Elettroforesi ibrida trasparente/blu nativa per la separazione e l'analisi dei supercomplessi di catene respiratorie mitocondriali

Sommario

Qui presentiamo un protocollo per estrarre, risolvere e identificare i supercomplessi mitocondriali che minimizzano l'esposizione ai detergenti e a Coomassie Blue. Questo protocollo offre un equilibrio ottimale tra la risoluzione e la conservazione delle attività enzimatiche, riducendo al minimo il rischio di perdere le interazioni proteina-proteina labile.

Abstract

Complessi della fosforilazione ossidativa formano arrangiamenti proteici supramolecolari denominati supercomplessi (SCs), che sono creduti per conferire vantaggi strutturali e funzionali ai mitocondri. Le SCs sono state identificate in molte specie, dal lievito al mammifero, e un numero crescente di studi segnala la rottura della loro organizzazione in malattie umane genetiche e acquisite. Di conseguenza, un numero crescente di laboratori è interessato ad analizzare le SCs, che possono essere metodologicamente impegnative. Questo articolo presenta un protocollo ottimizzato che unisce i vantaggi dei metodi Blue-e Clear-native PAGE per risolvere e analizzare SCs in modo efficace nel tempo. Con questo metodo ibrido CN/BN-PAGE, le SCs mitocondriali estratte con una quantità ottimale della digitonina detergente lieve sono esposte brevemente al colorante anionico Coomassie Blue (CB) all'inizio dell'elettroforesi, senza esposizione ad altri detergenti. Questa breve esposizione a CB consente di separare e risolvere SCs in modo efficace come con i metodi tradizionali BN-PAGE, evitando l'impatto negativo di alti livelli di CB sui dosaggi di attività in-gel, e le interazioni proteine-proteina labile all'interno di SCs. Con questo protocollo è quindi possibile combinare in modo preciso e rapido le misurazioni dell'attività del gel con tecniche analitiche che coinvolgono l'elettroforesi 2D, l'immuno-Detection e/o la proteomica per l'analisi avanzata delle SCs.

Introduzione

I mitocondri producono energia attraverso la fosforilazione ossidativa, dove I complessi respiratori I-II-III-IV ossidano I substrati e trasferiscono gli elettroni all'ossigeno, generando un gradiente che consente la fosforilazione dell'ADP da parte dell'ATP sintasi (CV). Negli ultimi anni, studi approfonditi hanno dimostrato che i complessi di catene respiratorie non sono esclusivamente incorporati in modo lineare nella membrana mitocondriale interna, ma sono anche organizzati in supercomplessi (SCS) arrangiamenti^1,2. Nei mitocondri dei mammiferi, le SCs esistono in diversi stochiometrie: CI/CIII₂/civ_1-4 (che è chiamato il respirasome, e che è in grado di NADH: O₂ ossidoreduction in vitro)², ci/CIII₂, e CIII₂ /CIV_1-2^3,4. Inoltre, i complessi respiratori sono distribuiti sotto diversi rapporti tra la loro forma libera e gli accordi SCs. Pertanto, si stima che l'85% – 100% di CI, 55% – 65% di CIII, e 15% – 25% di CIV si trovano in SCs⁴. Queste strutture supramolecolari sono pensate per diminuire la produzione di ROS, stabilizzare o assistere nell'assemblaggio di singoli complessi, regolare l'attività della catena respiratoria, e prevenire l'aggregazione proteica nella proteina ricca membrana mitocondriale interna^{5 ,6,7,8}. La loro capacità di rimodellamento su variazione della domanda di energia e la loro importanza nella patogenesi delle malattie è indagata in diversi laboratori^{3,7,9,10, 11} il ^{, 12} anni di ^{, 13} anni di ^{, 14}. studi hanno dimostrato che i cambiamenti patologici nell'assemblaggio SCS sono presenti in una varietà di disturbi, tra cui, ma non limitati a, difetto genetico nella sintesi cardiolipina¹⁵, insufficienza cardiaca¹⁶, ischemia-riperfusione¹⁷, diabete¹², e l'invecchiamento¹⁸.

L'elettroforesi nativa e l'immunorilevamento sono ampiamente utilizzati negli studi SCS per risolvere i complessi di OXPHOS accordi quaternari^2,19,20,21. L'elettroforesi nativa può essere ulteriormente combinata con specifiche in saggi di attività del gel o pagina 2D-SDS per consentire una precisa determinazione molecolare dei vari assemblaggi SCS^1,19. La capacità di studiare le SCs dipende in modo critico dalle condizioni di estrazione, tra cui il tipo e la concentrazione di detergente utilizzato, la forza ionica e il pH, nonché sulle condizioni di migrazione elettroforetica, che comprendono la composizione del tampone, la presenza di CB, gel percentuale di acrilammide².

I protocolli e la risoluzione della banda SCs variano notevolmente tra le carte, rendendo difficile il confronto tra gli studi e l'adattamento dei metodi impegnativi²². Pertanto, questo documento propone un protocollo robusto e ottimale per estrarre SCs da mitocondri isolati di diverse fonti con la digitonina detergente non ionica e per risolvere bande SCs ad alto peso molecolare. La concentrazione ottimizzata del detergente, la composizione del tampone di estrazione e l'assenza di Coomassie Blue nella preparazione del campione riducono al minimo l'interruzione dei complessi proteici. Questo protocollo (Vedi Figura 1 per una panoramica) combina CN-page e BN-page per una risoluzione ottimale degli assiemi SCS su un grande gel ed è compatibile con i saggi di attività in-gel permettendo una migliore visualizzazione delle bande reattive, insieme all'uso di immunorilevazione per un'analisi dettagliata accordi e composizione SCs.

Protocollo

1. estrazione SC

1. Preparare 100 mL di tampone di estrazione (vedere tabella 2) dissolvendo l'EDTA in acqua. Aumentare il pH con KOH fino a completa dissoluzione, quindi regolare il pH a 7,5 con HCl. aggiungere i componenti rimanenti alla soluzione, completare il volume finale con acqua, e mantenere il ghiaccio. In un tubo, sciogliere la digitonina nel tampone di estrazione per fare una soluzione di magazzino del 10%, agitare accuratamente fino a completa dissoluzione e mantenere il ghiaccio.
   Nota: il tampone di estrazione può essere preparato in anticipo e mantenuto a 4 ° c per un massimo di 2 mesi. Se le bande ondulate iniziano ad apparire nella parte inferiore del gel, significa che il buffer di estrazione è troppo vecchio. Quando si prepara la soluzione di digitonina al 10%, preparare un volume di stock che conta 500 μL per campione se si utilizzano mitocondri epatici del topo. La solubilità della digitonina varia in base alla provenienza e al lotto di prodotto (vedere tabella dei materiali).
2. I mitocondri isolati dal tessuto animale (cuore del topo, muscolo, fegato; cuore di ratto) o cellule (fibroblasti umani) utilizzando protocolli standard^23,24,25 possono essere utilizzati per l'estrazione di SCS. Una volta ottenuti i mitocondri, quantificare il contenuto proteico utilizzando il kit di saggio acido bicinchoninico secondo le raccomandazioni del fabbricante. Integrare mitocondri isolati con proteasi e inibitori della fosfatasi in questo passaggio, se necessario.
   Nota: le SCs possono essere estratte su mitocondri freschi o scongelati. Si raccomanda di estrarre SCs da tutti i campioni allo stesso tempo, per assicurare che siano trattati con gli stessi lotti di soluzioni e alle stesse condizioni.
3. Sulla base della concentrazione proteica mitocondriale ottenuta, e il rapporto finale digitonin/proteina desiderata, calcolare il volume della soluzione di stock digitonina e tampone di estrazione richiesto secondo la tabella 1. Per l'estrazione SC, aggiungere 1 μL di tampone di estrazione (tabella 2) contenente digitonina per ogni 10 μg di proteina mitocondriale. Il rapporto digitonin/proteina può variare da 2 a 8 g/g. Una titolazione digitonina deve essere sempre eseguita per ogni nuovo tipo di campione utilizzato ( vedere Figura 2 per un esempio).
4. Mitocondri a pellet, in un tubo da 1,5 mL per centrifugazione a 16.000 x g per 10 min a 4 ° c.
5. Eliminare il surnatante e risospendere il pellet mitocondriale nel volume calcolato del tampone di estrazione di ghiaccio-freddo contenente digitonina. Posizionare i tubi su un mini-rotore e incubare per 30 minuti a 4 ° c ad una velocità di rotazione media. Assicurarsi che i campioni siano sempre mescolati correttamente.
6. Centrifugare campioni a 20.400 x g per 45 min a 4 ° c per rimuovere i frammenti insolubilizzati.
7. Trasferisci il supernatante in un nuovo tubo sul ghiaccio e quantifica le proteine. Questa frazione rappresenta l'Estratto dei supercomplessi respiratori. Se l'elettroforesi non viene eseguita nello stesso giorno, conservare i campioni a-80 ° c.
   Nota: 1) evitare di congelare/scongelare i cicli dell'estratto, in quanto questo interrompe le disposizioni molecolari più elevate di SCs. aliquota del campione prima del primo ciclo di congelamento/scongelamento, se necessario. 2) per eseguire un esperimento BN-PAGE standard, CB deve essere aggiunto all'Estratto SCs in questo passaggio. CB deve essere aggiunto in un rapporto 1G/8G rispetto alla quantità di detergente utilizzato.

2. gradiente gel colata ed elettroforesi

1. Preparare 3 tamponi sfumati e acrilammide per rendere il gel sfumato, l'aliquota e conservare a-20 ° c (vedere tabella 3).
2. Preparare i tamponi di anodo e catodo e conservarli a 4 ° c (vedere tabella 5).
3. Aprire la camera di colata e posizionare una lastra di vetro esterna (20 cm x 22 cm) nella camera. Posizionare un set di distanziali (1,5 mm) utilizzando la scheda di allineamento per assicurarsi che siano seduti saldamente contro il lato e gli angoli della camera. Posizionare una lastra di vetro interna (20 cm x 20 cm) sulla parte superiore dei distanziali (questo forma il sandwich gel), e mettere un foglio di separazione di plastica sulla parte superiore della lastra di vetro.
4. Ripetere il passaggio 2,3 fino a raggiungere il numero desiderato di gel da lanciare. Per questo protocollo, 4 gel sono casted. Il sistema di camera di colata che usiamo (Vedi tabella dei materiali) permette la colata di un massimo di 10 gel alla volta. Raccogliere lo spazio rimanente nella camera aggiungendo prima come molti blocchi acrilici come necessario, e poi piastre di vetro, se necessario.
   Nota: il montaggio deve essere ermeticamente sigillato; non ci dovrebbe essere spazio tra i panini gel nella camera.
5. Collocare una striscia di parafilm nella scanalatura prima di posizionare saldamente la guarnizione nella tacca della guarnizione. Posizionare la piastra di tenuta sulla camera e serrare tutte e 6 le viti. Sopporto la camera di colata.
6. Posizionare l'ex gradiente su una piastra di agitazione con un agitatore magnetico nella camera di miscelazione "leggera". Collegare il tubo della camera di colata alla pendenza precedente, fissare il tubo nella cassetta della pompa peristaltica, e assicurarsi che il rubinetto del gradiente precedente è chiuso.
7. Per lanciare 4 gel, preparare 60 mL di 4% e 60 mL di soluzione di gel al 12% (vedere tabella 4) in un pallone Erlenmeyer e agitare accuratamente per miscelare. Versare 60 mL di soluzione di gel al 4% nella camera di miscelazione "leggera" e 60 mL di 12% nella camera del serbatoio "pesante" del gradiente precedente. Impostare la velocità di agitazione della piastra di agitazione a 350 giri/min. Aprire il rubinetto di arresto e accendere la pompa a 35 giri/min.
8. Una volta che la frazione di luce è inferiore alla frazione pesante, mettere in pausa la pompa e aprire lo stelo della valvola tra serbatoi "leggeri" e "pesanti", lasciare che le frazioni bilanciano il volume, e riavviare la pompa.
   Nota: è importante che nessuna bolla entri nel sistema e venga intrappolata tra le piastre di vetro. In questo caso, annullare il montaggio, lavare e rifare.
9. Una volta che il gel gradiente è completamente versato, fermare la pompa, e sovrapporre acqua (circa 1 mL) su ogni sandwich gel per evitare l'essiccazione del gel. Lasciate polimerizzare per 2 h.
10. Preparare 25 mL di gel di impilamento in Erlenmeyer e agitare per mescolare accuratamente. Rimuovere l'acqua e inserire 15 ben pettini in ogni sandwich di gel. Versare il gel di impilamento e lasciare polimerizzare per 2 h.
    Nota: i gel possono essere calcinati e conservati a 4 ° c per 1 settimana.
11. Inserire il gel nei morsetti a sandwich e rimuovere il pettine. Con la piastra di vetro corta rivolta verso il basso, inserire il sandwich gel nel nucleo di raffreddamento. Ripetere sull'altro lato e posizionare il nucleo nel serbatoio dell'elettroforesi.
12. Versare 300 mL di tampone catodo blu nella camera interna del serbatoio dell'elettroforesi. Versare 2 L di tampone anodo nella camera esterna del serbatoio di elettroforesi.
    Nota: l'elettrodo deve essere immerso nel tampone catodo, che richiede approssimativamente 300 mL.
13. Carico tra 75 μg e 175 μg di proteina per pozzetto. Eseguire gel a 150 V per 1,5 h (o fino a quando i campioni sono entrati nel gel sfumato) in ambiente freddo (4 ° c).
    Nota 1:1) per una buona risoluzione delle bande di attività in gel è necessario un minimo di 75 μg per pozzetto. Il caricamento di oltre 175 μg di proteine porterà a una perdita di bande chiare a causa dell'eccessiva attività enzimatica. 2) i replicati del campione devono essere caricati in pozzetti separati per consentire la determinazione parallela delle attività in-gel e l'analisi immunoblot dei complessi OXPHOS. La determinazione parallela di IGA per CI, CII, CIV e CV richiede un minimo di 300 μg. l'analisi parallela di immunoblot di CI, CII, CII, CIV e CV richiede un minimo di 375 μg.
14. Rimuovere il tampone catodo blu con il Pipet o il vuoto, sostituirlo con 300 mL di Coomassie Blue-Free catodo buffer, e eseguire il gel a 200 V durante la notte (16 – 20 h) in camera fredda (4 ° c). Procedere al punto 3 o 4 per la misurazione dell'attività in-gel o immunoblotting.

3. attività in-gel per I complessi I, II, IV e CV

1. Prima della fine dell'elettroforesi, preparare i tamponi di attività in gel secondo la tabella 6, e tenere al buio a RT. 20 ml di tampone di attività in gel sono sufficienti per 3 corsie di campionamento.
   Nota: questo test di attività in-gel di CV si basa sull'attività inversa di ATPsynthase (ad esempio, l'idrolisi dell'ATP) e utilizza il calcio come co-fattore, che precipita nel gel. Il calcio è meno dannoso del piombo utilizzato in altri protocolli. Inoltre, l'uso di questo protocollo non richiede una pre-attivazione/condizionamento del gel²³.
2. Fermare l'elettroforesi e recuperare il gel. Tagliare corsie, se necessario, e trasferire corsie in gel in sacchetti di plastica (3 lati tagliati, e sacchetto di plastica aperto come un libro). Sigillare 2 dei 3 lati con un sigillante di calore.
   Nota: per confrontare la composizione delle bande SC tra gruppi sperimentali, si consiglia di eseguire gli stessi campioni in repliche sullo stesso gel. Tagliare le corsie per incubare ogni replica in diversi buffer di attività in-gel (CI, II, IV, V). Per confermare la specificità dei saggi, ulteriori repliche possono essere preparate per l'esecuzione in attività di gel in presenza di specifici inibitori della catena respiratoria.
3. Per 3 campioni sperimentali (cioè 3 pozzetti), aggiungere 20 mL di tampone di attività in gel, rimuovere le bolle e sigillare il 4^° lato del sacchetto di plastica.
   Nota: aggiungere inibitori negli esperimenti di controllo negativo se eseguiti: CI: rotenone 1 μM; CII: malonato di sodio 10 mM; CIII: Antimicina-A 8 μM; CIV: KCN 0,6 mM; CV: oligomicina 0,5 μM.
4. Incubare le corsie di gel a 37 ° c al buio e controllare ogni 15 min. il tempo di incubazione varia a seconda della quantità di proteine e complessi. CI reagirà più velocemente di CIV o CV. colorazione ottimale di solito si verifica dopo 2 h per CI, 4 h per CIV e 6 h per CII e CV.
5. Sciacquare le corsie di gel in acqua per fermare la reazione, e l'immagine su uno sfondo bianco per CI, CII, CIV, o sfondo nero per CV.
   Nota: i gel possono essere conservati in sacchetti di plastica a RT o 4 ° c per diversi mesi.

4. immunoblotting

1. Preparare il buffer di trasferimento secondo la tabella 7, e tenere a RT. preparare TBST e tenere a RT.
2. Posizionare l'intero gel, o corsie selezionate, in un contenitore e aggiungere tampone di trasferimento integrato con SDS (0,25% finale nel buffer di trasferimento). Posizionare il contenitore sul bilanciere e incubare per 1 h.
3. Tagliare la membrana in PVDF (dimensioni corrispondenti alle dimensioni del gel) e attivare in 20 mL di metanolo sotto agitazione per 2 min. sostituire con tampone di trasferimento da 20 mL e posizionarlo sotto agitazione per 2 min.
4. Preparare il panino di trasferimento, dal basso verso l'alto, assicurandosi che non vi sia alcuna bolla tra gel e membrana PVDF attivata: lato chiaro della cassetta/spugna nera/carta assorbente/membrana/gel/carta assorbente/spugna nera/lato nero della cassetta. Chiudere e bloccare il cassetto.
5. Posizionare sandwich di trasferimento nel serbatoio di trasferimento, con il lato chiaro del panino rivolto verso il lato rosso dell'elettrodo, e versare il tampone di trasferimento per immergere il gel. Collegare il sistema di raffreddamento al serbatoio di trasferimento e impostare a 4 ° c. Collegare all'alimentatore, impostare a 40 mA, e correre per 24 h.
6. Recuperare le membrane, bloccare 1 h in 5% BSA in TBST e incubare in soluzione anticorpale primaria preparata in 5% BSA in TBST durante la notte a 4 ° c.
   Nota: vedere tabella 8 per gli anticorpi utilizzati.
7. Sciacquare le membrane in TBST 3x per 10 min ciascuna.
8. Incubare le membrane in soluzioni anticorpali secondarie preparate in 5% BSA in TBST per 2 ore a temperatura ambiente.
9. Sciacquare le membrane in TBST 3x per 10 min ciascuna.
10. Aggiungere la soluzione chemiluminescente alle membrane e all'immagine.

5. analisi dei

1. Le immagini di analisi in-gel o immunoblot possono essere utilizzate per analizzare SCS. Per analizzare la composizione delle bande, allineare i replicati e convalidare quale complesso ha reagito positivamente per ogni banda specificata.
2. Per analizzare la distribuzione di complessi, in vari assemblaggi supramolecolari, aprire le immagini in ImageJ e utilizzare lo strumento di analisi del gel (vedere Figura 5 per un esempio).
   1. Selezionare le corsie con lo strumento rettangolo e tracciare le corsie.
   2. Tracciare le linee per chiudere l'area sotto la curva di ciascuna banda di interesse e fare clic su ogni area con lo strumento bacchetta per generare una tabella contenente l'area sotto i valori della curva.
   3. Per calcolare la distribuzione del complesso, riportare i valori per ogni banda rispetto a quello del monomero.

Risultati

La Figura 2 Mostra i risultati di un esperimento di titolazione della digitonina finalizzato a identificare la quantità corretta di digitonina necessaria per l'estrazione di SCS. Questo importo varierà a seconda del tipo di tessuto/cellula e se il campione è stato congelato o meno. Per questo esperimento, un'attività in-gel CIV è stata eseguita per visualizzare SCs isolati dai mitocondri del fegato di topo fresco. Sono stati testati rapporti da 2/1 a 10/1 g di digitonina/g di proteina. La quantità ottimale di digitonina per questo campione è di 4 g/g, in quanto fornisce una buona risoluzione del CIV monomerica e SCs ad alto peso molecolare. A un rapporto inferiore, le bande non sono chiare e si risolvono in uno striscio durante l'elettroforesi, mentre l'uso di un rapporto più elevato di digitonina porta alla rottura dell'alto peso molecolare SC.

La Figura 3 e la Figura 4 mostrano i risultati di un esperimento completo eseguito su una preparazione di mitocondri epatici del topo estratti con 4 g di proteina digitonin/g. Le proteine sono state separate usando BN/CN-PAGE ibrido, BN-page standard o CN-PAGE. Tutti e tre i gel sono stati fusi allo stesso tempo e le corsie sono state caricate con repliche dello stesso campione. Dopo l'elettroforesi, le corsie individuali sono state tagliate e lavorate per la misurazione dell'attività del gel (CI, CII, CIV e CV sulla Figura 3) e immunoblotting (ci, CII, CIII, CIV, CV sulla Figura 4).

L'aggiunta di CB momentaneamente in tampone catodo (cioè ibrido CN/BN-PAGE) o nel tampone di campionamento e catodo per tutta l'elettroforesi (cioè BN-PAGE), migliora considerevolmente la mobilità e la risoluzione delle bande SC e dei singoli complessi respiratori rispetto a CN-PAGE (Figura 3). Le bande sono facilmente distinguibili con la tecnica ibrida o BN-PAGE dopo attività in-gel per CIV, mentre nello stesso campione risolto da CN-PAGE, SCs e monomerica CIV bande reattive non possono essere identificati.

Figura 3 e Figura 4 mostrano che la risoluzione e il modello di banding di monomeri OXPHOS e assemblaggi supramolecolari è qualitativamente paragonabile tra ibrido CN/BN-PAGE e BN-page. Tuttavia, esistono notevoli differenze. In primo luogo, la mobilità elettroforetica dei complessi OXPHOS è leggermente ridotta quando le proteine vengono separate utilizzando le condizioni ibride CN/BN-PAGE vs standard BN-page, a causa della ridotta quantità di CB. Questo spostamento di mobilità è maggiore per i monomeri CIV, seguita da monomeri CV, e CI (Figura 3 e Figura 4). In secondo luogo, lo sfondo blu è più basso nella CN/BN-PAGE ibrida rispetto a BN-PAGE (Figura 3, corsie sinistre). Di conseguenza, alti livelli di sfondo dopo BN-page maschera completamente la colorazione di attività in-gel per CII, e migliora il rumore di fondo associato con l'attività di dimeri CIV (Figura 3). In terzo luogo, l'attività del CV è maggiore quando i campioni vengono eseguiti in condizioni ibride CN/BN-PAGE rispetto a BN-PAGE (Figura 3), a causa della ridotta quantità di CB, che è noto per interferire con l'attività catalitica CV. ²⁶ CN/BN-Page consente inoltre una migliore conservazione degli assemblaggi supramolecolari CV, come dimostrato da una maggiore proporzione di attività CV totale associata a dimeri CV (Figura 3). Inoltre, gli oligomeri CV sono visibili sotto CN/BN-PAGE, mentre sono completamente dissociati in condizioni BN-PAGE. È interessante notare che le bande distinte che visualizzano l'attività CV sono osservate anche tra Monomeri CV e dimeri, quando i campioni vengono eseguiti sotto CN/BN-PAGE (Figura 2).

La Figura 5 Mostra un'analisi rappresentativa della distribuzione complessa di OXPHOS nelle assemblee supramolecolari. L'immagine mostra CI in gel attività di campioni ottenuti da 4 distinti sani del fegato dei mitocondri preparazioni. L'analisi della densitometria consente di misurare l'area sotto la curva delle bande CI-reattive e di presentare la distribuzione relativa dell'attività C1 nelle forme monomerica (I₁) e supramolecolari (i₁III₂, i₁III₂IV ₁, I₁III₂IV_n). Un'analisi simile può essere eseguita dopo immunoblot.

Figura 1: flusso di lavoro del saggio. Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.

Figura 2: titolazione della digitonina per estrarre i supercomplessi dai mitocondri epatici del topo fresco. Questo esempio mostra le aliquote dei mitocondri epatici del topo, isolate da un animale che è stato trattato con quantità crescenti di digitonina per estrarre i supercomplessi respiratori. I campioni sono stati poi risolti da CN/BN pagina ibrida, e l'attività in-gel di CIV è stato determinato. CIV₁: monomeri IV complessi; CIV₂: dimeri IV complessi; SC: supercomplessi. Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.

Figura 3: attività in-gel di complessi OXPHOS a seguito di ibrido CN/BN-page, BN-page o CN-page. Mitocondri epatici isolati da un topo sono stati trattati con digitonina (4 g/g rapporto digotonin/proteina) per estrarre i supercomplessi respiratori. Le aliquote di questo campione sono state poi caricate su più pozzi in tre gel distinti e inviate a CN/BN-page, BN-page o CN-PAGE. Ogni corsia replicata all'interno di ogni gel è stata poi tagliata e immediatamente utilizzata per i saggi di attività in-gel (etichettati CI, CII, CIV e CV). Una corsia è stata utilizzata come controllo per mostrare la colorazione di sfondo (con etichetta BG) con Coomassie Blue. I complessi OXPHOS e le assemblee supramolecolari sono identificati utilizzando la nomenclatura standard, con numeri in indici che indicano la stechiometria molecolare di ogni complesso OXPHOS. Va notato che la posizione delle assemblee supramolecolari contenenti CIII si basa sull'immunorilevazione poiché l'attività in-gel per CIII non è stata eseguita in questo particolare esperimento. Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.

Figura 4: analisi immunoblot dei complessi OXPHOS a seguito di CN/BN-page ibrido o BN-page. Replicati dagli esperimenti descritti nella Figura 3 legenda sono stati elettro-trasferiti su una singola membrana. Dopo il trasferimento, le corsie individuali sono state tagliate e incubate con anticorpi specifici che riconoscono CI, CII, CIII, CIV e CV. i complessi OXPHOS e le assemblee supramolecolari sono identificati utilizzando la nomenclatura standard, con numeri in indici che indicano la stechiometria molecolare di ogni complesso di OXPHOS. Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.

Figura 5: quantificazione della distribuzione di ci negli assemblaggi monomerici e supramolecolari. (A) attività di ci in-gel determinata in seguito a CN/BN-pagina ibrida dei mitocondri epatici estratti di SC ottenuti da 4 topi. B) i densitogrammi ottenuti utilizzando lo strumento di analisi del gel di ImageJ che mostra picchi distinti corrispondenti ai monomeri ci (i₁) e a vari complessi supramolecolari contenenti ci (i₁III₂, i₁III₂IV₁ e I₁III₂IV_n). C) quantificazione della distribuzione relativa dell'attività C1. I dati rappresentano media e SEM dei 4 topi. Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.

Rapporto digitonina/proteina (g/g)	2 g/g	4 g/g	6 g/g	8 g/g
Volume del tampone di estrazione (μL)	400 a	300 a	200 a	100 a
Volume del 10% di stock digitonina (μL)	100 a	200 a	300 a	400 a
Volume totale tampone di estrazione (μL)	500 a	500 a	500 a	500 a

Tabella 1: volumi necessari per estrarre le SCs da 5 mg di proteine mitocondriali utilizzando vari rapporti digitonici/proteina.

composto	Concentrazione finale
EDTA, pH 7,5	di 1 mM
HEPES	di 30 mM
Acetato di potassio	150mm
Glicerolo	12
Acido 6-aminocaproico	di 2 mM

Tabella 2: tampone di estrazione SC (concentrazioni finali). Conservare a 4 ° c per un massimo di 3 mesi.

composto	Concentrazione finale
3x gel tampone: Aliquota e conservare a-20 ° c, pH 7,5
Imidazolo/HCl pH-7,0	75 mM
Acido 6-aminocaproico	1,5 M
Tampone di acrilammide: Aliquota e conservare a-20 ° c
Acrilammide	99,5% di
Bis-acrilammide	3

Tabella 3: tamponi di riserva di gel.

Per 2 gel:	4% (60 mL)	12% (60 mL)	Impilamento (4%) (25 mL)
3X tampone gel	19,8 mL di	19,8 mL di	8,25 mL di
Tampone in acrilammide	4,8 mL di	14,4 mL di	2 mL di
H2O	35 mL di	13,1 mL di	14,6 mL di
Glicerolo	-	12 mL di	-
APS 10%	360 μL di microlitro	60 μL di microlitro	150 μL di microlitro
TEMED	24 μL di	12 μL di	10 μL di

Tabella 4:4% – 12% gel sfumato.

composto	Concentrazione finale
Tampone anodo: conservare a 4 ° c, pH 7,5
Imidazolo	di 25 mM
Tampone catodico: conservare a 4 ° c, pH 7,5
Il tricino	50mm
Imidazolo	7,5 mM
Con o senza Coomassie Blue (G250)	0,022% di

Tabella 5: tamponi per elettroforesi.

composto	Concentrazione finale
Attività complessa I buffer: preparare fresco in 5 mM TRIS-HCl pH 7,4
Nitrotetrazolium blu	di 3 mM
Nadh	di 14 mM
Complesso di attività II buffer: preparare fresco in 5 mM TRIS-HCl pH 7,4
Succinato	di 20 mM
PMSF	0,2 mM
Nitrotetrazolium blu	di 3 mM
Complesso di attività IV buffer: preparare fresco in 50 mM na-fosfato pH 7,2
Citocromo C	0,05 mM
Diaminobenzidina	2,3 mM
Attività ATPsynthase tampone: preparare fresco in acqua, regolare il pH a 8 con KOH
Glicina	50mm
MgCl2	di 5 mM
HEPES	50mm
CaCl2	di 30 mM
Atp	di 5 mM

Tabella 6: tamponi di analisi dell'attività in-gel.

composto	Concentrazione finale
Buffer di trasferimento
Base tris	di 25 mM
Glicina	192 mM
Sds	4
metanolo	20
Tbst
Base tris	di 20 mM
Nacl	137 mM
Di Tween 20	0,1% di

Tabella 7: tamponi immunoblotting.

complesso	Subunità	clone m
Ho	NDUFA9	20C11B11B11
Ii	SDHA	2E3GC12FB2AE2
Iii	UQCRC2	13G12AF12BB11
Iv	COX4	1D6E1A8
Presso	Di ATPB	3D5

Tabella 8: anticorpi usati per immunoblotting per rilevare la catena respiratoria SC. Vedere la tabella dei materiali per le aziende e i numeri di lotto.

Discussione

I supercomplessi mitocondriali sono attivamente studiati per chiarire il loro ruolo fisiologico, e la loro importanza nella patogenesi di numerose malattie umane, siano esse acquisite o malattie mitocondriali genetiche^{3,7 , 9} il ^{, 10} il ^{, 11} il ^{, 12} anni di ^{, 13} anni di ^{, 14}. al fine di ottenere risultati affidabili, occorre considerare diversi aspetti. Questo protocollo è stato testato con mitocondri del fegato del topo, mitocondri del muscolo scheletrico del topo (risultati non mostrati), mitocondri cardiaci del ratto e mitocondri del fibroblasto umano (risultati non mostrati), ma potrebbe certamente essere adattato ad altre fonti di isolati Mitocondri. Il metodo combina in modo ottimale vari aspetti dei protocolli BN e CN-page, che permettono di ridurre al minimo l'esposizione ai detergenti e ai composti anionici rispetto ai protocolli pubblicati^20,27,28.

Preparazione del campione

La preparazione dei campioni rappresenta un passo cruciale per una riuscita separazione delle SCs. la composizione del buffer deve essere accuratamente selezionata per ottenere una corretta solubilizzazione delle proteine e delle proteine assemblate, preservando al massimo il più possibile la loro funzionalità e l'integrità strutturale. La forza ionica e il pH del tampone di estrazione sono due fattori importanti da considerare. Le concentrazioni di sale che sono troppo basse (< 50 mM K-acetato o NaCl) si tradurranno in una scarsa solubilizzazione delle proteine in presenza di detergenti non ionici, mentre le concentrazioni saline superiori a 500 mM promuoveranno l'accumulo/aggregazione di proteine e la precipitazione di CB e proteine²⁹. Le SCs devono quindi essere estratte utilizzando tamponi a resistenza ionica quasi fisiologica. Per quanto riguarda il pH, si raccomanda l'uso di un pH quasi fisiologico.

Il tipo di detergente e il rapporto detergente/proteico sono anche fondamentali per un'estrazione SC ottimale. Per la massima conservazione delle SCs native, si preferisce la digitonina²⁶. Come indicato nel presente protocollo e in altri metodi pubblicati^23,30,31,32, questo detergente delicato conserva la composizione supramolecolare di più assemblaggi di SC e i struttura oligomererica di ATPsynthase (Figura 3 e Figura 4). La titolazione dei campioni di interesse con varie quantità di digitonina è critica al fine di identificare le condizioni che consentono una solubilizzazione ottimale, preservando l'attività enzimatica e le interazioni fisiologiche delle proteine. La titolazione deve essere eseguita con rapporti compresi tra 2 e 8 g/g²⁶. Risultati ottimali per fegato, muscolo scheletrico e mitocondri cardiaci sono rispettivamente ottenuti con 4, 5, e 6 g di proteina digitonin/g. Va notato che la digitonina può essere sostituita da Triton X-100, che in condizioni ottimali provoca una migrazione simile e una composizione SC come quelle osservate con digitonin². Tuttavia, questo detergente deve essere usato con cautela, poiché relativamente piccolo aumento del rapporto detergente/proteico (ad esempio, da 1 a 1,5 g/g) può comportare una dissociazione completa degli assemblaggi SCs², che può comportare incongruenze sperimentali. Dopo l'estrazione, i campioni sono tradizionalmente completati con Coomassie blu per dare alle proteine una carica quando applicato al gel, fatta eccezione per la tradizionale CN-pagina^20,26. Al fine di minimizzare l'esposizione proteica al blu di Coomassie e la potenziale dissociazione delle proteine labili, i campioni non sono completati con il blu di Coomassie in questo protocollo.

Elettroforesi

Sia CN-PAGE che BN-PAGE sono stati utilizzati per studiare i complessi mitocondriali OXPHOS, ognuno dei quali ha distinti vantaggi e limitazioni. Le condizioni più lievi utilizzate in CN-PAGE (principalmente l'assenza di CB, che ha un effetto detergente simile), consentono una migliore conservazione dell'attività di ATP sintasi in-gel e limitano la dissociazione delle proteine labili in SCs ad alto peso molecolare e nell'ATP sintasi assemblee²⁶. Tuttavia, l'assenza di CB colorante anionico nell'estratto proteico e nei buffer di elettroforesi provoca la migrazione delle proteine in base alla loro carica intrinseca e al punto isoelettrico, che riduce la mobilità elettroforetica delle proteine all'interno del gel²⁶. Inoltre, in assenza di CB, le proteine con insufficiente carica negativa tendono ad aggregarsi, riducendo così la risoluzione dei complessi proteici nel gel^20,26. Per aggirare queste limitazioni, la cosiddetta CN-PAGE ad alta risoluzione è stata sviluppata da Wittig e Schragger²⁰. In questo protocollo, il sodio desossicolato (DOC) e vari detergenti non ionici lievi (DDM, Triton X100) vengono aggiunti al tampone catodico per mantenere le proteine della membrana solubilizzate e imporre un cambio di carica negativo sulle proteine, il che si traduce in un notevole miglioramento della risoluzione²⁰.

Una caratteristica distintiva del presente protocollo ibrido CN/BN è la possibilità di raggiungere una risoluzione comparabile senza questi detergenti. L'aggiunta momentanea di CB al tampone catodo all'inizio dell'elettroforesi è sufficiente per limitare l'aggregazione proteica e migliorare la mobilità nel gel (Figura 3 e Figura 4). Di conseguenza, questa tecnica ibrida consente una risoluzione eccellente di assiemi SC distinti e un'esposizione molto bassa o assente ai detergenti. La presenza di basse quantità di CB consente anche una migliore conservazione dell'attività CV, una migliore conservazione degli assemblaggi di CV dimerica e oligomerici (Figura 3 e Wittig e schägger 2005²⁶), e una riduzione del rumore di fondo blu che può ostacolare la quantificazione delle attività in gel, in particolare per CII e CIV (Figura 2). Inoltre, l'assenza di CB nell'estratto proteico limita l'interruzione delle interazioni di proteina labile all'interno di SCs. Ad esempio, l'associazione fisica dell'ATP sintasi con ANT per formare il sintetasome ³³ o con la ciclofilina-D per regolare l'apertura del PTP ³⁴ è meglio visto in assenza di CB. L'esposizione momentanea a CB durante l'elettroforesi può quindi essere utile per rivelare nuove interazioni proteiche all'interno di SCs. nel complesso, questo protocollo ibrido CN/BN-PAGE consente quindi di combinare misurazioni precise e rapide delle attività in gel con tecniche che coinvolgono l'elettroforesi 2D, l'immuno-Detection e/o la proteomica per l'analisi avanzata delle SCs. Va notato che con il crescente interesse per le SCs, un numero crescente di studi utilizza piccoli gel 10 x 10 cm per la pagina nativa. Sebbene questo approccio possa essere sufficiente per identificare i cambiamenti lordi nell'abbondanza degli assemblaggi SC, la minore capacità di separazione dei piccoli gel è probabilmente limitata a risolvere sottili riarrangiamenti o a tagliare bande distinte per l'analisi proteomica. Inoltre, diversi studi utilizzando gel più piccoli hanno riferito che il respirasoma migra alla stessa dimensione del dimero ATPsynthase, rendendo difficile dissociarli²². Pertanto, l'uso di grandi gel dovrebbe essere favorito.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
3,3'-Diamminobenzidina tetra-cloridrato idrato	Sigma	D5637
Acido 6-ammino-caproico	sigma	A2504
Acrilammide	Sigma	A3553
Adenosina 5'-trifosfato sale disodico idrato	sigma	A3377
Anticorpo anti-ATPB [3D5] - Marker mitocondriale	Abcam	ab14730	Numero di lotto GR3174539-12, RRID AB_301438
Anticorpo anti-SDHA [2E3GC12FB2AE2]	Abcam	ab14715	Numero di lotto GR3235943-1, RRID AB_301433
Anticorpo anti-UQCRC2 [13G12AF12BB11]	Abcam	ab14745	Numero di lotto GR304308-3, RRID AB_2213640
Bis N,N'-Metilene-Bis-Acrilammide	Biorad	1610201
Blu brillante G	Sigma	27815
Anticorpo monoclonale COX4 (1D6E1A8)	Invitrogen	459600	Numero di lotto TI2637158, RRID AB_2532240
Citocromo c da cuore equino	sigma	C7752
Digitonin	Sigma	D141
Fisherbrand FH100M Pompe peristaltiche multicanale	Thermo Fisher	13-310-660
Imidazole	Sigma	I0250
Lastre interne di vetro. Confezione da 2, 20 x 20 cm, piastre di vetro per celle di elettroforesi PROTEAN II xi e PROTEAN II XL da 20 cm, da utilizzare con piastra esterna	Biorad	1651823
modello 485 Gradient Former. Formatore a gradiente di acrilammide da 40-175 ml, include stelo della valvola e kit di tubi, per l'uso con i sistemi di camere di multifusione Mini-PROTEAN	Biorad	1654120
NDUFA9 Anticorpo monoclonale (20C11B11B11)	Invitrogen	459100	Numero di lotto TD2536591, RRID AB_2532223
Nitrotetrazolio Cloruro blu	Sigma	N6639
Lastre di vetro esterne. Confezione da 2, 22,3 x 20 cm, lastre di vetro per celle di elettroforesi PROTEAN II xi e PROTEAN II XL da 20 cm, utilizzare con piastra interna	Biorad	1651824
Phenylmethanesulfonyl floride	Sigma	P7626
Powerpack 1000	Biorad	Numero di serie 286BR 07171
PROTEAN II Morsetti a sandwich. Confezione da 2, morsetti per gel da corsa, per cella di elettroforesi PROTEAN II xi da 20 cm, 1 cella Biorad 1651902
PROTEAN II xi sinistra e 1 destra. Cella di elettroforesi verticale di grande formato, dimensione del gel 16 x 20 cm, capacità di 4 gel, distanziatori e pettini	Biorad	1651811
PROTEAN II xi Comb. Confezione da 1, 15 pozzetti, 1,5 mm, pettine per cella di elettroforesi PROTEAN II xi	Biorad	1651873
PROTEAN II xi Camera di colata multi-gel. Camera di colata multi-gel, formato gel 20 x 20 cm, per un massimo di dieci gel di spessore 1,5 mm, include piastra di tenuta, guarnizione, fogli di separazione, blocchi acrilici, schede di allineamento PROTEAN II XL Biorad		1652025
distanziatori PROTEAN II xi. Confezione da 4, 1,5 mm, distanziatori per cella di elettroforesi PROTEAN II xi da 20 cm	Biorad	1651849
SCIENCEWARE Borse multiuso (10 x 12") 4 mil, Bel-Art, Scatola da 100	VWR	11215-388
Carta spessa per macchie. Confezione da 25 fogli, 15 x 20 cm, carta da filtro assorbente, da utilizzare con cassetta Trans-Blot	Biorad	1703956
cella Trans-Blot con elettrodi a piastra e bobina di super raffreddamento. Cella di trasferimento e serpentina di raffreddamento (#170-3912), include 2 cassette porta gel, serbatoio tampone, coperchio con cavi, cuscinetti in fibra, 1 confezione di carta per macchie	Biorad	1703939