Replatazione post-differenziazione dei neuroni derivati da cellule staminali pluripotenti umane per lo screening ad alto contenuto di neuritogenesi e maturazione delle sinapsi

Summary

Questo protocollo descrive una procedura dettagliata per la resuspending e la coltura di neuroni derivati da cellule staminali umane che in precedenza erano differenziati dai progenitori neurali in vitro per più settimane. La procedura facilita i saggi basati sull'imaging di neuriti, sinapsi e marcatori neuronali che esprimono tardivamente in un formato compatibile con la microscopia leggera e lo screening ad alto contenuto.

Abstract

I neuroni differenziati nella coltura bidimensionale dalle cellule progenitrici staminali derivate da cellule staminali (NPC) umane rappresentano un potente sistema modello per esplorare i meccanismi della malattia ed eseguire lo screening ad alto contenuto (HCS) per interrogare il composto o identificare i fenotipi della mutazione genica. Tuttavia, con le cellule umane la transizione da PNG funzionale a funzionale, neurone maturo richiede diverse settimane. Le sinapsi in genere iniziano a formarsi dopo 3 settimane di differenziazione nella coltura dei monostrato, e diverse proteine neuronali specifiche, ad esempio il successivo marcatore pan-neuronale NeuN, o il marcatore del neurone corticale cerebrale cTIP2, di livello 5/6, iniziano ad esprimere circa 4-5 settimane dopo la differenziazione. Questo lungo tempo di differenziazione può essere incompatibile con le condizioni di coltura ottimali utilizzate per piattaforme HCS di piccole dimensioni e multi-pozzo. Tra le molte sfide vi sono la necessità di cellule ben aderenti e distribuite uniformemente con un clustering cellulare minimo e procedure di coltura che favoriscano la vitalità a lungo termine e la maturazione funzionale delle sinapsi. Un approccio è quello di differenziare i neuroni in un formato di grande volume, quindi rilassarli in un secondo momento in multi-pozzi compatibili con HCS. Alcune delle principali sfide nell'utilizzo di questo approccio di replating riguardano la riproducibilità e la vitalità cellulare, a causa della stressante interruzione della rete dendritica e assonale. Qui dimostriamo una procedura dettagliata e affidabile per riutilizzare ennzimaticamente i neuroni derivati da cellule staminali pluripotenti (hiPSC) indotte dall'uomo dopo la loro differenziazione per 4-8 settimane in un formato di grande volume, trasferendoli a microtiter 384-well piastre, e coltura per un ulteriore 1-3 settimane con eccellente sopravvivenza cellulare. Questa rappresaglia dei neuroni umani non solo consente lo studio dell'assemblaggio e della maturazione delle sinapsi entro due settimane dalla riplaccatura, ma consente anche studi sulla rigenerazione dei neuriti e sulle caratteristiche del cono di crescita. Forniamo esempi di saggi scalabili per neuritogenesi e sinaptogenesi utilizzando una piattaforma a 384 pozzetto.

Introduction

I neuroni derivati da cellule staminali pluripotenti umane (hiPSC) sono sempre più rilevanti nei settori della ricerca di base, dello sviluppo di farmaci e della medicina rigenerativa. I flussi di lavoro e le procedure per ottimizzare la loro cultura e manutenzione, e migliorare l'efficienza della differenziazione in specifici sottotipi neuronali, si stanno evolvendo rapidamente^1,2. Per migliorare l'utilità e l'efficacia in termini di costi dei neuroni derivati dalle cellule staminali umane come sistemi modello suscettibili di analisi ad alto contenuto nella scoperta di farmaci e nella convalida degli obiettivi, è utile ridurre il tempo di coltura necessario per generare maturi e funzionali valori in genere, pur mantenendo la massima robustezza, riproducibilità e pertinenza del fenotipo. Anche se le colture organoidi a 3 dimensioni stanno guidando le innovazioni nella ricerca sul neurosviluppo³, le colture monostrato bidimensionali sono particolarmente compatibili con applicazioni automatizzate basate sull'imaging a causa del loro spessore minimo dei tessuti.

Tuttavia, l'adattamento dei metodi di screening basati sull'imaging ai modelli della malattia neurologica e neurosviluppo umana deve affrontare una grande sfida. Il lasso di tempo prolungato durante il quale il sistema nervoso umano matura in vivo richiede un tempo prolungato nella coltura per accogliere programmi naturali di espressione genica e raggiungere la maturazione neuronale.

Una conseguenza pratica del lungo programma di differenziazione neuronale è che il mantenimento delle colture monostrato derivate da hiPSC deve essere sostenuto per molte settimane per ottenere un'adeguata maturità sinapsi. Durante questo periodo, i progenitori neurali che rimangono indifferenziati continuano a dividersi. Questi possono rapidamente crescere eccessivamente la coltura e usurpare il contenuto nutritivo necessario per mantenere i neuroni postmitotici vitali. Le cellule progenitrici neurali (NPC) che dividono vigorosamente possono anche competere con i neuroni per il substrato di crescita. Questo può rendere tali culture soggette a problemi di scarsa adesione, una condizione inadatta per i saggi basati sull'imaging. Inoltre, molti ricercatori trovano che più piccolo è il volume di coltura, maggiore è la difficoltà nel mantenere popolazioni sane di neuroni differenziati abbastanza a lungo per osservare le ultime fasi della differenziazione neuronale. In altre parole, i saggi di maturazione delle sinapsi utilizzando approcci di screening ad alto contenuto (HCS) possono essere molto impegnativi per i neuroni derivati dall'uomo.

Per aggirare alcuni di questi problemi, è stata utilizzata una procedura di resumfare e repunatura in precedenza differenziati neuroni hiPSC-derivati. In primo luogo, permette lo studio della escrescenza neurite (o, più precisamente, la rigenerazione dei neuriti) in una popolazione di neuroni pienamente impegnati. In secondo luogo, la ripettezza di neuroni precedentemente differenziati da un formato di grande volume (come piastre di 10 cm o più grandi), fino a formati di piccoli volumi (come piastre di microtiteri compatibili con HCS) consente una significativa riduzione del tempo totale di la condizione di piccolo volume. Questo facilita lo studio dell'assemblaggio e della maturazione delle sinapsi nelle settimane successive in vitro.

Tuttavia, la rifacimento di neuroni maturi che hanno già stabilito lunghi neuriti e una complessa rete di connettività presenta diverse sfide, una delle quali è il tasso a volte alto e variabile di morte cellulare. Qui, descriviamo una procedura di repsiamento che si traduce in un'eccellente sopravvivenza cellulare e riproducibilità. Comunemente, i neuroni sono esposti a enzimi proteolitici per brevi periodi di incubazione (tipicamente 3-10 min) al fine di staccare le cellule dal substrato prima della triturazione. Questo breve tempo proteolisi è abitualmente utilizzato per resudare e passare molti tipi di cellule divisorie, tra cui le cellule non-neuronali e progenitori indifferenziati^4,5,6. Tuttavia, per i neuroni differenziati che portano a lungo, neuriti interconnessi, è essenziale non solo per staccare le cellule dal substrato, ma anche per interrompere la rete dendritica e assonale al fine di isolare le singole cellule riducendo al minimo i danni. Infatti, una spessa rete di neuroni di solito tende a staccarsi dal substrato come un singolo foglio, piuttosto che come singole cellule. Se non si fa attenzione ad allentare la fitta rete di neuriti, i neuroni non solo diventano irreversibilmente danneggiati durante la triturazione, ma molti di loro non riescono a passare attraverso il filtro utilizzato per rimuovere i grumi, con conseguente scarsa resa cellulare. Qui di seguito descriviamo una semplice modifica a una procedura di incubazione proteasi ampiamente utilizzata per contrastare queste difficoltà.

Nel protocollo descritto di seguito, i neuroni vengono incubati per 40-45 min con una proteasi lieve, come l'enzima proteolitico (ad esempio, Accutase). Durante i primi 5-10 min dopo l'aggiunta dell'enzima, la rete neuronale si solleva dal substrato come un foglio. L'incubazione con la proteasi procede per altri 30-40 min prima di procedere con triturazione e filtraggio delicati. Questo tempo di incubazione supplementare aiuta a garantire che la digestione del materiale rilassi la rete intercellulare, garantendo così che la successiva triturazione produca una sospensione delle singole cellule. Questa procedura massimizza l'uniformità della distribuzione cellulare durante la replaccatura riducendo al minimo la morte delle cellule. Abbiamo applicato con successo questo metodo di replating alle colture neuronali derivate da hiPSC generate da vari protocolli di differenziazione^7,8 e da varie linee di hiPSC. La procedura è nominalmente adatta per l'uso con la maggior parte o tutte le linee di neuroni derivati dalle cellule staminali. Abbiamo osservato che un tempo prolungato di incubazione della proteasi non è assolutamente essenziale per la riplaccatura delle colture da piastre di piccolo formato (ad esempio, diametro di 35 mm); tuttavia, come si mostra qui, fornisce un vantaggio significativo quando si replata da piastre di grande diametro (ad esempio, 10 cm di diametro o più grandi), probabilmente perché i neuriti in tali piastre possono estendere processi molto lunghi e formare un array densamente interconnesso.

Qui dimostriamo questo metodo e illustriamo brevemente la sua applicazione nei saggi per la neuritogenesi precoce e per la maturazione delle sinapsi, che comporta il raggruppamento di proteine pre e post-sinaptiche lungo i dendriti e gli assoni, seguiti dai loro successivi co-localizzazione nei siti sinaptici. Gli esempi evidenziano i vantaggi offerti da questo protocollo per preservare la vitalità e la riproducibilità delle cellule. In primo luogo, permette ai ricercatori di studiare i primi passi nella neuritogenesi umana. L'ambientazione sperimentale è simile alle colture primarie comunemente utilizzate dei neuroni corticali o ippocampali del roditore, dove le cellule vengono estratte dal cervello tardo fetale o postnatale precoce, dissociate dalla triturazione dopo un delicato trattamento della proteasi, e avviare neuriti o rigenerare neuriti che sono stati recisi nella procedura^9,10. Simile a tali neuroni primari roditori, i neuroni derivati da hiPSC iniziano a formarsi o rigenerare i loro neuriti poche ore dopo la riplaccatura, consentendo l'imaging dei coni di crescita e della morfologia dei neuriti in un ambiente ottimale per l'imaging spatiotemporale elevato con meno che circondano cellule indifferenziate. Abbiamo osservato che l'escrescenza di neurite è più sincronizzata rispetto ai ritardi variabili e ai diversi tassi di escrescenza osservati quando i neuroni iniziano a differenziarsi da una popolazione progenitrice. Inoltre, la riatcrolatura consente alle analisi dei neuroni che esprimono marcatori di sottotipi neuronali che in genere appaiono più tardi nello sviluppo neurale, come il fattore di trascrizione 5/6 dello strato corticale CTIP2 (Trascrizione promotrice promotrice a monte dell'ovalbumina proteina che interagisce con il fattore 2), o il marcatore pan-neuronale NeuN¹¹. Una caratteristica particolarmente utile dell'approccio replating è che la sinaptogenesi procede entro un lasso di tempo compatibile con HCS.

Protocol

1. Periodo di differenziazione prima della riplaccatura

1. Differenziare i neuroni su piatti da 10 cm, utilizzando un protocollo di scelta^7,8 fino a quando i neuroni hanno formato una rete spessa con i loro processi ed esprimere non solo i primi marcatori neuronali come MAP2 o TuJ1, ma anche marcatori tardivi come NeuN.
2. Cambiare la metà del mezzo di scelta ogni 4 giorni durante il processo di differenziazione neuronale.
   NOTA: Cambiamenti medi più estesi o frequenti diluiscono fattori trofici essenziali e potrebbero sfavorire la maturazione.
   1. Per i neuroni WT126 derivati da iPSC, utilizzare i seguenti supporti di coltura post-differenziazione: 5 mL 100x supplemento N2, 10 ng/mL BDNF, 10 ng/mL GDNF, 1 lamina di g/mL, 200m acido ascorbico, 1 dibutyryl-cAMP e 10 mL SM1 per il mezzo aquila modificato di 500 mL miscela nutritiva F-12 (DMEM/F12). A poco a poco, utilizzando le modifiche semi-media, sostituire con mezzo basale neurale (Tabella dei materiali) e gli stessi integratori.
   2. Per i neuroni CVB WT di iPSC, utilizzare il seguente supporto di coltura post-differenziazione: 500 mL neural basal basal a media (Tabella dei materiali) e mezzo DMEM/F12 da 500 mL con 2 g/mL di lamina, supplemento di glutammina da 10 mL ( Tabella deimateriali), 0,75 mg/mL di bicarbonato di sodio, 5 mL minimo medio essenziale (MEM) aminoacidi non essenziali, 0,2 mM di acido ascorbico, 10 ng/mL BDNF, 20 mL 50x B27 e 10 mL 100x Supplemento N2.

2. Rivestimento Multiwells

1. Il giorno prima della sradicamento, ricoprire con poli-L-ornitina (PLO). Sciogliere l'OLP in acqua sterile per creare una soluzione di riserva (10 mg/mL). Conservare questo stock a -20 gradi centigradi. Diluire LLO 1:100 in acqua per produrre una concentrazione di 50 g/mL durante il rivestimento del vetro e 1:1.000 rapporto (10 g/mL) durante il rivestimento di plastica.
2. Applicare il rivestimento direttamente alle piastre di destinazione. Utilizzare il volume di rivestimento appropriato per la dimensione della piastra (cioè, per una piastra di 24 pozzetti applicare 500 -L di soluzione PLO per bene).
3. Lasciare che le piastre si siedano al buio durante la notte a temperatura ambiente.
4. Recuperare le piastre rivestite il giorno della replizione e il trasferimento in un armadio sterile di biosicurezza.
5. Aspirare la soluzione OLP e risciacquare due volte con acqua sterile.
6. Lamininina diluita (1,15 mg/mL) in salina tampone fosfata (PBS) a 1:400 diluizione.
   NOT: Scongelare la lamino a 4 gradi centigradi e aggiungerla rapidamente alla PBS per evitare l'aggregazione di laminina e rivestimento irregolare.
7. Aspirare acqua sterile e applicare 500 l di rivestimento di laminina a pozzi precedentemente rivestiti con OLP.
8. Posizionare le piastre in un'incubatrice di 37 gradi centigradi per un minimo di 4-6 h. Utilizzare incubazioni più lunghe, fino a 16 h, per superfici di vetro. Utilizzare tempi di incubazione coerenti.

3. Repsiare i neuroni differenziati

1. Sciacquare la piastra di neuroni differenziati con PBS una volta delicatamente. Disperdere la PBS delicatamente lungo la parete della piastra, e non direttamente sulle cellule, per evitare di interromperle.
2. Aspirare delicatamente PBS, facendo attenzione a non toccare direttamente le cellule, ma ad aspirare dal bordo del piatto mentre si ribalta verso il ricercatore.
3. Applicare almeno 1 mL dell'enzima proteolitico (Tabella dei materiali) per piastra da 10 cm e riportare le cellule all'incubatrice. Aggiungere volumi leggermente più elevati se la sala di coltura dei tessuti presenta un alto tasso di evaporazione a causa della bassa umidità.
4. Incubare cellule con enzima proteolitico per 40-45 min al fine di staccarle dalla piastra e staccarle da altri neuroni all'interno della rete neuronale.
   NOT: La tempistica in questo passaggio è fondamentale. L'incitamento troppo precoce alla proteasi può portare ad un aumento della morte cellulare dopo la riplaccatura. Il produttore di enzimi proteolitici raccomanda di utilizzare temperature molto più basse di 37 gradi centigradi con periodi di incubazione più lunghi per passare le linee cellulari (ad esempio, durante la notte a 4 gradi centigradi). Tuttavia, la manipolazione dei neuroni a 4 gradi centigradi dovrebbe essere evitata, in quanto spesso mostrano una scarsa sopravvivenza dopo l'esposizione al freddo. Il produttore afferma anche che un'incubazione di 60 min con l'enzima a 37 gradi centigradi porta alla sua inattivazione enzimatica. Tuttavia, nell'esperienza degli autori, un'incubazione di 40-45 min di colture neuronali derivate da hiPSC a 37 gradi centigradi è sufficiente per una dissociazione efficiente e un'eccellente sopravvivenza neuronale dopo la repsiatura.
5. Controllare i neuroni su un microscopio a contrasto di fase durante il periodo di incubazione e consentire il proteasi trattamento di continuare fino a quando la rete neurale si stacca completamente dalla piastra e inizia a rompersi in fogli più piccoli agitando brevemente la piastra sotto la microscopio.
6. Quench l'attività proteasi utilizzando 5 mL di supporti DMEM freschi per 1 mL di proteasi nella piastra di 10 cm per fermare la digestione. Triturare delicatamente le cellule contro la piastra 5-8 volte per interrompere la rete, utilizzando pipette sierologiche. Fare attenzione a non applicare troppa pressione durante la tritura, come neuroni differenziati sono fragili. Non utilizzare una punta P1000, come la fine è troppo tagliente e stretta, e quindi può pura o danneggiare i neuroni.
7. Applicare la soluzione con le cellule attraverso un colino cellulare con una maglia di 100 m di diametro in una fresca tubetta conica da 50 ml goccia a goccia.
8. Risciacquare il colino con altri 5 mL di supporti DMEM freschi, dopo che le cellule hanno filtrato attraverso.
9. Ruotare le cellule nella centrifuga della panca a 1.000 x g per 5 min.
10. Restituire il tubo conico all'armadio della biosicurezza e aspirare la maggior parte dei supporti, lasciando circa 250 s L per garantire che le cellule trattengano l'umidità.
11. Risospendere delicatamente le cellule in 2 mL di supporti DMEM freschi. Non pipette il pellet contro il lato del tubo. Invece, ritornare delicatamente conical 2-3 volte e passare le cellule attraverso la fine di un pipet sierologico 5 mL per spostarli.
12. Applicare 10 - L di neuroni risospesi sul bordo di un emocitometro.
13. Aggiungere 8-10 l di trypan blu a gocciolina di cellule per valutare la vitalità cellulare durante questa fase di sospensione. Applicare 10 l di questa miscela all'emocitometro o ad altri contatori cellulari automatici. Valutare come vitali quelle cellule che sono fase luminosa ed escludere il colorante blu trypan.
14. Determinare la quantità di cellule/mL vitali e prepararsi a diluire il contenuto del tubo conico in base alla densità di cellule desiderata.
15. Piastra 10.000 cellule per pozzo per una piastra di 384 pozzetti; piatto 150.000-200.000 cellule per pozzo per una piastra di 24 pozzetti.
16. Aggiungere dMEM fresco al tubo conico delle celle risospese per ottenere una diluizione appropriata e aggiungere ulteriori supplementi appropriati come B27 e/o BDNF, a seconda dei requisiti della linea cellulare specifica.
17. Piegare delicatamente il tubo conico per mescolare 2-3 volte.
18. Rivestimento di lamina aspirata dalla piastra 24-well, o dalla piastra multiwell 384-well utilizzando un pipet a 16 canali e risciacquare una volta con PBS.
19. Aspirate PBS utilizzando un P1000 per la piastra a 24 pozzetti, o la pipetta a 16 canali per piastre 384 pozze.
20. Applicare la soluzione cellulare a ogni pozzo in un movimento figura otto per evitare di agglomerarsi. L'uniformità della placcatura potrebbe anche essere ottimizzata utilizzando dispositivi di movimentazione automatica dei liquidi.
    NOT: L'aggiunta di laminina ai media a partire da 2-4 giorni dopo la repporazione aiuta anche a mantenere una distribuzione omogenea delle cellule.
21. Ripetere i passaggi 3.19 e 3.20 per ogni pozzetto.
22. Riportare la piastra all'incubatrice impostata a 37 gradi centigradi e al 5% di CO₂.
23. Dopo 2 giorni, iniziare a cambiare metà del mezzo ogni 4 giorni utilizzando i supporti di coltura post-differenziazione descritti nella sezione 1.2. Dopo il tempo di maturazione desiderato, correggere le colture utilizzando 3,7% formaldeide a 37 gradi centigradi e macchiare le cellule secondo i requisiti sperimentali.

4. Cell Viability Afferma post-replating

1. Aggiungete il reporter della morte per cella prima (VivaFix: 0,5 l dell'unità di stock 50 per ogni pozzo di 500 supporti di coltura luna) dopo aver brevemente vortice la soluzione di stock.
2. Immagina le cellule vive e morte coltivate su multiwell con fondo di vetro, dopo 20 min, senza alcuna fase di lavaggio, poiché il colorante fluoresce solo una volta all'interno delle cellule, o fissa e co-macchia con 4',6-diamidino-2-fenilitine (DAPI) e/o altri anticorpi prima dell'imaging utilizzando un microscopio confocale.

5. Immunostaining

1. Correggere le colture con 3,7% di formaldeide in PBS più 120 mM di saccarosio per 20 min a 37 gradi centigradi.
2. Risciacquare e permeabilizzare con 0,2% Triton X-100 per 5 min a temperatura ambiente, quindi bloccare per 30 min con 2% di albumina di siero bovino (BSA).
3. Aspirare la BSA senza risciacquo e incubare per 1 h a temperatura ambiente con anticorpo coniglio anti-MAP2 1:1,000, topo anti-tubulina (TuJ1) anticorpo 1:2,000, pollo anti-NeuN anti-1:100 e anti-CTIP2 ratto (1:500), o con topo anti-PSD95 ( 1:200), coniglio anti-sinappsina 1 (1:200) e pollo anti-MAP2 anticorpo per la colorazione sinaptica.
4. Risciacquare con PBS e incubare con anticorpi secondari coniugati da Alexa Fluor più DAPI per 45 minuti a 37 gradi centigradi.
5. Infine, lavare due volte con PBS prima dell'imaging.

6. Immagini di calcio

1. Infetta le cellule coltivate con AAV8-syn-jGCAMP7f-WPRE (The Salk Institute for Biological Studies, GT3 Core Facility) a 10 giorni dopo la soppiattia e l'immagine per valutare i transitori spontanei di calcio a 3-4 settimane dopo la replastica.

7. Acquisizione e analisi delle immagini

NOT: Per i dettagli sul sistema di acquisizione si prega di fare riferimento a Calabrese et^al.

1. Utilizzare un modulo di imaging per l'acquisizione manuale o automatica di immagini e un modulo software di analisi delle immagini, ad esempio CellProfiler¹³, per le misurazioni morfometriche.
2. Calcolare la lunghezza media dei neuriti positivi TuJ1 e dei dendriti positivi MAP2 misurando la lunghezza totale per campo visivo diviso per il numero di neuroni (cellule positive DAPI - MAP2 o TuJ1) all'interno dello stesso campo.

Results

La rifacimento di hiPSCs-derivati neuroni che sono stati differenziati per più settimane offre diversi vantaggi. Tuttavia, lo scollegamento e la riclassificazione di neuroni differenziati che hanno dendriti e assoni lunghi e interconnessi (Figura 1A) possono comportare un'elevata frazione di neuroni danneggiati in modo irreversibile.

Come descritto nella sezione del protocollo, abbiamo usato l'incubazione con un enzima proteolitico per staccare i ...

Discussion

Abbiamo dimostrato una procedura semplice per la sospensione e la ritorsione delle colture neuronali umane che ottimizza la vitalità, il successo della differenziazione e l'imaging subcellulare in modo compatibile con piattaforme di screening ad alto contenuto, e altri saggi rilevanti per la scoperta di farmaci. Nella Figura 6 vengono illustrati il flusso di lavoro complessivo e gli esempi di tali applicazioni.

Anche se qui ci siamo concentrati sui neuroni derivat...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Terreni di replating post
Acido L-Ascorbico	Sigma	A4403	Aggiungere 1 mL di 200 mM di stock a 1 L di terreno N2B27
Dibutirril-cAMP	Sigma	D0627	Aggiungere 1 µ M
Human BDNF	Peprotech	450-02	10 ng/ml concentrazione finale
B27 (50x)	Thermofisher Scientific	17504044	Aggiungere 20 mL a 1 L di terreno N2B27
DMEM/F12 con Glutamax	Thermofisher Scientific 31331093		Aggiungere N2 e distribuire in 50 mL di coniche; coperchi per involucro
parafilm Human GDNF	Peprotech	450-10	10 ng/mL concentrazione finale
Glutamax	Thermofisher Scientific	35050038	Aggiungere 10 ml a 1 L di terreno N2B27; integratore di glutammina
Mouse Laminin	Sigma	P3655-10mg	Aggiungere 100 µ L a 50 mL di
MEM Aminoacidi non essenziali	Thermofisher Scientific	11140035	Aggiungere 5 mL a 1 L di terreno N2B27
N2 (100x) Supplemento	Life Technologies	17502048	Aggiungere 5 mL a 500 mL di terreno
Terreni Neurobasali A	Thermofisher Scientific	10888022	Combinare con DMEM/F12 per generare terreni N2B27 per cellule wt CVB; terreni A basali neurali
Terreni	NeurobasaliThermofisher Scientific	21103049	per cellule WT126; terreno basale neurale
Integratore SM1 StemCell	Technologies	5711	Aggiungere 1:50 al terreno
Bicarbonato di sodio	Thermofisher Scientific	25080-094	Aggiungere 10 mL a 1 L N2B27 media
Preparazione della piastra
10 cm Piastre per colture tissutali	Fisher Scientific	08772-E	Piastre in plastica trattate con TC
Piastre per colture tissutali a 6 pozzetti	Thomas Scientific	1194Y80	Piastre NEST
Mouse Laminin	Life Technologies	23017-015	Aggiungere 1:400 su plastica
Poli-Ornitina	Sigma	P3655-10mg	Aggiungere 1:1.000 su plastica
UltraPure Distilled Water	Life Technologies	10977-015	Per diluire Reagenti di placcatura <> poli-L-ornitina
100 mM Filtro cellulare	Corning	431752	Sterile, confezionato singolarmente
Piastra a 384 pozzetti, non rivestita	PerkinElmer	6007550	Coat con PLO e Laminina
DPBS	Life Technologies	14190144	soluzione
salina tamponata con fosfato di DulbeccoPiastre a 384 pozzetti prerivestite in poli-D-lisina	PerkinElmer	6057500	Risciacquo prima del rivestimento con lamina
StemPro Accutase	Life Technologies	A1110501	Applicare una piastra da 1 mL/10 cm per 30-45 minuti; enzima proteolitico
Materiali di fissaggio
37% Formaldeide	Fisher Scientific	F79-1	disciolto in PBS
Saccarosio	Fisher Scientific	S5-12	0,8 g per 10 mL di fissativo
Materiali immunocoloranti
Alexa Fluor 488 Anti-topo	di capra Invitrogen	A-11001	anticorpo secondario
Alexa Fluor 568 Anti-pollo di capra	Invitrogen	A-11041	anticorpo secondario
Alexa Fluor 647 Anti-pollo	di capraInvitrogen	A-21449	anticorpo secondario
Alexa Fluor 561 capra anti-ratto	Invitrogen	A-11077	anticorpo
secondario DAPI	Biotium	40043	visualizza il DNA
Anticorpo di topo contro la b3-tubulina (TuJ-1)	Neuromics	MO15013	marcatore neuronale in stadio iniziale Anticorpo
di ratto contro CTIP2	Abcam	ab18465	strato 5/6 corticale neuroni
Anticorpo di pollo contro MAP2	LifeSpan Biosciences	LS-B290	marcatore neuronale in stadio iniziale
Anticorpo di pollo contro NeuN	Millipore	ABN91	marcatore neuronale in stadio avanzato
Anticorpo di coniglio contro MAP2	Shelley Halpain	N/A	marcatore neuronale in stadio iniziale
Anticorpo di topo contro PSD-95	Sigma	P-246	marcatore post-sinaptico
Anticorpo di coniglio contro la sinapsina 1	Millipore	AB1543	marcatore presinaptico
Albumina sierica bovina (BSA)	GE Healthcare Life Sciences	SH30574,02	10% in PBS per il blocco
di Titon X-100	Sigma	9002931	Diluire allo 0,2% su PBS per permeabilizzazione
Viability Markers
Vivafix 649/660	Biorad	135-1118	marcatore di morte cellulare
Imaging del calcio
Nome del reagente/ Apparecchiatura	Azienda	Numero di catalogo	Commenti/Descrizione
AAV8-syn-jGCAMP7f-WPRE	THE SALK INSTITUTE, GT3 Core Facility	N/A	Calcium Reporter in a viral delivery system
hiPSC-derived NPCs
WT 126 (Y2610)	Gage lab	N/A	Marchetto et al., 2010
CVB WT24	Yeo and Goldstein labs	N/A	non pubblicato