Articolo metodologico

Protocollo di isolamento gocciolina del lipido rapida utilizzando un Kit di isolamento organello ben consolidate

DOI:

10.3791/59290

⸱

19 aprile 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Gastroenterology, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo protocollo stabilisce un metodo novello di isolamento della gocciolina del lipido e la purificazione dai fegati del topo, utilizzando un kit di isolamento ben consolidata del reticolo endoplasmatico.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le goccioline del lipido (LDs) sono organelli bioattivi trovati all'interno del citosol delle più eucariotiche e alcune cellule procariotiche. LDs sono composte di lipidi neutri, racchiusi da un monostrato di fosfolipidi e proteine. Lipidi epatici di LD, come ceramidi e proteine sono implicati in diverse patologie che causano steatosi epatica. Anche se i metodi precedenti sono stati stabiliti per l'isolamento di LD, richiedono una lunga preparazione dei reagenti e non sono progettati per l'isolamento di più compartimenti subcellulari. Abbiamo cercato di stabilire un nuovo protocollo per consentire l'isolamento di LDs, reticolo endoplasmico (ER) e lisosomi da un fegato del mouse.

Ulteriormente, tutti i reagenti utilizzati nel protocollo presentato qui sono commercialmente disponibili e richiedono una preparazione minima reagente senza sacrificare la purezza di LD. Qui presentiamo i dati che confrontano questo nuovo protocollo per un protocollo di gradiente di saccarosio standard, dimostrando la resa, la morfologia e la purezza paragonabile. Inoltre, possiamo isolare ER e lisosomi utilizzando lo stesso esempio, fornendo informazioni dettagliate sulla formazione e flusso intracellulare di lipidi e le proteine associate.

Introduzione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

LDs sono organelli bioattivi trovati nel citosol delle cellule eucariotiche più e alcune cellule procariotiche1,2,3. Il nucleo di LD è composto da lipidi neutri come esteri del colesterolo e del trigliceride (TG). Inoltre contengono ceramidi, lipidi bioattivi coinvolti nella segnalazione cellulare vie4,5. LDs sono circondati da un monostrato di fosfolipidi e rivestito con proteine, tra cui la perilipina proteine perilipina 2 (PLIN2) e 3 (PLIN3)1,5,6. Sono presenti anche enzimi lipogenic, lipasi e proteine traffico di membrana che sono state collegate a parecchie malattie steatotic epatiche, tra cui la steatosi epatica, epatopatia alcolica e l'epatite C3,5 ,6,7,8,9,10.

LDs sono pensati per formare dalla membrana esterna dell'ER e contengono recentemente sintetizzato TG provenienti da ER-derivati di acidi grassi liberi11. Tuttavia, rimane sconosciuto se i lipidi in pool bud, rimanere connessi, o sono asportati dal ER6,11, rendendo l'isolamento di LDs esente da ER tecnicamente impegnativi. Gli acidi grassi liberi possono essere liberati da LDs dall'azione delle lipasi superficie per fornire per la produzione di energia o sintesi della membrana. Inoltre, LDs può essere degradata tramite lipophagy come un meccanismo di regolamentazione e di produrre acidi grassi liberi12.

Oltre alla ER e lisosomi, ci sono altri organelli — come i mitocondri, gli endosomi, peroxisomes e membrana plasmatica — che si trovano all'interno di stretta associazione di LDs11. Questa stretta poligamia rende difficile effettuare un'estrazione di LD pura. Tuttavia, densità bassa innata dei lipidi neutri può essere sfruttato tramite centrifugazione5.

Tradizionalmente, LDs sono state isolate utilizzando un saccarosio densità gradiente1,5,13. Tuttavia, questi metodi non sono stati progettati per isolare altri organelli. Inoltre, essi richiedono la preparazione che richiede tempo di reagenti. Questo protocollo si adatta un isolamento di ER disponibile in commercio kit (vedere la Tabella materiali) per consentire l'isolamento di LD. Usiamo il tampone di estrazione fornito dal kit, aggiunta di un passaggio di isolamento di LD. Inoltre, il protocollo può essere utilizzato anche per ER e lysosomal isolamento utilizzando gli stessi campioni, permettendo per un'immagine più completa del ciclo di vita di LDs. Per convalidare questo nuovo metodo, analisi di rendimento LD, morfologia, dimensioni e purezza. Confrontiamo i risultati presentati qui a quelli ottenuti con un protocollo ampiamente utilizzato utilizzando un gradiente di saccarosio per l'isolamento di LD.

Abbiamo usato un 10 a 12-week-old, mouse C57BL/6 femminile 20g digiunato per 16 h (rimozione di cibo alle 17 per un periodo di isolamento di 9 LD) con libero accesso all'acqua. La resa tipica per TG è di 0,6 mg/g di fegato, e per la proteina di LD, è 0,25 mg/g di fegato. Questo fornisce abbastanza materiale per ~ 10 immunoblots di SDS PAGE. Il protocollo sotto i dettagli dei reagenti utilizzati e un protocollo adatto per un singolo 1 g di fegato. Il protocollo di isolamento gradiente di saccarosio è adattato da Sato14 e Wu15.

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Protocollo

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Tutti gli esperimenti sono stati condotti su un banco di laboratorio con dispositivi di protezione individuale appropriati per livello di biosicurezza 1, compreso un camice da laboratorio, guanti e occhiali di sicurezza. Gli esperimenti sono stati eseguiti secondo i protocolli approvati dal istituzionale Animal Care e uso Committee (IACUC) dell'Università della Pennsylvania. Tutti gli sforzi sono stati fatti per ridurre al minimo il disagio degli animali, e gli animali sono stati trattati con un'assistenza umana.

1. isolamento LD utilizzando un kit di isolamento ER

  1. Preparazione
    Nota: Gli importi elencati sono adatti per un singolo 1 g di fegato di topo.
    1. Preparare 10 mL di tampone di estrazione isotonica 1 x (buffer di IE, dal kit di isolamento ER) diluendo 2 mL di buffer di IE 5 x con 8 mL di acqua ultrapura. Raffreddare il buffer mettendo sul ghiaccio.
    2. Preparare 100 mL di tampone fosfato salino (PBS): 1x diluendo 10 mL di PBS 1x 10 in 90 mL di acqua ultrapura. Raffreddarlo mettendolo sul ghiaccio.
    3. Preparare 10 mL di 5% polietilene glicole p-(1,1,3,3-tetramethylbutyl)-fenil etere (PGPE) diluendo 500 µ l di PGPE in 9,5 mL di acqua ultrapura. Utilizzare una siringa da 1 mL per misurare fuori PGPE in quanto è viscoso. Raffreddarlo mettendolo sul ghiaccio.
    4. Lasciare raffreddare tutte le provette posizionandoli sul ghiaccio: microcentrifuga 1,7 mL, provette per centrifuga da 15 mL, provette da 50 mL Centrifuga ad alta velocità e 13ml ultracentrifuga tubi.
    5. Fresco di tutte le necessarie centrifughe a 4 ° c: una microcentrifuga, una centrifuga ad alta capacità per 15 mL provette, una centrifuga ad alta velocità per provette da 50 mL e un'ultracentrifuga.
    6. Sterilizzare in autoclave forbici pinze e dissezione.
  2. Preparazione tessuto
    1. Eutanasia il mouse collocandolo in una camera piena di 100% CO2 per 10 min. Confirm eutanasia eseguendo dislocazione cervicale.
    2. Utilizzando pinze sterili e dissezione Forbici, tagliare gli strati di pelle e muscoli dell'addome sull'asse posteriore/anteriore per esporre il fegato.
    3. Tagliare i legamenti che collega il fegato al diaframma e intestino. Utilizzare pinze per tirare l'intestino dal fegato, verso il posteriore, per esporre i legamenti.
    4. Taglio tra il fegato e la gabbia toracica dorsale, lo spostamento dall'anteriore al posteriore fino a quando il fegato è liberato.
    5. Trasferire il fegato a un freddo 5cm Petri con 10 mL di PBS 1X freddo.
    6. Lavare il fegato 2 x su una piattaforma a dondolo in 10 mL di PBS 1X freddo per 5 min a 4 ° C ai 5 cm di Petri. Versa di PBS 1X dopo il lavaggio finale.
    7. Utilizzare una lama chirurgica sterile di dimensione-10 (Vedi la Tabella materiali) a dadi il fegato in pezzi di 3 – 5 mm nei 5 cm di Petri (Figura 1A).
    8. Lavare il fegato tagliato a dadini 2 x 10 ml di PBS 1X freddo per 5 min a 4 ° C ai 5 cm di Petri.
      Nota: Per l'isolamento del lisosoma, trasferire 0,5 g di fegato di un omogeneizzatore 45ml pulito e seguire le indicazioni fornite dall'estrazione lisosoma kit (vedere la Tabella materiali).
    9. Decantare 1X PBS e trasferire i pezzi di fegato a dadini al freddo 45 mL lisata omogeneizzatore. Garantire che tutti i pezzi vanno fino in fondo l'omogeneizzatore.
    10. Aggiungere 7 mL di tampone di IE 1x freddo (dal kit di isolamento ER) e omogeneizzare il ghiaccio spostando il pestello su e giù per 20 volte. Assicurarsi che il pestello vada fino in fondo l'omogeneizzatore durante ogni corsa.
    11. Trasferire l'omogeneizzato (Figura 1B) a una centrifuga a freddo 15 mL.
    12. Sciacquare l'omogeneizzatore con 1 mL di freddo 1x buffer di IE (dal kit di isolamento ER) e aggiungere questo al resto dell'omogenato.
  3. Isolamento di LD
    1. Rimuovere i nuclei mediante centrifugazione l'omogeneizzato in una centrifuga ad alta capacità a 1.000 x g per 10 min a 4 ° C (Figura 1).
    2. Trasferire il surnatante postnuclear (PNS) a un nuovo, freddo 50ml centrifuga. Per evitare perdita di LD, assicurarsi che qualsiasi dei lipidi raccolti nella parte superiore del tubo da 15 mL sono risospeso prima di trasferire il PNS.
    3. Prendere un 100 µ l aliquota del PNS per analisi della purezza e inserirlo in un tubo del microcentrifuge freddo 1,7 mL. Metterlo sul ghiaccio.
    4. Per rimuovere i mitocondri, centrifugare il campione PNS, non l'aliquota, in una centrifuga refrigerata ad alta velocità a 12.000 x g per 15 min a 4 ° C.
      1. Optional: per grezzo LD (CLD) isolati (con contaminazione cytosol e membrana cellulare), raccogliere il mantello lipidico superiore utilizzando una pipetta di vetro e trasferirlo in una provetta da microcentrifuga 1,7 mL. Continuare a sezione 1.4.
    5. Trasferire il surnatante postmitochondrial (PMS) in una provetta ultracentrifuga. Per evitare la perdita di LD, assicurarsi che qualsiasi dei lipidi raccolti nella parte superiore sono risospeso prima di trasferire il PMS.
    6. Prendere un 100 µ l aliquota delle POM per analisi della purezza e inserirlo in un tubo del microcentrifuge freddo 1,7 mL. Metterlo sul ghiaccio.
    7. Riempire una provetta ultracentrifuga fino all'orlo con freddo 1x IE per evitare che il tubo di collassare durante ultracentrifugazione.
    8. Bilanciare i campioni e li centrifugare in un'ultracentrifuga a 100.000 x g per 60 min a 4 ° C (Figura 1).
    9. Per rimuovere lo strato di LD, inclinare il tubo ad angolo di 45° e utilizzare una pipetta di vetro per aspirare. Trasferire il pellet a un tubo del microcentrifuge freddo 1,7 mL.
      Nota: Il pellet contiene ER isolato. Utilizzare questa frazione a valle per l'isolamento di ER.
    10. Raccogliere 100 µ l del surnatante post-ER (PER) sotto lo strato lipidico per analisi della purezza.
  4. Lavaggio di LD
    1. Aggiungere 1X PBS per la frazione di LD raccolta in un tubo del microcentrifuge 1,7, per un volume totale di 1,3 mL.
    2. Vortexare il campione.
    3. Centrifugare in una microcentrifuga alla massima velocità per 5 min a 4 ° C a pellet eventuali detriti cellulari. Riscaldare il tubo delicatamente con le mani per aiutare Risospendere lo strato di LD. Trasferire il surnatante, compreso lo strato lipidico, ad un nuovo tubo del microcentrifuge 1,7 mL.
    4. Ripetere i passaggi 1.4.1–1.4.3 2x x-3, fino a che il pellet non è più visibile.
    5. Aggiungere 1X PBS per il LD privo di pellet surnatante ad un volume finale di 1,5 mL. Lavare la frazione lipidica mediante centrifugazione in una microcentrifuga alla massima velocità per 5 min a 4 ° C.
    6. Rimuovere 1 mL di 1X PBS (sotto lo strato lipidico) con una pipetta di vetro senza alterare lo strato lipidico.
    7. Ripetere i passaggi 1.4.5 e 1.4.6 4x x-5, fino a quando il PBS 1X è visivamente trasparente con nessuna torbidità.
    8. Rimuovere tutti i PBS 1X sotto lo strato lipidico, utilizzando una pipetta di vetro (Figura 1E).
    9. Il risultato, una frazione pura di LD, utilizzato per l'analisi a valle.
  5. Quantificazione della proteina LD di dosaggio acido bicinconinico
    Nota: Non utilizzare un dosaggio di acido bicinconinico (BCA) se morfologia LD deve essere valutata.
    1. Risospendere il LD in 500 μL di PGPE 5%.
    2. Bollire i campioni per 5 min a 95 ° C, vortice e incubare i campioni a temperatura ambiente per 5 minuti raffreddare.
    3. Ripetere il passaggio 1.5.2 un addizionale x 2.
    4. Sottoporre ad ultrasuoni i campioni per 5 min con un 30 s on/off del ciclo, a media intensità.
    5. Normalizzare i campioni misurando la concentrazione nella proteina in tutti i campioni di analisi di purezza e nella frazione di LD dall'analisi di BCA.

2. isolamento LD mediante gradiente di densità di saccarosio

  1. Preparazione
    1. Fare 200 mL di buffer di TE (10 mM Tris-HCl [pH 7.4], 1 mM EDTA [pH 8,0]). Raffreddarlo mettendolo sul ghiaccio.
    2. Fai 100 mL di soluzione di saccarosio al 60% (p/v) in buffer di TE da sciogliere 60 g di saccarosio in buffer di TE, portando il volume finale a 100 mL. Raffreddarlo mettendolo sul ghiaccio.
    3. Fare 6 mL di soluzione di saccarosio al 40% (p/v) con l'aggiunta di 4 mL di saccarosio al 60% a 2 mL di buffer di TE. Raffreddarlo mettendolo sul ghiaccio.
    4. Fare 6 mL di soluzione di saccarosio al 25% (p/v) con l'aggiunta di 2,5 mL di saccarosio al 60% a 3,5 mL di buffer di TE. Raffreddarlo mettendolo sul ghiaccio.
    5. Fai 4 mL di soluzione di saccarosio al 10% (p/v) aggiungendo 0,7 mL di saccarosio al 60% a 3,3 mL di buffer di TE. Raffreddarlo mettendolo sul ghiaccio.
    6. Fai 10 mL di soluzione di inibitore di proteasi e fosfatasi aggiungendo una compressa di inibitori di proteasi e la fosfatasi a 10 mL di buffer di TE.
    7. Preparare buffer di omogenato di tessuto con l'aggiunta di 4 mL di soluzione di inibitore di proteasi e fosfatasi a 50 mL di soluzione madre di 60% saccarosio. Raffreddarlo mettendolo sul ghiaccio.
    8. Preparare il tampone di sovrapposizione con l'aggiunta di 2 mL di soluzione di inibitore di proteasi e fosfatasi a 50 mL di buffer di TE. Raffreddarlo mettendolo sul ghiaccio.
    9. Preparare 100 mL di 1X PBS diluendo 10 mL di PBS 1x 10 in 90 mL di acqua ultrapura. Raffreddarlo mettendolo sul ghiaccio.
    10. Preparare 10 mL di 5% PGPE di diluzione 500 µ l di PGPE in 9,5 mL di acqua ultrapura. Utilizzare una siringa da 1 mL per misurare fuori PGPE in quanto è viscoso. Raffreddarlo mettendolo sul ghiaccio.
    11. Raffreddare i seguenti provette da centrifuga posizionandoli sul ghiaccio: microcentrifuga 1,7 mL, provette per centrifuga da 15 mL, provette da 50 mL Centrifuga ad alta velocità e 13ml ultracentrifuga tubi.
    12. Raffreddare le centrifughe necessarie a 4 ° c: in una microcentrifuga, una centrifuga ad alta capacità (per provette da 15 mL), una centrifuga ad alta velocità (per provette da 50 mL) e un'ultracentrifuga.
  2. Preparazione tessuto
    1. Utilizzare 1.2.1–1.2.9 passaggi per preparare il tessuto per omogeneizzazione.
    2. Aggiungere 7 mL di tampone di omogenato di tessuto freddo e omogeneizzare esso su ghiaccio spostando il pestello su e giù per 20 volte. Durante i primi cinque tratti, garantire che il pestello va fino in fondo l'omogeneizzatore.
    3. Trasferire l'omogeneizzato a una centrifuga a freddo 15 mL.
    4. Sciacquare l'omogeneizzatore con 1 mL di tampone di omogenato di tessuto freddo e trasferirlo in provetta centrifugo 15ml utilizzato in precedenza.
    5. Portare il volume dell'omogenato fino a 10 mL con buffer di omogenato di tessuto.
    6. Centrifugare il campione in una centrifuga ad alta capacità a 1.000 x g per 10 min a 4 ° C.
    7. Trasferimento 8 mL di surnatante in una provetta da centrifuga 50 mL.
    8. Trasferire 100 µ l del surnatante rimanente come campione PNS per analisi della purezza.
  3. Gradiente di saccarosio
    1. Inclinare la provetta da centrifuga 50 mL contenente 8 mL di PNS un'angolazione di 45°. Aggiungere con cautela 6 mL di soluzione di saccarosio al 40%, garantendo che le due fasi soggiorno separate.
    2. In modo simile, lentamente aggiungere 6 mL di soluzione di saccarosio al 25%; quindi, aggiungere 4 mL di soluzione di saccarosio al 10%; Infine, aggiungere 8 mL di tampone di sovrapposizione.
    3. Centrifugare il campione in una centrifuga ad alta velocità a 30.000 x g a 4 ° C per 30 min.
    4. Trasferire lo strato superiore contenente il LDs per un tubo del microcentrifuge 1,7 mL.
    5. Per il lavaggio di LD, attenersi alla procedura nella sezione 1.4.

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Risultati

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Abbiamo effettuato l'isolamento di LD con il kit ER su circa 30 topi e confrontato i risultati con quelli che seguono il protocollo di isolamento del saccarosio su circa 40 topi. I risultati segnalati sono tipici per entrambi i protocolli. Topi sono stati tenuti a digiuno durante la notte con libero accesso all'acqua, per aumentare il rendimento di LD. Isolamento di LD utilizzando un gradiente di saccarosio è stato eseguito in parallelo con il kit di ER protocollo di isolamento del LD. Ca...

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Discussione

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Biologia di LD epatica sempre più sta riconoscenda come regolatore critico della fisiologia epatocellulare in salute e malattia. Come buona fede organelli, LDs sono dinamici, interagire con altre strutture cellulari e contengono all'interno dei loro componenti bioattivi coinvolti nell'omeostasi del glucosio e del lipido. Il gradiente di saccarosio è usato ordinariamente per l'isolamento di LD e consente ai ricercatori di studiare la struttura della LD, ma richiede loro di fare numerosi buffer. Abbiamo dimostrato che l'us...

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Dichiarazioni

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dr. Carr riceve il sostegno alla ricerca da intercettare Pharmaceuticals.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ringraziamo la famiglia Abramson Cancer Research Institute. Questo lavoro è supportato dalle seguenti concessioni: NIH/NIAAA R01 AA026302-01, NIH/NIAAA K08-AA021424, Robert Wood Johnson Foundation, Harold Amos medica facoltà Development Award, 7158, IDOM DRC Pilot Award P30 DK019525 (r.m.c.); NIH/NIAAA F32-AA024347 (J.C.). Questo lavoro è stato sostenuto in parte da NIH P30-DK050306 e suoi servizi di nucleo (patologia molecolare e di Imaging, biologia molecolare/Gene Expression Core e cella cultura Core) e il suo pilota programma di sussidi. Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresentano necessariamente il punto di vista ufficiale del National Institutes of Health.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
BioExpress Vortex MixerGeneMateS-3200-1Centrifuga Vortex Mixer
54242 REppendorf54242 RRefrigerato Counter Microcentrifuge
Rotore: FA-45-24-11
Centrifuga Sorvall RC6 +Thermo ScientificRC6 +Centrifuga refrigerata ad alta velocità
Rotore: F21S-8x50y
Centrifuga Sorvall Legend RT+Thermo ScientificLegend RT+Centrifuga refrigerata ad alta capacità
Rotore: 75006445 Secchio: 75006441
cOmplete Proteasi Inibitore CocktailSigma Aldrich04 693 116 001Compresse Inibitore della proteasi
Diagenode Bioruptur UCD-200DiagenodeUCD-200Sistema di sonicazione
Dounce Tissue Grinder (45 mL)Wheaton357546Use Pestello sciolto
Kit di isolamento del reticolo endoplasmatico tamponato con fosfato di Dulbecco (1x)Corning21-031-CM
Sigma AldrichER0100Per il kit ER Estrazione:
Contiene:
Tampone di estrazione isotonica 5X 100 mL
Tampone di estrazione ipotonica 10 mL
Cloruro di calcio, soluzione 2,5 M 5 mL
OptiPrep Gradiente di densità Medium 100 mL
Ago dal naso smussato 1 ea.
Sorgente luminosa esterna per eccitazione fluorescenteLeicaLeica EL6000
Acido cloridricoSigma AldrichH1758Acido cloridrico
ImageJSoftware di analisi delle immagini
Microscopio a contrasto modulante invertito LeicaDM IRB
per tessuti e cellule in colturaThermo Fisher Scientific89839Per microscopio per isolamento lisosomiale
FotocameraQimagingQICAM fast 1394
Optima XL-100K UltracentrifugaBeckman-CoulterXL-100KUltracentrifuge
Rotore: SW41Ti
Pasteur PipetteFisher Scientific22-042817
Piastra di Petri 5 cmFisher ScientificFB0875713A
Kit per il dosaggio delle proteine BCA PierceThermo Fisher Scientific23225
PhosSTOPSigma Aldrich04 906 845 001Compresse di inibitore della fosfatasi
Lama chirurgica sterile #10PioneerS2646
SaccarosioFisher ScientificS5-500cristallino/certificato ACS
Stanbio 2200-225Kit di trigliceridi colorimetrici
Tris BaseFisher ScientificBP152-1Per tampone TE
Triton X-100Fisher BioReagentsBP151-1005%, Polietilenglicole p-(1,1,3,3-tetrametilbutil)-fenil etere, Reagente per lisi proteica
EDTA ultrapuro (0,5 M, pH 8,0)Thermo Fisher Scientific15575-038Per tampone TE
Kit per arricchimento lisosomico Leica DM IRB Kit Liquicolor

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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