovrebbe essere moltiplicato per il fattore di diluizione aggiuntivo.

Figura 1 : Esempio di layout piastra. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
7. Misurazione psicologica (modulo di stress percepito)
- Misurare i livelli psicologici dei soggetti utilizzando il PSQ pubblicato da Fliege et al.13, che comprende quattro fattori (preoccupazione, tensione, tensione, gioia) e utilizza 20 elementi.
- Chiedi all'interessato di compilare il PSQ poco prima della loro esperienza ricreativa e subito dopo la conclusione dell'esperienza.
- Contrassegnare i questionari con un numero ID a 3 cifre identico al livello di stress biofisiologico di ciascun soggetto.