Questa carta presenta un metodo chirurgico per la dissezione della drosofila retine pupale insieme a protocolli per il trattamento del tessuto per esame immuno-istochimico, analisi occidentale ed estrazione di RNA.
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Articolo metodologico
Dissezione della drosofila Pupal Retina per immunoistochimica, analisi occidentale e isolamento del RNA
In questo articolo
Sommario
Abstract
La Drosophila pupal retina fornisce un sistema di modello eccellente per lo studio dei processi morfogenetici durante lo sviluppo. In questa carta, presentiamo un protocollo affidabile per la dissezione della drosofila delicato pupal retina. Il nostro approccio chirurgico utilizza strumenti di microdissection prontamente disponibili per aprire pupe ed estrarre con precisione complessi di occhio-cervello. Possono essere fissi, sottoposto ad esame immuno-istochimico e retine poi montate su vetrini da microscopio e ripreso se l'obiettivo è quello di rilevare strutture cellulari o subcellulari. In alternativa, retine unfixed possono essere isolate dal tessuto di cervello, lisate in buffer appropriato e utilizzate per l'estrazione proteica gel elettroforesi o mRNA (valutare espressione della proteina o del gene, rispettivamente). Pazienza e pratica significativa potrebbe essere necessario padroneggiare il protocollo di microdissection descritto, ma una volta imparato, il protocollo consente relativamente rapido isolamento delle retine principalmente intatta.
Introduzione
La retina di Drosophila è composta da circa 750 ommatidi circondati da cellule del pigmento, disposti in un nido d'ape della grata1,2,3,4. Ogni ommatidium contiene otto neuroni del fotoricettore, quattro lente-secrezione delle cellule cono e due cellule del pigmento primarie. Che circonda ogni ommatidium è cellule produttrici di pigmento di grata e gruppi di setole sensoriali. Grazie alla sua natura post-mitotico e stereotipata disposizione esagonale, retina pupal Drosophila fornisce un sistema di modello eccellente per lo ....
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Protocollo
1. tessuto preparazione
- Messa a punto della drosofila attraversa (come descritto in precedenza20) o cultura ceppi specifici di Drosophila per ottenere pupe del genotipo desiderato. Per garantire che un gran numero di pupe emerga contemporaneamente, stabilire queste culture volare in duplice copia il cibo nutriente media o media di cibo standard generosamente completati con la pasta di lievito.
- Mantenere la drosofila culture a 25 ° C. Per gli incroci che utilizza il sistema di UAS-GAL4, GMR-GAL4 è un driver ideale espresso in cellule di disco larvale occhio posteriore al solco morfogenetico....
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Risultati
L'occhio di pupa è un tessuto facilmente accessibile che serve come un eccellente modello per studiare i processi di sviluppo che morfogenesi in auto. Qui, noi abbiamo dissecato retine e utilizzato l'immunofluorescenza per rilevare le giunzioni dei adherens apicale (Figura 3A, C) o il caspase Dcp-1 (Figura 3D) che si attiva durante l'apoptosi (Figura 3)25. Questi approcci permettono di osserv.......
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Discussione
Il metodo di dissezione di pupal occhio della drosofila qui descritto consente per l'isolamento dei complessi di occhio-cervello di 6 a 10 entro 10-15 min. Tuttavia, pratica e pazienza sono essenziali al fine di padroneggiare la tecnica di dissezione e migliorare la qualità e la velocità delle dissezioni. Questa volta breve dissezione assicura che ogni occhio è circa lo stesso stadio di sviluppo, riducendo la variabilità nell'espressione di gene o fenotipo delle retine in un set di dati. Mentre protocolli altern.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Ringraziamo Zack tamburo e nostri recensori per utili commenti sul manoscritto. Questo lavoro è stato supportato da R15GM114729.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Adobe Photoshop | Adobe | Software di elaborazione immagini | |
| Stecche di bambù, 6" | Ted Pella Inc | 116 | |
| Beta mercaptoetanolo | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| Beta-glicerolo fosfato | Sigma-Aldrich | 50020 | |
| Piatto | Capsula di Petri in vetro riempita fino al bordo con SYLG170 o SYLG184 (colorato in nero con polvere di carbone finemente macinata). Lasciare polimerizzare a temperatura ambiente per 24-48 ore. | ||
| Portalama Fine Science Tools | 10053 | ||
| Albumina sierica bovina | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| compresse cocktail di inibitori della proteasi senza EDTA complete | Roche | 4693132001 | |
| Microscopio confocale (Zeiss LSM 501) | Carl Zeiss | o microscopio simile | |
| Pirocarbonato di dietil (DEPC) | Sigma-Aldrich | 40718 | |
| Nastro biadesivo | 3M | 665 | |
| Drosophila terreni alimentari, ricchi di sostanze nutritive | 7,5% saccarosio, 15% glucosio, 2,5% agar, 20% lievito di birra, 5% peptone, 0,125% MgSO4.7H2O, 0,125% CaCl22H20 | ||
| Drosophila terreni alimentari, ricetta standard | della farina di mais del centro di distribuzione di Bloomington. (https://bdsc.indiana.edu/information/recipes/bloomfood.html) | ||
| Acido etilendiamminotetraacetico | Sigma-Aldrich | E6758 | |
| Soluzione | 4% formadeide in PBS, pH 7,4. | ||
| Microscopio a fluorescenza (microscopio TCS SP5 DM) | Leica Microsystems | o microscopio simile | |
| Pinze | Fine Science Tools | 91150-20 | devono essere affilate frequentemente. |
| Formaldeide | Thermo Scientific | 28908 | |
| Piastre in vetro a 9 pozzetti | Corning | 7220-85 | Conosciuto anche come piastre a 9 pozzetti |
| Vetrini coprioggetti in vetro (22 x 22 mm) | Fisher Scientific | 12-542-B | |
| Vetrini per microscopio in vetro (25 x 75 x 1 mm) | Fisher Scientific | 12-550-413 | |
| Piastra di Petri in vetro | Corning | 3160-100BO | |
| Glicerolo | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Image Studio versione software 5.2.5 | LI-COR Biosciences | Software di elaborazione delle immagini per la quantificazione dei Western blot. | |
| Tampone per campioni Laemmli | Bio-Rad | 161-0737 | 2X tampone per campioni di proteine concentrate, integrare con beta mercaptoetanolo secondo le istruzioni del produttore. |
| Indicatore di corsia che riduce il tampone del campione | ThermoFisher Scientific | 39000 | 5X tampone per campioni di proteine concentrate. |
| Tubi di microcentriguro | Axygen | MCT-175-C | |
| Fine Science Tools | 15000-03 | ||
| Vassoi per micropozzetti (72 x 10 &; L pozzetti) | Nunc | 438733 | |
| Terreno | 0,5% N-propilgallato e 80% glicerolo in PBS | ||
| N-propilgallato | Sigma-Aldrich | P3130 | |
| PBS privo di nucleasi (PBS in 0,1% DEPC, pH 7,4) | Aggiungere un volume appropriato di DEPC al PBS, mescolare bene e incubare per una notte a temperatura ambiente agitando costantemente. Autoclavare per almeno 20 minuti. Negozio a 4 gradi C | ||
| PBS (soluzione salina tamponata con fosfato pH 7,4) | Sigma-Aldrich | P5368 | Preparare secondo le istruzioni del produttore |
| PBS+pi (PBS più inibitori della proteasi e della fosfatasi) | 10mM NaF, 1mM beta-glicerolo fosfato e 1mM Na3VO4 in PBS, pH 7,4. | ||
| PBT | 0,15% TritonX e 0,5% albumina sierica bovina in PBS, pH 7,4 | ||
| Porta spilli | Fine Science Tools | 26016-12 | |
| Anticorpo primario: capra anti-GAPDH | Imgenex | IMG-3073 | Per Western blotting. Utilizzato in 1:3000 |
| Anticorpo primario: coniglio anti-clivaggio Dcp-1 | Segnalazione cellulare | 9578S | Per l'immunofluorescenza. Utilizzato in 1:100 |
| Anticorpo primario: ratto anti-DEcad | Studi sullo sviluppo Banca degli ibridomi | DCAD2 | Per l'immunofluorescenza. Utilizzato a 1:20 |
| Anticorpo primario: ratto anti-DEcad | DOI: 10.1006/dbio.1994.1287 | DCAD1 | Dono di Tadashi Uemura. Usato a 1:100. |
| Kit di estrazione dell'RNA: Relia Prep Kit Miniprep per tessuti di RNA | Promega | Z6110 | |
| Reagente di decontaminazione Rnasi (RNase Away) | Molecular BioProducts | 7002 | |
| Lame per bisturi | Strumenti di scienza | fine 10050 | Rompere un piccolo pezzo di lama di scapel e fissarlo nel supporto della lama. |
| Anticorpo secondario: 488-coniugato asino anti-ratto IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 712-545-153 | Per l'immunofluorescenza. Utilizzato in 1:200 |
| Anticorpo secondario: capra coniugata cy3-conjugata anti-coniglio IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 111-165-144 | Per immunofluorescenza. Utilizzato in scala 1:100 |
| Anticorpo secondario: capra coniugata HRP-coniugata IgG (H+L) | Tecnologia di segnalazione cellulare | 7077 | Per Western blotting. Utilizzato a 1:3000 |
| Anticorpo secondario: IgG (H+L) di coniglio coniugato con HRP anti-capra Jackson | ImmunoResearch | 305-035-003 | Per Western blotting. Utilizzato a 1:3000 |
| Cloruro di sodio | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| Fluoruro di sodio | Sigma-Aldrich | 215309 | |
| Vanadato di sodio | Sigma-Aldrich | 50860 | |
| Spettrofotometro (NanoDrop) | ThermoFisher Scientific | 2000c | |
| Microscopio da dissezione stereo (M60 o M80) | Leica Microsystems | o microscopio simile | |
| Sylgard (nero) | Dow Corning | SYLG170 | |
| Sylgard (trasparente) | Dow Corning | SYLG184 | Colore nero con polvere di carbone finemente macinata |
| Tessuto: Kimwipes | KIMTECH | 34120 | |
| TritonX | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Trizma cloridrato pH7.5 | Sigma-Aldrich | T5941 | |
| Ago di tungsteno, fine | Fine Science Tools | 10130-10 | Inserire nel supporto del perno |
| Ago di tungsteno, robusto | Fine Science Tools | 10130-20 | Inserire nel supporto del perno |
| WTLB (tampone di lisi tissutale occidentale) | 150 mM di NaCl, 1,5% di Triton X-100, 1 mM di EDTA, 20% di glicerolo, 10 mM di NaF, 1 mM di beta-glicerolo fosfato e 1 mM di Na3VO4 in 50mM di Tris-HCl (pH 7,5). Integrare con un tavolo da cocktail di proteasi cOmplete per 10 ml di soluzione. | ||
| Pasta di lievito | supermercato locale) | Circa 2 cucchiai di lievito secco attivo di Fleischmann (o simile) sciolto in ~20 ml di H2O distillato |
Riferimenti
- Cagan, R. L., Ready, D. F. The emergence of order in the Drosophila pupal retina. Developmental biology. 136 (2), 346-362 (1989).
- Wolff, T., Ready, D. The development of Drosophila melanogaster. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Plainview. 1277-1325 (1993).
- Carthew, R. W.
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Ristampe e permessi
