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Articolo metodologico

Misurazione dei livelli di stress biofisico e psicologico dopo la visita in tre località con diversi livelli di natura

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DOI:

10.3791/59272

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19 giugno 2019

 ,  ,  , 

In questo articolo

Sommario

Lo scopo di questo documento è quello di identificare i cambiamenti nei livelli di stress dopo la visita in tre diverse impostazioni e di descrivere i metodi utilizzati per identificare i livelli di stress in base alle misure del cortisolo salivare, della z-amilasi e di un auto-report psicologico strumento musicale.

Abstract

La visita in ambienti naturali è stata legata alla riduzione psicologica dello stress. Anche se la maggior parte della ricerca legata allo stress si è basata su formati di auto-segnalazione, un numero crescente di studi ora incorporano ormoni e catalizzatori biologici legati allo stress, come il cortisolo e la z-amilasi, per misurare i livelli di stress. Presentato qui è un protocollo per esaminare gli effetti sui livelli di stress biofisico e psicologico dopo la visita in tre luoghi diversi con diversi livelli di natura. I livelli di stress psicologico biofisico e auto-riferito vengono misurati immediatamente entrando nei luoghi selezionati e appena prima che i visitatori lascino il sito. Utilizzando un metodo "drool", la misura biofisica consiste di 1-2 mL di campioni di saliva forniti da soggetti dello studio al momento dell'ingresso in una delle tre posizioni di studio. Come prescritto dalla letteratura esistente, la saliva viene raccolta entro un lasso di tempo di 45 minuti dopo la fine dell'impegno del visitatore nel luogo. Dopo la raccolta della saliva, i campioni vengono etichettati e trasportati in un laboratorio biologico. Il cortisolo è la variabile biofisica di interesse in questo studio e misurato utilizzando un processo ELISA con un lettore di lastre TECAN. Per misurare lo stress auto-riferito, il Questionario sullo stress percepito (PSQ), che riporta livelli di preoccupazione, tensione, gioia e richieste percepite. I dati vengono raccolti in tutti e tre i siti nel tardo pomeriggio fino a prima serata. Se confrontati in tutte e tre le impostazioni, i livelli di stress, misurati sia dai marcatori biologici che dagli auto-report, sono significativamente più bassi dopo la visita all'ambiente più naturale.

Introduzione

Livelli elevati di stress sono stati a lungo collegati a molte gravi condizioni di salute come malattie cardiache, obesità, e disturbi psicologici1,2,3. Un crescente corpo di ricerca suggerisce che la stretta vicinanza o la visita ad ambienti naturali come parchi e paesaggi non sviluppati può avere un effetto notevole sul benessere psicologico e sulla diminuzione dei livelli di stress1,4, 5,6,7,8,9,10. Le spiegazioni per gli effetti degli ambienti naturali e dei livelli di stress hanno incluso quanto segue: (1) le impostazioni naturali forniscono sedi per l'attività fisica8,11 e (2) i visitatori di ambienti naturali hanno la capacità di concentrarsi su processi di pensiero più non-task, portando così ad una riduzione dell'affaticamento dell'attenzione12. Per determinare gli effetti della natura sulla riduzione dello stress, questo studio utilizza un auto-report di stress psicologico (PSQ) e due biomarcatori salivari, cortisolo e amilasi, dopo la visita a tre diversi siti ricreativi. Queste località variano tra i loro livelli di "naturalità" e includono un ambiente selvaggio, parco comunale, e struttura fitness e ricreativo locale.

Questo studio mira ad affrontare le seguenti domande di ricerca: (RQ1) Ci sono differenze nei livelli di stress biofisico misurati dal cortisolo salivare e dalla z-amilasi se confrontati in tutti e tre i siti (cioè naturale, semi-naturale, costruito)? (RQ2) Ci sono differenze nei livelli di stress psicologico misurati dal PSQ (manifestato da quattro costrutti: richieste, preoccupazioni, tensione e gioia) se confrontati in tutti e tre i siti (cioè naturale, semi-naturale, costruito)?

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Protocollo

Questo studio segue le politiche e le linee guida del Programma di Protezione della Ricerca Umana dell'Indiana University Institutional Review Board.

1. Selezione della posizione

  1. Selezionare il numero di siti (n) in base ai diversi livelli di natura.
    NOTA: Abbiamo scelto tre siti per il nostro lavoro. Utilizzando un continuum basato su livelli di "naturalità", il sito A è stato considerato il più naturale ed è composto da circa 1.200 acri di creste boscose confinanti con un lago e situato all'interno di una foresta decidua. Le attività più comuni includono passeggiate e osservazione della fauna selvatica. Il sito B era un parco municipale di 33 acri con sentieri, luoghi di ritrovo, parchi giochi e spazi aperti per attività ricreative causali. Il sito C era una struttura urbana di esercizio interno con il più basso livello di naturalezza. Tutti e tre i siti si trovano in una posizione relativamente vicina a una città di medie dimensioni (popolazione stimata di 46.000 persone) nel Midwest degli Stati Uniti.

2. Screening e preparazione dei partecipanti

  1. Completare il reclutamento dei partecipanti prima che i soggetti si impegnino in esperienze ricreative.
    NOTA: Per i siti A e B, i soggetti sono stati avvicinati dal ricercatore nel parcheggio dell'ingresso del parco. Per il sito C, i soggetti sono stati avvicinati alla reception della struttura di esercizi al coperto. Per controllare le differenze di tipo di attività, i soggetti reclutati per entrambi i siti A e B erano prevalentemente escursionistici, mentre per il Sito C l'attività principale era correre o camminare sulla pista interna.
  2. Durante il reclutamento, ricordare ai soggetti di rispettare le linee guida relative alla raccolta di campioni di cortisolo salivare. Non devono mangiare o bere 10 min prima di fornire campioni di saliva.
    NOTA: Va notato che in questo caso, i campioni di saliva non sono stati normalizzati per volume o diluizione (concentrazione) - cioè se i partecipanti erano adeguatamente idratati e/o hanno cambiato idratazione tra le collezioni campione.
  3. Dare bracciali rossi (o abbigliamento equivalentemente evidente) a ogni partecipante per consentire una facile identificazione quando emergono alla fine dei loro impegni.
  4. Assegnare un 30-40 min tempo di assegnazione in modo che tutti i soggetti attraverso i tre siti trascorrere una quantità simile di tempo in ogni sito. Escludere i soggetti che trascorrono sostanzialmente più o meno tempo rispetto al resto del campione.
  5. Mantenere coerente il tipo di attività impegnata.
    NOTA: In questo caso, l'attività "media" era a piedi o a piedi. Sono stati esclusi dal campione i soggetti che si sono impegnati in attività sostanzialmente diverse da camminare o fare escursioni. Ad esempio, i soggetti che pescavano, facevano picnic o sollevavano pesi non erano inclusi nei rispettivi campioni.

3. Condizioni e progettazione sperimentale

  1. Utilizzare una progettazione pre-sperimentale pre-test/post-test.
  2. Dopo aver identificato le materie e aver accettato di partecipare, chiedi a ciascun soggetto di leggere e firmare un modulo IRB che spieghi la natura volontaria, lo scopo e le procedure dello studio.
  3. A seguito di questo processo, dare ai soggetti un indumento (ad esempio, bracciale rosso) per l'identificazione futura e ottenere misure fisiologiche e psicologiche dei livelli di stress (ad esempio, PSQ, 1-2 mL di saliva che viene sputata o sbavata in una provetta). Raccogliere campioni dal tardo pomeriggio alla sera presto.
    NOTA: Questi dati sono stati raccolti dai ricercatori sia 1) appena prima che i soggetti entrassero nel sito e 2) immediatamente dopo aver terminato la visita al sito.

4. Campioni di saliva

  1. Per evitare la diluizione del campione, chiedere ai soggetti di non mangiare, bere o sciacquare le bocche 10 min prima di fornire campioni di saliva.
  2. Chiedere ai soggetti di fornire campioni di saliva da 1-2 mL (esclusa la schiuma) appena prima dell'esperienza ricreativa e subito dopo la conclusione dell'esperienza.
  3. Raccogliere campioni di saliva utilizzando un metodo di sbavatura passiva:
    1. Fornire ai soggetti un 2 in plastica bevuta per sbavare in un crioviale da 2 mL (vedi Tabella dei materiali).
    2. Istruire i soggetti a consentire alla saliva di poolarsi in bocca, poi sbavare giù la paglia e nel crioviale. Secondo la Saliva Collection and Handling Advice (2011), 1 mL (esclusa la schiuma) è adeguato per la maggior parte dei test.
    3. Campioni di etichette con un numero ID a 3 cifre assegnato (ad esempio, 001) e una lettera per indicare la tempistica della raccolta dei dati (cioè, A rappresenta il pre-test, B rappresenta il post-test; dove 001A rappresenta il campione di saliva fornito dal partecipante 001 prima di esperienza ricreativa).
    4. Dopo che il campione viene raccolto ed etichettato, dovrebbe quindi essere conservato temporaneamente congelato in una scatola di schiuma steroide piena di ghiaccio secco per non più di 2 h.
    5. Trasportare i campioni contrassegnati in un laboratorio e conservarli a -80 gradi centigradi fino all'analisi.

5. Quantificazione di z-amilasi

NOTA: In questo saggio, gli idrolizi di z-amilasi 2-cloro-p-nitrophenyl-z-D-maltotrioside a 2-cloro-nitrophenol e forma glucosio, 2-cloro-p-nitrophenyl-z-D-maltoside, maltotriose e glucosio. La reazione è monitorata con un assorbimento di 405 nm, che corrisponde all'attività di z-amylase nel campione. Questo test dimostra la linearità tra 0 e 2000 U/L.

  1. Materiali
    1. Usato un reagente liquido di amilasi (vedi Tabella dei materiali) per quantificare la z-amilasi nei campioni di saliva. Tutti i reagenti sono forniti come liquidi pronti all'uso e conservati a 0-4 gradi centigradi.
    2. Utilizzare un lettore multimodale (vedere Tabella deimateriali) in grado di leggere una densità ottica a 405 nm con una temperatura controllata a 37 gradi centigradi durante l'essenza.
  2. analisi
    1. Scongelare i campioni sul ghiaccio prima dell'analisi.
    2. Diluire i campioni 1:10 con 1x PBS (10 - L di saliva - 90 -L di PBS).
    3. Analizzare ogni campione in duplicato.
    4. L'amilasi reagente a 20-25 gradi centigradi per almeno 30 min.
    5. Aggiungere 0,1 mL di reagente di amilasi a una micropiastra ben 96 per ogni campione.
    6. Pre-incubare la micropiastra a 37 gradi centigradi per un minimo di 5 min.
    7. Aggiungere 2,5 l del campione al reagente di amilasi.
    8. Prendere una lettura iniziale dopo 60 s.
    9. Continua le letture ogni 60 s per un ulteriore 2 min.
    10. Calcolare la differenza di assorbimento medio al minuto (Abs/min).
  3. calcolo
    1. Per calcolare l'attività dell'amilasi, utilizzare la seguente formula:
      figure-protocol-1
      Dove abs/min è la differenza di assorbimento al minuto; TV - volume totale del saggio (0,1025 mL); 1000 USD conversione di U/mL in U/L; L'absorptivity millimolare di 2-cloro-p-nitrophenol 12,9; SV - volume del campione (0,0025 mL); e LP - percorso della luce (1 cm). La sungazione dà:
      figure-protocol-2
      Pertanto, moltiplicare il valore abs/min per 3178x il fattore di diluizione (10) per ottenere l'amilasi in U/L.
    2. Per i campioni superiori al 2000 U/L (linearità di analisi) diluire ulteriormente (almeno 2x utilizzando PBS) e ri-analisi, quindi moltiplicare il risultato di z-amilasi per il fattore di diluizione supplementare.

6. Quantificazione del cortisolo

NOTA: In questo test, il cortisolo libero viene quantificato nella saliva utilizzando una curva standard di cortisolo. Gli standard e i campioni diluiti vengono aggiunti a una piastra microtitera pre-rivestita con un anticorpo. Un coniugato cortisolo-perossidase viene aggiunto ai pozzi, seguito dall'aggiunta di un anticorpo monoclonale al cortisolo. La quantità di cortisolo/perossidasi coniugato rientra man mano che aumenta la concentrazione di cortisolo nel campione.

  1. Materiali
    1. Utilizzare un kit di Immunoassay enzimatico del cortisolo (vedi Tabella deimateriali) per quantificare il cortisolo nei campioni di saliva. Tutti i reagenti necessari per eseguire questo test sono inclusi nel kit. Tutti i componenti del kit sono immagazzinati a 0-4 gradi centigradi prima di raggiungere la data di scadenza.
    2. Utilizzare uno spettrofotometro in grado di leggere una densità ottica (OD) a 450 nm (vedere Tabella dei materiali), nonché un software in grado di utilizzare le registrazioni OD dal lettore di piastre per eseguire il raccordo a curva logistica a quattro parametri (4 PLC).
  2. Preparazione del reagente
    1. Lasciare che tutti i reagenti eclichino a 20-25 gradi centigradi per un minimo di 30 min.
    2. Diluire il buffer di analisi del cortisolo 1:5 usando l'acqua deionizzata.
    3. Diluire il buffer di lavaggio 1:20 utilizzando acqua deionizzata.
      NOTA: I tamponi di analisi e lavaggio sono stabili per 3 mesi se conservati a 0-4 gradi centigradi.
  3. Preparazione del campione
    1. Scongelare i campioni sul ghiaccio prima dell'analisi.
    2. Diluire i campioni 1:10 con cuscinetto di assaggio di cortisolo (20 - L di saliva - 180 l di tampone) e utilizzare entro 2 h dalla preparazione.
  4. Preparazione delle norme
    1. Etichettare le provette di vetro #1-#7.
    2. Pipet 225 l di cuscinetto di assay in tubo #1 e 125 - L di buffer in tubi #2-#7.
    3. Aggiungere 25 -L della soluzione di brodo di cortisolo al tubo #1 e vortice.
    4. Togliere 125 l di tampone dal tubo #1 e aggiungerlo al tubo #2, quindi vortice.
    5. Ripetere le diluizioni seriali per i tubi #3 #7.
      NOTA: le concentrazioni finali di cortisolo di ogni norma sono indicate nella Tabella 1.
    6. Le norme devono essere utilizzate entro 2 h dalla preparazione.
scala di valori#1#2#3#4#5#6#7
Volume buffer di analisi (L)225 (di sistema)125 del sistema125 del sistema125 del sistema125 del sistema125 del sistema125 del sistema
oltre a qualcosaStock Std#1#2#3#4#5#6
Volume di addizione25 mi lato125 del sistema125 del sistema125 del sistema125 del sistema125 del sistema125 del sistema
Concentrazione finale (pg/mL)32001600800400200 anni100 del sistema50 anni

Tabella 1: tabella di preparazione della curva standard.

  1. analisi
    1. Utilizzare il layout della piastra riportato di seguito nella Figura 1 come guida per impostare la micropiastra.
    2. Si consiglia di utilizzare una pipetta multicanale per l'aggiunta di reagenti.
    3. Aggiungere 50 - L di campioni o standard nel numero appropriato di pozze nella piastra. I campioni e gli standard devono essere eseguiti in duplicato.
    4. Aggiungere il buffer di aste (75 ) nei pozzi di rilegatura non specifici (NSB).
    5. Aggiungete il buffer di prova (50 ) nei pozzi di rilegatura massima (B0) e i pozzi standard zero (vuoti).
    6. Aggiungete 25 l del cortisolo ajugate ad ogni pozzo.
    7. Aggiungere 25 l dell'anticorpo cortisolo ad ogni pozzo, ad eccezione dei pozzi NSB.
    8. Toccare delicatamente il lato della piastra per mescolare i reagenti.
    9. Coprire con il sigillante della piastra e agitare a temperatura ambiente (RT) a 20-25 gradi centigradi per 1 ora.
    10. Rimuovere il contenuto del pozzo e sciacquare ogni pozzo 4x con tampone di lavaggio (300 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Toccare la piastra per asciugare su asciugamani assorbenti tra i fuormi.
    11. Aggiungete il substrato TMB a ciascun pozzo (100 l).
    12. Incubare la piastra a 20-25 gradi centigradi per 30 min senza agitare.
    13. Aggiungete la soluzione di arresto in ogni pozzetto (50 o l).
    14. Leggere la densità ottica in ogni pozzo della micropiastra a 450 nm.
    15. Calcolare la media delle densità ottiche per ogni standard, quindi campionare e sottrarre la densità ottica media per i pozzi NSB.
    16. Calcolare la percentuale associata (B/B0) per tutti i campioni utilizzando i controlli di rilegatura massima (B0).
    17. Creare una curva standard utilizzando un software in grado di adattarsi a quattro parametri della curva di regressione logistica, calcolato dalla curva %B/B0.
    18. Moltiplicare il risultato per il fattore di diluizione (10) per ottenere i valori di cortisolo in pg/mL.
    19. I campioni con densità ottiche che salgono al di sopra dello standard più elevato dovrebbero essere ulteriormente diluiti con il tampone di analisi e ri-analisi, quindi il risultato dovrebbe essere moltiplicato per il fattore di diluizione aggiuntivo.

figure-protocol-3
Figura 1 : Esempio di layout piastra. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

7. Misurazione psicologica (modulo di stress percepito)

  1. Misurare i livelli psicologici dei soggetti utilizzando il PSQ pubblicato da Fliege et al.13, che comprende quattro fattori (preoccupazione, tensione, tensione, gioia) e utilizza 20 elementi.
  2. Chiedi all'interessato di compilare il PSQ poco prima della loro esperienza ricreativa e subito dopo la conclusione dell'esperienza.
  3. Contrassegnare i questionari con un numero ID a 3 cifre identico al livello di stress biofisiologico di ciascun soggetto.

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Risultati

Esempio Descrizione
Utilizzando una tecnica di campionamento delle quote, questo studio ha reclutato 35 visitatori da ciascuno dei tre siti. In totale, 105 soggetti sono stati reclutati in questo studio, tra cui 63 maschi e 42 femmine. Età medie dei visitatori reclutati da tre diversi siti sono stati 25,9 anni (sito A), 37,2 anni (sito B) e 28,8 anni (sito C). Sono state registrate anche le frequenze delle visite dei soggetti nei tre siti selezionati. Per il sito A e il sito C, la maggior parte degli ...

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Discussione

Lo scopo di questo studio è identificare potenziali cambiamenti nello stress utilizzando strumenti biofisici e psicologici dopo la visita ricreativa in tre diverse impostazioni con diversi livelli di natura. Sia il cortisolo che la z-amilasi hanno dimostrato di essere indicatori affidabili dei livelli di stress psicologico. La procedura di saggio amilasi descritta in questo studio è stata adattata a un formato di 96 pozzi. Quando i livelli di amilasi nella saliva sono alti, i cambiamenti di assorbimento si verificano rap...

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Dichiarazioni

Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.

Ringraziamenti

Questo studio è stato finanziato in parte dal Faculty Research Grant Program (FRGP) sponsorizzato attraverso la School of Public Health presso l'Università dell'Università, Bloomington, IN. Gli autori desiderano ringraziare la Dott.ssa Alison Voight e Melissa Page per l'assistenza editoriale e i commenti costruttivi.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Kit per il dosaggio immunoenzimatico del cortisoloDetectXK003-H1Il kit per il dosaggio immunoenzimatico del cortisolo è progettato per misurare quantitativamente il cortisolo presente negli estratti fecali essiccati, nella saliva, nelle urine, nel siero, nel plasma e nei campioni di terreni di coltura.
Etichette criogeniche per la conservazione criogenicaFisherbrand5-910-A L'adesivounico resiste alle temperature estreme
Set di reagenti per amilasi liquida (CNPG3) PointeScientificA7564Per la determinazione cinetica quantitativa dell'attività della &alfa;-amilasi nel siero umano.
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