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Articolo metodologico

Elaborazione di protocollo per l'analisi della diffusione e dimensione dei Cluster di recettori di membrana mediante microscopia a fluorescenza

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DOI:

10.3791/59314

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9 aprile 2019

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1Department of Macromolecular Structures, Centro Nacional de Biotecnología, Campus Univ. Autónoma de Madrid, 2Campus Urb. Montepríncipe s/n, Univ. San Pablo CEU, 3Department of Immunology and Oncology, Centro Nacional de Biotecnología, Campus Univ. Autónoma de Madrid, 4Department of Cell Signaling, Centro Andaluz de Biología Molecular y Medicina Regenerativa (CSIC), 5Meyer Cancer Center, 6Department of Anatomy and Cell Biology, McGill Univ.

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Qui, presentiamo un protocollo per singola particella monitoraggio analisi delle immagini che permette la valutazione quantitativa dei coefficenti di diffusione, tipi di movimento e cluster di dimensioni delle singole particelle rilevate mediante microscopia a fluorescenza.

Abstract

Monitoraggio su una sequenza video e l'analisi posteriore dei loro traiettorie delle particelle al giorno d'oggi sono un'operazione comune a molti studi biologici. Utilizzando l'analisi del ricevitore della membrana cellulare cluster come un modello, vi presentiamo un protocollo dettagliato per questa attività di analisi di immagine utilizzando Fiji (ImageJ) e routine di Matlab per: 1) definire le aree di interesse e progettare maschere adattate a queste regioni; 2) traccia le particelle in video microscopia di fluorescenza; 3) analizzare le caratteristiche di diffusione e l'intensità dei brani selezionati. I tipi di movimento e la dimensione dei cluster, analisi quantitativa dei coefficienti di diffusione ottenuta mediante microscopia a fluorescenza ed elaborazione di immagini fornisce un valido strumento per determinare oggettivamente particelle dinamiche e le conseguenze della modifica condizioni ambientali. In questo articolo presentiamo protocolli dettagliati per l'analisi di queste caratteristiche. Il metodo descritto qui non solo permette la rilevazione di rilevamento di singola molecola, ma consente anche di automatizzare la stima dei parametri di diffusione laterale alla membrana delle cellule, classifica il tipo di traiettoria e consente analisi completa superando così il Difficoltà a quantificare la dimensione dello spot sulla sua intera traiettoria alla membrana delle cellule.

Introduzione

Proteine di membrana incorporati nel bilayer del lipido sono in continuo movimento a causa di diffusione termica. Le dinamiche sono essenziali per regolare le risposte cellulari, come interazioni intermolecolari permettono la formazione di complessi che variano nel formato da monomeri di oligomeri e influenzare la stabilità di complessi di segnalazione. Chiarire i meccanismi che controllano la dinamica della proteina è dunque una nuova sfida in biologia cellulare, necessaria per comprendere le vie di trasduzione del segnale e per identificare le funzioni delle cellule imprevisti.

Alcuni metodi ottici sono stati sviluppati per lo studio di queste interazioni in vivo le cellule1. Tra questi, microscopia a fluorescenza (TIRF) riflessione interna totale, sviluppata nei primi anni 1980, permette lo studio delle interazioni molecolari o molto vicino alla membrana cellulare2. Per studiare i parametri dinamici di traiettorie di proteine di membrana ottenuti dai dati di TIRF in cellule viventi, una singola particella inseguimento del metodo (SPT) è richiesta. Anche se diversi algoritmi sono disponibili per questo, utilizziamo attualmente quelli pubblicati da Jaqaman et al.3 che indirizzo eterogeneità di movimento delle particelle in un campo di particelle dense collegando particelle tra fotogrammi consecutivi per collegare la traccia risultante segmenti in traiettorie complete (scomparsa temporanea delle particelle). Il software acquisisce la particella Unione e divisione di quel risultato da aggregazione e dissociazione eventi3. Uno dei dati di output di questo software è rilevamento delle particelle lungo l'intera traiettoria definendo le posizioni X e Y in ogni fotogramma.

Una volta che le particelle vengono rilevate, applichiamo diversi algoritmi per determinare l'intervallo breve diffusione coefficiente (D1-4)4,5. Applicando l'analisi di8 7,6,momento Scaling spettro (MSS) o inserendo il valore di 'alpha' di regolazione della cilindrata di Mean Square (MSD) alla curva9, classifichiamo anche le particelle secondo il tipo di traiettoria.

Analisi di spot intensità nelle immagini di fluorescenza sono un obiettivo condiviso per gli scienziati nel campo10,11. L'algoritmo più comune utilizzato è il cosiddetto numero e luminosità. Questo metodo tuttavia non consente rilevamento corretto frame-by-frame intensità in particelle nella frazione del mobile. Abbiamo, quindi, generato un nuovo algoritmo per valutare queste particelle intensità frame-by-frame e per determinare il loro stato di aggregazione. Una volta le coordinate di ogni particella vengono rilevate utilizzando U-Track2 software3, definiamo la sua intensità in ogni fotogramma sopra la traiettoria completa, tenendo conto anche lo sfondo della cella in ogni fotogramma. Questo software offre diverse possibilità per determinare l'intensità di spot e lo sfondo della cella e, utilizzando proteine note monomeriche e dimeriche come riferimenti, calcola il numero approssimativo delle proteine della particella rilevato (dimensione del cluster).

In questo articolo, descriviamo una guida attenta per eseguire questi tre passi: 1) rilevazione e monitoraggio delle singole particelle lungo un video di microscopia di fluorescenza usando U-traccia; 2) analizzare il coefficente di diffusione istantanea (D1-4) di quelle particelle e al tipo di movimento (confinato, gratuito o diretto) di particelle con lunghe traiettorie di MSS; 3) misurando l'intensità posto lungo il video rettificato da fluorescenza di fondo stimato per ogni spot. Questo consente di stima delle dimensioni cluster e identificazione dei passaggi photobleaching.

L'utilizzo di questo protocollo non richiede competenze specialistiche e può essere eseguita in qualsiasi laboratorio con coltura cellulare, strutture di microscopia e citometria di flusso. Il protocollo utilizza ImageJ o Fiji (una distribuzione di ImageJ12), U-traccia3e alcune routine di hoc fatta di annuncio (http://i2pc.es/coss/Programs/protocolScripts.zip). U-traccia e ad hoc routine eseguite su Matlab che può essere installato in qualsiasi computer compatibile.

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Protocollo

1. preparazione dei campioni biologici

  1. Crescere le cellule Jurkat in RPMI 1640 supplementato con 10% FCS, NaPyr e L-Glutammina (RPMI completo). Cellule di Electroporate Jurkat (20 x 106 cellule/400 µ l di RPMI 1640 con 10% FCS) con un vettore di ricevitore di chemokine GFP-etichettata monomerico (CXCR4-AcGFP, 20 μg) per consentire il rilevamento utilizzando la microscopia a fluorescenza.
    Nota: È possibile utilizzare altre proteine fluorescenti monomerici come mCherry, mScarlet, ecc.
  2. 24 ore dopo la trasfezione di analizzare le cellule in un citometro a flusso per determinare sia la vitalità cellulare e l'espressione di CXCR4-AcGFP.
  3. Selezionare le cellule che esprimono bassi livelli di CXCR4-AcGFP di ordinamento delle cellule delle cellule positivebasso di GFP (Figura 1), come bassa espressione del recettore trasfettato è richiesto in TIRFM esperimenti al fine di garantire il rilevamento di singola particella per l'analisi individuale traiettorie9.
  4. Quantificare il numero di recettori sulla superficie cellulare.
    Nota: Come un esempio13, recettori AcGFP-labeled ~ 8.500-22.000/cella, corrispondono a ~ 2-4.5 particelle/μm2.
  5. Risospendere le cellule ordinate in RPMI completo e incubare per almeno 2 ore a 37 ° C, 5% CO2. Centrifugare le cellule (300 x g, 5 min) e li risospesi in tampone TIRF (HBSS, 25mm HEPES, 2% FCS, pH 7,3).
    1. Piastra su piatti di pozzetti con fondo di vetro 35 mm (2-3 x 105 cellule/piatto) ricoperta di fibronectina (20 μg/mL, 1 h, 37 ° C) in presenza o in assenza del ligando appropriato (cioè, CXCL12, 100 nM, 1 h, 37 ° C). Incubare le cellule (20 min a 37 ° C, 5% CO2) prima dell'acquisizione dell'immagine.
  6. Eseguire esperimenti utilizzando un microscopio TIRF, equipaggiato con una telecamera di EM-CCD, un obiettivo a immersione in olio di 100x (HCX PL APO 100 x / 1,46 NA) e un diodo laser di 488 nm. Il microscopio permette il controllo della temperatura e l'incubazione con CO2. Individuare e mettere a fuoco le cellule con le manopole di messa a fuoco macro e micrometrica, utilizzando il campo luminoso per minimizzare gli effetti photobleaching. Per la regolazione di messa a fuoco in modalità TIRF usare laser a bassa intensità, insufficiente per il rilevamento di singola particella o di indurre effetti photobleaching (potere del laser di 5%, 28 μW).
  7. Acquisire filmati (sequenze di immagini) di circa 50 s riducendo al minimo l'intervallo di tempo tra i fotogrammi. Penetrazione del campo evanescente dovrebbe essere 70-90 nm di profondità. Salvare i filmati acquisiti per ogni condizione sperimentale come ".lif" (video.lif).
    Nota: Film nell'esempio descritto sono state acquisite al 49% alla potenza del laser (2 mW) con un tempo di esposizione di 90 ms e un intervallo di tempo di 98 ms, per 49 s (500 fotogrammi). Penetrazione dell'onda evanescente selezionato era 90 nm.

2. selezione di immagini e creazione di maschere

  1. Per ogni condizione sperimentale (video.lif), creare una nuova cartella (VideoName) che deve contenere diverse cartelle per ogni serie. Ogni cartella conterrà una cartella "videoSeq" per le immagini video e una cartella "risultati" per i risultati dell'analisi. Assicurarsi che la struttura di file in questo momento è il seguente:
    VideoName/video.lif
    VideoName/Series1/videoSeq
    VideoName/Series1/risultati
    Nota: Dal microscopio .lif diversi file sono ottenuti con diversi video per ogni condizione di trattamento (cioè FN, FN + SDF). "video.lif" corrisponde al file video input.lif, con tutte le acquisizioni di film TIRF (serie), eseguito al microscopio. "videoSeq" cartella conterrà i 500 fotogrammi del film che stiamo analizzando. La cartella "risultati" conterrà tutti i file risultanti dall'analisi effettuata. Nomenclatura precisa e localizzazione delle cartelle differenti sono essenziali per il corretto funzionamento degli algoritmi. I nomi in grassetto nell'elenco precedente sono fissi (cioè, devono essere chiamati in questo modo, perché questi sono i nomi ricercati dagli script). I nomi non in grassetto possono cambiare per riflettere l'esperimento eseguito.
  2. Apri il video TIRFM (file .lif) con Fiji o ImageJ trascinando e rilasciando il file sulla barra dei menu Fiji e fare clic su OK per importare il file lif utilizzando BioFormats (complementare figura 1).
  3. Selezionare la serie di elaborare e fare clic su OK (Supplemental Figura 2A). Per progettare una maschera per l'analisi di questo video, anche importare un'immagine multicanale con diversi cromofori (nell'esempio, la serie 1 è l'immagine multicanale e 2 serie il video corrispondente). Il video (e l'immagine multicanale) dovrebbe aprire come una pila di ImageJ. Nell'esempio (Supplemental figura 2B), l'immagine è a sinistra e il video è sulla destra.
    Nota: Se non è richiesta la creazione di una maschera per il video, andare al punto 2.5.
  4. Creare una maschera. Creare una singola immagine con i canali utili per la progettazione della maschera. In questo caso, i canali interessanti sono quelli rosso, verde e grigio.
    1. Dividere i canali dall'immagine multicanale (complementare figura 3A): selezionare l'immagine nella barra dei menu e fare clic colore | Dividere canali. I diversi canali mostrerà come immagini separate (complementare figura 3B).
    2. Unire nuovamente i tre canali in un'unica immagine (Supplemental figura 4A): selezionare l'immagine nella barra dei menu e selezionare colore | Unire i canali. Selezionare i canali appropriati e premere OK (Supplemental figura 4B). Una nuova immagine non in pila sarà generato (Supplemental figura 4).
    3. Sincronizzare le due finestre utilizzando lo strumento di Sincronizzazione Windows (Supplemental Figura 5A): selezionare Analyze nella barra dei menu di | Strumenti | Sincronizzare Windows. Una nuova finestra con la possibilità di sincronizzare immagine apparirà (Supplemental figura 5B).
    4. Con le due finestre sincronizzate (solo il video se non c'è nessuna immagine multicanale associata), la stessa regione in entrambe le finestre possa essere ritagliata. Disegnare l'area di interesse con lo strumento selezione rettangolare di ImageJ menu fluttuante. Selezionare l'immagine nella barra dei menu e selezionare Ritaglia (Supplemental Figura 6A). Le immagini ritagliate due mostrerà individualmente (Supplemental Figura 6B).
    5. Unsynchronize entrambe le finestre (Supplemental Figura 6B) premendo il tasto Unsynchronize tutti in gestione Sincronizzazione di Windows .
  5. Se una maschera non è stata creata come descritto al punto 2.4, disegnare l'area di interesse con lo strumento selezione rettangolare di ImageJ menu fluttuante.
  6. Salvare il video come una sequenza di immagini nella directory videoSeq sotto la directory di video corrispondente (Supplemental figura 7A): selezionare File nella barra dei menu e fare clic Salva | Sequenza di immagini... rinominare le etichette per la sequenza dei video come video0000.tif, video0001.tif,..., video0499.tif (Supplemental figura 7B): nella casella nome , rinominare come video e fare clic su OK. La sequenza deve essere da solo nella relativa directory per essere utilizzato con successo da U-traccia.
    Nota: Se non la progettazione di una maschera per il video, andare al punto 2.8.
  7. Progettazione di una maschera. Selezionare l'immagine multicanale e aprire il Editor di segmentazione plugin (Supplemental figura 8A): selezionare Plugins nella barra dei menu e selezionare segmentazione | Editor di segmentazione. Aggiungere e rinominare le etichette della segmentazione come necessario facendo clic con il pulsante destro del mouse sulle etichette di editor di segmentazione (Supplemental Figura 8B, C).
    1. Scegliete lo strumento selezione appropriata nel menu mobile ImageJ (qui, utilizzare a mano libera), selezionare un'etichetta (verde) e progettare prima la maschera più esterna (Supplemental figura 9A). Una volta progettato, premere il pulsante + in opzione di selezione della finestra composita e la maschera selezionata verrà visualizzato nel Visualizzatore (Supplemental figura 9A). Ripetere questo passaggio con successiva etichette (interno, in rosso) (Supplemental figura 9B).
      Nota: Dopo aver progettato la maschera per le etichette verdi e interni, la maschera esterna occuperà il resto dell'immagine.
    2. Maschere sono codificate nell'immagine come regioni 0, 1, 2,... secondo l'ordine delle etichette nella finestra etichette RGB. Quando tutte le maschere per le diverse etichette sono progettate, salvare la maschera con lo stesso nome di file come video, con il nome mask.tif (Supplemental figura 9): selezionare File nella barra dei menu e selezionare Salva | TIFF....
      Nota: Le maschere selezionate saranno impiegate nel calcolo dei coefficienti di diffusione e classificazione delle traiettorie (Vedi punto 4.2).
  8. Verifica che la struttura di file in questo momento è il seguente:
    VideoName/video.lif
    VideoName/Series1/mask.tif
    VideoName/Series1/ videoSeq / video0000.tif
    VideoName/Series1/ videoSeq / video0001.tif
    ...
    VideoName/Series1/ videoSeq / video0499.tif
    VideoName/Series1/risultati
    Nota: La mask.tif è un'immagine con la maschera come progettato in passaggi 2.4 e 2.7. Il video*.tiff è il video come salvato in passaggio 2.6. Come sopra, i nomi in grassetto nell'elenco sopra riportato sono fisse, cioè, che devono essere chiamati in questo modo, perché questi sono i nomi ricercati dagli script. I nomi non in grassetto possono cambiare per riflettere l'esperimento eseguito.

3. monitoraggio delle particelle

  1. Tenere traccia di tutte le particelle vista nei video selezionati tramite U-track.
  2. Aprire Matlab e aggiungere directory U-traccia il percorso utilizzando il Set Path | Aggiungi con sottocartelle opzione nel menu. Salvare il percorso in modo che in futuro le esecuzioni di Matlab U-track è nel percorso. Questa impostazione del percorso deve essere fatto solo una volta.
  3. Modificare la directory di lavoro alla directory contenente la serie per essere analizzati. U-traccia di richiamare digitando la console (Supplemental figura 10) movieSelectorGUI e premere INVIO. La finestra di selezione dei film sarà aperto (Supplemental Figura 11A).
  4. Premere sul pulsante di film New e verrà visualizzata la finestra di Movie edition (Supplemental figura 11B).
  5. Premere su Aggiungi canale per scegliere la directory con il video (VideoName/Series1/video) e riempire i film informazioni parametri. Impostare la directory di output per i risultati di U-traccia su risultati (videoName/Series1/risultati).
    Nota: I parametri di informazioni di film possono essere ricavati il microscopio e le condizioni di acquisizione.
  6. Premere su Impostazioni avanzate di canale e riempire i parametri relazionati all'acquisizione. Guardare i valori dei parametri nell'esempio (Supplemental figura 11).
  7. Premere Salva sulla finestra delle regolazioni avanzate canale e Salva sulla finestra Movie edition . Il programma chiederà conferma della scrittura del file chiamato movieData.mat nella directory di risultati . Confermare.
  8. Dopo aver creato il filmato, premete su continua nella finestra di selezione di film. U-traccia chiederà circa il tipo di oggetto da analizzare. Scegliere Single-particelle (Supplemental figura 12). La finestra del pannello di controllo verrà visualizzato (Supplemental figura 13A).
    1. Selezionare il primo passo passo 1: rilevamento e premere sull'impostazione. (Supplemental figura 13B) verrà visualizzata la finestra di Impostazione gaussiana modello mistura raccordo . Nell'esempio, "Valore alfa per il confronto con sfondo locale" è impostata a 0,001 e "Con una media di Rolling-finestra tempo" 3 (Supplemental figura 13B).
    2. Premere su applica nella finestra Impostazioni gaussiana modello mistura montaggio e correre nel Pannello di controllo. Con la configurazione supplementare nella figura 13, solo il passaggio di rilevamento viene eseguito. Questo passaggio richiede pochi minuti (2-5). Verifica i risultati premendo il pulsante di risultato del passaggio 1 (Detection, supplementare figura 14).
      Nota: Come mostrato sopra, il filmato mostra i cerchi rossi sulle particelle rilevate. Se non appare nessun cerchio rosso, questo passaggio non ha funzionato correttamente.
  9. Eseguire l'identificazione delle tracce, vale a dire l'Unione le particelle rilevate nel passaggio precedente in tracce che si estendono su più fotogrammi. Questo è il passo 2: rilevamento di U-traccia le cui impostazioni devono essere definite come mostrato nella Figura supplementare 15A-C. Le impostazioni della funzione costo passaggio 2 per il collegamento a un fotogramma e Gap di chiusura, fusione e scissione nell'esempio sono mostrate in Figura supplementare 15B e C, rispettivamente.
  10. Dopo aver impostato i parametri per il passaggio 2, premere Esegui nel Pannello di controllo e solo passaggio 2 viene eseguito (Supplemental figura 16).
  11. Eseguire l'analisi di traccia, passaggio 3. Definire le impostazioni come mostrato nella Figura 17 supplementare (pannello di destra). Quindi, premere applica nel pannello di impostazione-Motion Analysis ed eseguire in controllo pannello-U-Track. Questo passaggio richiede pochi secondi.
  12. Verificare con il tasto del risultato del passaggio 3 che il processo abbia identificato correttamente tutte le tracce. Per farlo, fare clic su Mostra il numero di traccia della finestra Opzioni filmato e controllare fotogramma per fotogramma che ogni traccia è stato identificato correttamente (Supplemental figura 18). Annotare manualmente quelle particelle che non sono vere particelle.
    Nota: Se questa selezione manuale non è fatto, una selezione automatica più debole può essere eseguita più tardi quando si calcola il coefficiente di diffusione (Vedi punto 4).

4. calcolo dei coefficenti di diffusione e classificazione delle traiettorie

  1. Assicurarsi che tutti gli script vengono richiamati dalla directory del video analizzato (nell'esempio, VideoName/Serie1).
  2. Leggi tutte le traiettorie per calcolare i coefficienti di diffusione mediante l'emissione in Matlab console il comando: trajectories=readTrajectories(0.1), dove 0.1 è il tempo in secondi tra due fotogrammi consecutivi (intervallo di tempo, mostrato nel pannello film Informazioni, supplementare figura 11B).
  3. Escludi traiettorie corrispondente erroneamente identificato macchie/traiettorie. Dare un elenco dei punti da escludere. Per esempio, per escludere i punti 4, 5 e 28, digitare: traiettorie = readTrajectories (0,1 [4, 5, 28]).
  4. Calcolare i coefficienti di diffusione istantanea per ognuno dei brani di questa cella. In questo caso, calcolare il coefficiente di diffusione per un lasso di tempo = 4, chiamato D1-4. Per farlo, eseguire in Matlab console il comando: D = calculateDiffusion (traiettorie, 113.88e-3, 0,0015, 'alpha') dove le traiettorie sono le traiettorie ottenute nel passaggio 3, 113.88e-3 è la dimensione in pixel delle immagini acquisite in micron, 0,0015 è un limite superiore per i coefficenti di diffusione delle particelle immobile misurate in µm2/s e 'alpha' è il modello adattato come spiegato di seguito.
    Nota: Quando si utilizza una fotocamera più veloce e si desidera più fotogrammi per calcolare il parametro di diffusione aumentano, per esempio a 20, da D = calculateDiffusion (traiettorie, 113.88e-3, 0,0015, 'alpha', ', 20). Il parametro di stringa prima di 20, nell'esempio precedente, ', è il suffisso aggiunto al file di output. Questo suffisso può essere utilizzato per distinguere le diverse analisi.
  5. Montare il MSD con una funzione diversa chiamando la funzione calculateDiffusion nuovo con una raccordo diverse modalità ('limitato', 'libero' o 'diretto'). In questo esempio, 'confinati': D = calculateDiffusion (traiettorie, 113.88e-3, 0,0015, 'confinati').
  6. Ottenere i risultati di raccordo per il modello diretto, come mostrato nella Figura 20 supplementare.
  7. Scomporre le traiettorie in traiettorie brevi e lunghi. Utilizzare il comando: [shortTrajectories, longTrajectories]=separateTrajectoriesByLength(trajectories,50) dove 50 è la lunghezza minima in cornici di una traiettoria da considerarsi lungo (nell'esempio riportato).
  8. Studiare le traiettorie breve utilizzando la stessa procedura di montaggio descritta al punto 4.3: D = calculateDiffusion (shortTrajectories, 113.88e-3, 0,0015, 'regia', 'Corto'). Analizzare le traiettorie anomale e breve con il comando: D = calculateDiffusion (shortTrajectories, 113.88e-3, 0,0015, 'alpha', 'Breve').
  9. Analizzare lunghe traiettorie per classificare il tipo di movimento attraverso il loro spettro di Scaling momento (MSS)7. Il comando: trajectoriesClassification = classifyLongTrajectories (longTrajectories, 113.88e-3,0.0015, 'Long') Mostra l'analisi nella schermata e genera un file chiamato trajectoryClassification < suffisso >. txt Directory results\TrackingPackage\tracks.

5. calcolo dei Cluster Ssize attraverso la densità delle particelle

Nota: Assicurarsi che tutti gli script vengono richiamati dalla directory del video analizzato (nell'esempio illustrato, VideoName/Serie1).

  1. Analizzare l'intensità di ogni particella lungo la loro traiettoria. Per farlo, è necessario richiamare lo script digitando nella console di Matlab: analyzeSpotIntensities che accetta come input le traiettorie calcolate da U-traccia nella prima sezione. Nella sua forma più semplice, basta chiamare lo script senza alcun argomento dalla directory del video analizzato (nell'esempio illustrato, VideoName/Series1) analyzeSpotIntensities(). Configurare questo comportamento di base in molti modi diversi, fornendo argomenti dello script come in: analyzeSpotIntensities ('Arg1´, Value1, ' Arg2´, valore2,...). Argomenti validi con i corrispondenti valori di variabile ('ArgN´, valoreN) sono elencati.
    1. ('spotRadius´, 1)
      Analizzare l'intensità di fluorescenza utilizzando il spotRadius di 1 pixel (impostazione predefinita) che corrisponde a una patch di dimensioni 3x3 centrato nel punto ((2*spotRadius+1)x(2*spotRadius+1)).
      Nota: Per una patch di 5 x 5 centrato nel punto, scegliere un spotRadius di 2, ecc.
    2. ('onlyInitialTrajectories´, 1)
      Se questo argomento è dato (true, il valore di 1), è possibile analizzare solo le traiettorie che iniziano nel primo fotogramma del video. Questo è utile per analizzare le immagini di controllo (di default 0, false).
    3. ('trackTrajectory´, 0)
      Se questo argomento è impostato su 0 (falso), quindi tenere la coordinata del punto in suo primo fotogramma per tutte le cornici (questo è utile per le macchie immobile). Se l'argomento è impostato su 1 (di default 1, true), quindi il posto viene rilevato lungo il video seguendo le coordinate calcolate da U-traccia.
    4. ('excludeTrajectories´, [4,5,28])
      Includere il numero di traiettoria di tali traiettorie esclusi nella fase 4.3 (nell'esempio 4, 5, 28).
    5. ('extendTrajectory ', 1)
      Se questo argomento è impostato su 1 (true), quindi analizzare l'intensità nella patch fino alla fine del video (anche se la traiettoria si ferma all'inizio). La coordinata del punto è l'ultima coordinata nella traiettoria (se trackTrajectory è true) o la prima coordinata nella traiettoria (se trackTrajectory è false). Questo argomento è falso (0) per impostazione predefinita.
    6. ('subtractBackground´, 1)
      Se questo parametro è impostato, quindi corretto il crudo la fluorescenza misurata in ogni punto dalla stima di fluorescenza di fondo per questo spot (Vedi sotto). Questo argomento è vero (1), per impostazione predefinita.
    7. ('meanLength´, numero di telaio)
      Se questo parametro è impostato, il posto di intensità media è misurato la lunghezza indicata. Impostare 'meanLength', 20 di misurare l'intensità di spot media presso i primi 20 fotogrammi. Se l'argomento non è impostato, l'intensità di spot è calcolata l'intera traiettoria (per impostazione predefinita, integrale).
    8. ('showIntensityProfiles´, 1)
      Impostare questo parametro come 1 (di default 0, false), per tracciare il profilo di intensità lungo le cornici differenti come pure loro background.
      Nota: Queste trame sono molto utili per identificare photobleaching come mostrato nella Figura 21 supplementare. Per ogni percorso, la routine analizza automaticamente se è possibile che ci sia stato photobleaching. Ciò avviene confrontando i valori di intensità con t di uno studente nel primo e l'ultimo fotogramma N lungo il percorso. Per impostazione predefinita, N è 10, ma questo valore può essere modificato tramite l'argomento ' Nbleach´.
    9. ('backgroundMethod´, valore)
      Impostare questo parametro per determinare il fondo di ogni spot. Questo può essere fatto in diversi modi, e quello da utilizzare può essere selezionato cambia il "valore":
      1. ('backgroundMethod´, 0)
        Utilizzare questo valore per identificare manualmente lo sfondo per l'intero video. Permettono di selezionare 8 punti nel primo fotogramma del video. Una patch attorno a questi punti è analizzata lungo tutto il video, e il quantile 95% di tutte queste intensità viene scelto come l'intensità di sfondo per tutti i punti.
      2. ('backgroundMethod´, 1)
        Utilizzare questo valore per identificare manualmente lo sfondo per ogni fotogramma. Scegliere 8 punti per ogni punto e ogni fotogramma. Si tratta di un compito che richiede tempo, ma dà un sacco di controllo per l'utente. Il quantile 95% delle intensità in queste patch è scelto come l'intensità di sfondo per questo spot in questo frame.
      3. ('backgroundMethod´, 2)
        Utilizzare questo valore per calcolare lo sfondo di ogni spot stimato da 8 punti si trova in un cerchio intorno il posto con un raggio controllato dall'argomento ' backgroundRadius´ (per impostazione predefinita, 4 * spotRadius).
      4. ('backgroundMethod´, 3)
        Utilizzare questo valore per calcolare lo sfondo per ogni fotogramma prima individuazione della cella nel video e poi analizzando le intensità della cella in ogni fotogramma (Supplemental figura 22).
        Nota: Lo sfondo è stato scelto come il valore di grigio in un dato quantile di questa distribuzione (per impostazione predefinita 0,5 (= 50%), anche se questo parametro può essere controllato tramite l'argomento ' backgroundPercentile´, questo valore può essere impostato più alto, per esempio, 0,9 (= 90%) anche se la maggior parte della cella deve essere considerato come sfondo. Per aiutare nell'identificazione della cella, indicano quale è il valore di background massimo previsto lungo i fotogrammi usando l'argomento ' maxBackground´ (per esempio, in tutti i video analizzati, il valore di sfondo normalmente non va oltre 6000)13. Per impostazione predefinita, questa opzione è impostata su 0, ovvero che questo aiuto non viene utilizzato per impostazione predefinita. Vedere quale è la rilevazione delle cellule e l'area selezionata per la stima di sfondo impostando l'argomento ' showImages´ a 1 (fermata l'esecuzione in qualsiasi momento premendo CTRL-C).
  2. Raccogliere le informazioni di diffusione e intensità per tutte le traiettorie calcolate in passaggi 4 e 5.1, rispettivamente, utilizzando gatherDiffusion.AndIntensity (). Raccogliere solo le informazioni di diffusione e intensità per breve traiettorie. Per farlo, utilizzare i suffissi utilizzati nel punto 4.7 e tipo: gatherDiffusionAndIntensity ('Short´) dove ' Short´ è il suffisso utilizzato nel passo 4.7.
  3. Raccogliere la rappresentazione in scala di momento spettro e l'intensità informationby digitando: gatherTrajectoryClassificationAndIntensity('Long') dove 'Lungo' è il suffisso utilizzato nel passo 4.7. Un riepilogo di tutti i file generati usando questo protocollo è illustrato nella Figura 2.

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Risultati

L'utilizzo di questo protocollo consente il rilevamento automatizzato delle particelle rilevato nel film di microscopia di fluorescenza e l'analisi delle loro caratteristiche dinamiche. Inizialmente, le cellule transfected con la proteina fluorescente-accoppiato di cui tenere traccia. Il livello appropriato di recettori presenta sulla superficie delle cellule che permette che SPT è ottenuta dalla cella ordinamento (Figura 1). Celle selezionate vengono analizz...

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Discussione

Il metodo descritto è facile da eseguire anche senza avere alcuna precedente esperienza di lavoro con Matlab. Tuttavia, la routine di Matlab estremamente richiedono precisione con la nomenclatura dei comandi diversi e la localizzazione delle diverse cartelle impiegato dal programma. Di rilevamento routine di analisi (passaggio 3), più parametri possono essere modificati. La finestra "Impostazione gaussiana-miscela modello raccordo" (punto 3.8) controlla come U-traccia rileverà singole particelle sul video. Questo viene f...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Ringraziamenti

Siamo grati a Carlo Manzo e Maria García Parajo per la loro guida e il codice sorgente dell'analisi del coefficiente di diffusione. Questo lavoro è stato sostenuto in parte da sovvenzioni dal Ministero spagnolo della scienza, innovazione e Università (SAF 2017-82940-R) e il programma RETICS dell'Instituto de salud Carlos III (RD12/0009/009 e RD16/0012/0006; RIER). LMM e JV sono supportati dal programma COMFUTURO del CSIC Fondazione generale.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Cellule Jurkat umaneATCCCRL-10915Linea cellulare T umana. Qualsiasi altro tipo di cellula può essere analizzato con questo software
pAcGFPm-N1 (PT3719-5)DNA3GFPClontech632469Diverse proteine fluorescenti possono essere seguite e analizzate con questo
elettroporatore di routine Gene Pulse X Cell.BioRad Usiamo 280 V, 975 mF, per le celle Jurkat. Usa il metodo di trasfezione che funziona meglio nelle tue mani.
Citometro a flusso Cytomics FC 500Beckman Coulter
MoFlo Astrios Cell Sorter Beckman CoulterA seconda del livello di trasfezione, la selezione delle cellule potrebbe non essere necessaria. È inoltre possibile utilizzare cellule con espressione stabile di livelli adeguati del recettore di interesse.
Dako QifikitDakoCytomationK0078Utilizzato per quantificare il numero di recettori nella superficie cellulare.
Piastre micropozzetto con fondo in vetroMatTek corporationP35G-1.5-10-C
Fibronectina umana dal plasmaSigma-AldrichF0895
Umano ricombinante CXCL12PeproTech300928A
Invertito Leica AM TIRFLeica
EM-CCD cameraAndor DU 885-CSO-#10-VP
MATLABIl software MathWorks, Natick, MA
U-Track2Danuser Laboratory
ImageJNIHhttps://imagej.nih.gov/ij/
FiJiFiJIhttps://imagej.net/Fiji)
u-Track2softwareStrumento Matlab. Per l'installazione, scaricare .zip file dalla pagina web (http://lccb.hms.harvard.edu/software.html) e decomprimere il file in una directory a scelta
GraphPad PrismGraphPad
Software

Riferimenti

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