Elaborazione di protocollo per l'analisi della diffusione e dimensione dei Cluster di recettori di membrana mediante microscopia a fluorescenza

Summary

Qui, presentiamo un protocollo per singola particella monitoraggio analisi delle immagini che permette la valutazione quantitativa dei coefficenti di diffusione, tipi di movimento e cluster di dimensioni delle singole particelle rilevate mediante microscopia a fluorescenza.

Abstract

Monitoraggio su una sequenza video e l'analisi posteriore dei loro traiettorie delle particelle al giorno d'oggi sono un'operazione comune a molti studi biologici. Utilizzando l'analisi del ricevitore della membrana cellulare cluster come un modello, vi presentiamo un protocollo dettagliato per questa attività di analisi di immagine utilizzando Fiji (ImageJ) e routine di Matlab per: 1) definire le aree di interesse e progettare maschere adattate a queste regioni; 2) traccia le particelle in video microscopia di fluorescenza; 3) analizzare le caratteristiche di diffusione e l'intensità dei brani selezionati. I tipi di movimento e la dimensione dei cluster, analisi quantitativa dei coefficienti di diffusione ottenuta mediante microscopia a fluorescenza ed elaborazione di immagini fornisce un valido strumento per determinare oggettivamente particelle dinamiche e le conseguenze della modifica condizioni ambientali. In questo articolo presentiamo protocolli dettagliati per l'analisi di queste caratteristiche. Il metodo descritto qui non solo permette la rilevazione di rilevamento di singola molecola, ma consente anche di automatizzare la stima dei parametri di diffusione laterale alla membrana delle cellule, classifica il tipo di traiettoria e consente analisi completa superando così il Difficoltà a quantificare la dimensione dello spot sulla sua intera traiettoria alla membrana delle cellule.

Introduction

Proteine di membrana incorporati nel bilayer del lipido sono in continuo movimento a causa di diffusione termica. Le dinamiche sono essenziali per regolare le risposte cellulari, come interazioni intermolecolari permettono la formazione di complessi che variano nel formato da monomeri di oligomeri e influenzare la stabilità di complessi di segnalazione. Chiarire i meccanismi che controllano la dinamica della proteina è dunque una nuova sfida in biologia cellulare, necessaria per comprendere le vie di trasduzione del segnale e per identificare le funzioni delle cellule imprevisti.

Alcuni metodi ottici sono stati sviluppati per lo studio di q....

Protocol

1. preparazione dei campioni biologici

1. Crescere le cellule Jurkat in RPMI 1640 supplementato con 10% FCS, NaPyr e L-Glutammina (RPMI completo). Cellule di Electroporate Jurkat (20 x 10⁶ cellule/400 µ l di RPMI 1640 con 10% FCS) con un vettore di ricevitore di chemokine GFP-etichettata monomerico (CXCR4-AcGFP, 20 μg) per consentire il rilevamento utilizzando la microscopia a fluorescenza.
   Nota: È possibile utilizzare altre proteine fluorescenti monomerici come mCherry, mScarlet, ecc.
2. 24 ore dopo la trasfezione di analizzare le cellule in un citometro a flusso per determinare sia la vitalità cellulare e l'espressione di....

Results

L'utilizzo di questo protocollo consente il rilevamento automatizzato delle particelle rilevato nel film di microscopia di fluorescenza e l'analisi delle loro caratteristiche dinamiche. Inizialmente, le cellule transfected con la proteina fluorescente-accoppiato di cui tenere traccia. Il livello appropriato di recettori presenta sulla superficie delle cellule che permette che SPT è ottenuta dalla cella ordinamento (Figura 1). Celle selezionate vengono analizz.......

Discussion

Il metodo descritto è facile da eseguire anche senza avere alcuna precedente esperienza di lavoro con Matlab. Tuttavia, la routine di Matlab estremamente richiedono precisione con la nomenclatura dei comandi diversi e la localizzazione delle diverse cartelle impiegato dal programma. Di rilevamento routine di analisi (passaggio 3), più parametri possono essere modificati. La finestra "Impostazione gaussiana-miscela modello raccordo" (punto 3.8) controlla come U-traccia rileverà singole particelle sul video. Questo viene f.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cellule Jurkat umane	ATCC	CRL-10915	Linea cellulare T umana. Qualsiasi altro tipo di cellula può essere analizzato con questo software
pAcGFPm-N1 (PT3719-5)DNA3GFP	Clontech	632469	Diverse proteine fluorescenti possono essere seguite e analizzate con questo
elettroporatore di routine Gene Pulse X Cell.	BioRad		Usiamo 280 V, 975 mF, per le celle Jurkat. Usa il metodo di trasfezione che funziona meglio nelle tue mani.
Citometro a flusso Cytomics FC 500	Beckman Coulter
MoFlo Astrios Cell Sorter	Beckman Coulter		A seconda del livello di trasfezione, la selezione delle cellule potrebbe non essere necessaria. È inoltre possibile utilizzare cellule con espressione stabile di livelli adeguati del recettore di interesse.
Dako Qifikit	DakoCytomation	K0078	Utilizzato per quantificare il numero di recettori nella superficie cellulare.
Piastre micropozzetto con fondo in vetro	MatTek corporation	P35G-1.5-10-C
Fibronectina umana dal plasma	Sigma-Aldrich	F0895
Umano ricombinante CXCL12	PeproTech	300928A
Invertito Leica AM TIRF	Leica
EM-CCD camera	Andor	DU 885-CSO-#10-VP
MATLAB	Il software MathWorks, Natick, MA
U-Track2	Danuser Laboratory
ImageJ	NIH		https://imagej.nih.gov/ij/
FiJi	FiJI		https://imagej.net/Fiji)
u-Track2			softwareStrumento Matlab. Per l'installazione, scaricare .zip file dalla pagina web (http://lccb.hms.harvard.edu/software.html) e decomprimere il file in una directory a scelta
		GraphPad Prism	GraphPad