Articolo metodologico

Purificazione e trapianto di cellule progenitrici Myogenic derivato esosomi per migliorare la funzione cardiaca nei topi distrofici muscolare di Duchenne

DOI:

10.3791/59320

⸱

10 aprile 2019

 ,  ,  ,  ,  , 
1Vascular Biology Center, Medical College of Georgia, Augusta University, 2Renji Hospital, School of Medicine, Shanghai Jiaotong University

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Qui, presentiamo un protocollo per migliorare la funzione cardiaca nei topi di distrofia muscolare di Duchenne transitoriamente trapiantando esosomi derivati da cellule progenitrici myogenic normale.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Duchene distrofia muscolare (DMD) è una malattia genetica recessiva legata al X causata da una mancanza di distrofina funzionale. La malattia non può essere curata, e come la malattia progredisce, il paziente sviluppa sintomi di scompenso cardiaco, aritmia e cardiomiopatia dilatativa. I topi mutanti DMDMDX non esprimono distrofina e sono comunemente usati come un modello murino di DMD. Nel nostro recente studio, abbiamo osservato che l'iniezione intramiocardica di tipo largo (WT)-esosomi derivato da cellule progenitrici myogenic (MPC-Exo) ripristino transitoriamente l'espressione di distrofina nel miocardio dei topi mutanti DMDMDX , che è stato associato con un miglioramento transitorio nella funzione cardiaca suggerendo che WT-MPC-Exo può fornire un'opzione per alleviare i sintomi cardiaci di DMD. Questo articolo descrive la tecnica di purificazione di MPC-Exo e trapianto nei cuori dei topi mutanti DMDMDX .

Introduzione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Distrofia muscolare di Duchenne (DMD) è una X-linked recessiva neuromuscolare malattia progressiva causata da una mutazione nel gene DMD e la perdita di distrofina funzionale1. Distrofina è espresso principalmente nel miocardio e nel muscolo scheletrico e meno è espressa nel muscolo liscio, ghiandole endocrine e neuroni2,3. DMD è il tipo più comune di distrofia muscolare con un'incidenza di uno per 3.500 a 5.000 ragazzi neonato in tutto il mondo4,5. Gli individui si sviluppano tipicamente necrosi progressiva del muscolo, perdita della deambulazione indipendente dalla prima adolescenza e morte nei decenni della loro vita a causa di scompenso cardiaco e insufficienza respiratoria6secondo al terzo.

Cardiomiopatia dilatativa, aritmie e scompenso cardiaco sono manifestazioni comuni cardiovascolare di DMD7,8. La malattia non può essere curata, trattamento di supporto può migliorare i sintomi o ritardare la progressione dell'insufficienza cardiaca, ma è molto difficile migliorare il cuore funzione9,10.

Simile ai pazienti di DMD, distrofia muscolare X-collegata (MDX) topi sono carenti di distrofina e presenti sintomi di cardiomiopatia11e di conseguenza sono ampiamente usati nella DMD associata cardiomiopatia ricerca. Al fine di ripristinare la distrofina in muscoli commoventi, terapia di trapianto allogeneic della cellula formativa ha dimostrato di essere un efficace trattamento per DMD12,13,14. Esosomi, vescicole di membrana di 30-150 nm secernute da vari tipi cellulari, svolgono un ruolo chiave nella comunicazione cellula--cellula attraverso il trasporto di materiale genetico, come RNA messaggero (mRNA) e non-codificazione RNAs15,16,17 ,18,19,20,21.

Nostri studi precedenti hanno dimostrato che gli esosomi derivati da cellule progenitrici myogenic (MPC), ad esempio linea di cellule C2C12, possono trasferire dystrophin mRNA a host cardiomiociti dopo iniezione cardiaca diretta22, che indica quella consegna allogenico di MPC-derivato esosomi (MPC-Exo) possono ripristinare transitoriamente DMD espressione genica nei topi MDX. Questo articolo si concentra su tecniche di purificazione e trapianto di MPC-Exo.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Protocollo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli animali sono stati gestiti secondo protocolli approvati e le norme sul benessere degli animali del Comitato uso il Medical College della Georgia all'Università di Augusta e istituzionali Animal Care.

1. isolamento e purificazione di esosomi MPC-derivato

  1. Seme 5 x 106 C2C12 celle in una piastra di coltura cellulare di 15cm con 20ml completo Dulbecco modificate, mezzo di Eagle (DMEM) contenente 10% siero bovino fetale (FBS), 100 U/mL di penicillina G e 100 μg/mL di streptomicina. Incubare a 37 ° C e 5% CO2.
  2. Preparare il supporto di esosomi-vuotati dall'ultracentrifugazione di FBS a 100.000 x g per 18 ore a 4 ° C, utilizzando un rotore oscillante. Scartare il pellet.
  3. Sostituire il DMEM completo con esosomi-vuotati medio quando le cellule dello strato monomolecolare raggiungono 80% confluenza nella piastra di coltura.
  4. Utilizzare una pipetta di trasferimento per raccogliere il surnatante da piastra di coltura cellulare ogni 48 h per un totale di tre volte. Raccogliere il surnatante in provette centrifuga da 50 mL e centrifugare a 150 x g per 10 min rimuovere le cellule rimanenti.
  5. Filtrare il surnatante attraverso un filtro di 0,22 μm per eliminare i detriti cellulari. Ultracentrifuga il mezzo filtrato in ultra-chiari tubi utilizzando il rotore oscillante a 100.000 x g per 120 min a 4 ° C per precipitare esosomi.
  6. Risospendere il pellet contenente esosomi in tampone fosfato salino (PBS) e riempire l'intero tubo ultra-trasparente con PBS. Eseguire ultracentrifugazione di questa sospensione a 100.000 x g per 120 min a 4 ° C per eliminare le proteine contaminanti.
  7. Eliminare il supernatante e risospendere il pellet di esosomi in 100 µ l PBS. Conservare a-80 ° C per un uso futuro.
  8. Per analisi di microscopia elettronica, posto 3 µ l di sospensione exosomal su una griglia di formvar-rivestito rame microscopio elettronico 200 mesh per 5 min a temperatura ambiente. Continuare con acetato di uranile standard colorazione23. Esaminare la griglia semi-secca di microscopia elettronica di trasmissione.

2. intramiocardico esosomi consegna

Nota: Abbiamo usato i sei topi in ogni gruppo.

  1. Anestetizzare topi DBA/2J-DMDMDX (maschio; età > 10 mesi; peso corporeo (BW) > 18 g) con l'iniezione intraperitoneale (i.p.) di 100 mg/kg BW di ketamina combinato con 10 mg/kg BW di xilazina e confermare la profondità dell'anestesia con pizzico di punta.
  2. Difficoltà ogni mouse in posizione supina su una piattaforma chirurgica utilizzando nastro per fissare ogni arto e collocare una sutura 3-0 orizzontalmente sotto i denti superiori per tenere la mascella superiore in posizione.
  3. Applicare la crema depilatoria sul lato sinistro del petto del mouse per rimuovere il pelo dalla pelle.
  4. Eseguire l'intubazione endotracheale tramite cavità orale utilizzando un catetere 24G e ventilare il mouse con l'aria ambiente a una velocità di 195 respiri/min utilizzando un ventilatore del roditore (Vedi la Tabella materiali).
  5. Disinfettare la pelle con alcool di 75% e 10% povidone iodio.
  6. Fare una 10\u201215 incisione obliqua mm dal bordo sternale sinistro per l'ascella sinistra, tagliato il pettorale e il pettorale minore di una forbice, poi fare un thoracotomy di sinistra attraverso il quarto spazio intercostale. Inserire delicatamente le bande di riavvolgitore per diffondere la cavità toracica ad una larghezza di 10 mm. Prestare attenzione per evitare danni al polmone sinistro.
  7. Utilizzare due dritto pinzette per rimuovere il pericardio, li separano e metterli dietro le punte del divaricatore per esporre il cuore. Iniettare MPC-Exo (50 μg in 30 µ l PBS) o 30 μL PBS (come controllo) intramyocardially nella parete anteriore del ventricolo sinistro usando un ago da insulina 31G presso un unico sito.
  8. Utilizzare suture in nylon 6-0 per chiudere la cavità toracica, muscoli pettorali e la pelle in sequenza.
  9. Recuperare i topi. Una volta che la respirazione ritmica, spontanea è presente, è possibile rimuovere i topi dal ventilatore ed estubare. Osservare e registrare la condizione di topi dopo l'intervento chirurgico.

3. l'ecocardiografia

Nota: Un singolo osservatore cieco per i gruppi sperimentali esegue ecocardiografia e analisi dei dati.

  1. Due giorni dopo il trapianto di PBS/esosomi, anestetizzare i topi con isoflurano 1\u20122%.
  2. Difficoltà un mouse in posizione supina usando del nastro e applicare il gel acustico preriscaldato sulla zona sinistra del petto.
  3. Valutare la funzione ventricolare di sinistra da ecocardiografia come precedentemente descritto16,24.
    1. Ottenere la visualizzazione di parasternale asse lungo del ventricolo sinistro (LV) in due dimensioni (modalità B) e quindi ruotare la sonda ad ultrasuoni 90° per ottenere una visione di breve-asse di LV a livello del muscolo papillare.
    2. Registrare le immagini ecocardiografiche M-mode e misura diametro in fine-diastolica ventricolare sinistra (LVEDD), volume telesistolico ventricolare sinistro (LVESD), volume end-diastolic ventricolare sinistra (LVEDV) e il volume telesistolico ventricolare sinistro (LVESV).
      Nota: Riduzione frazionaria (% FS) = [(LVEDD − LVESD) / LVEDD] x 100 e frazione di eiezione ventricolare sinistra (LVEF %) = [(LVEDV − LVESV) / LVEDV] x 100.

4. Immunohistochemistry

  1. Due giorni dopo il trapianto di PBS/esosomi, anestetizzare topi (Vedi punto 2.1) e tagliare lo sterno aperto per esporre la cavità toracica. Sezionare la vena cava inferiore e irrorare il cuore attraverso l'apice del ventricolo sinistro con 3 mL di PBS, seguita da 3 mL di paraformaldeide al 4% a temperatura ambiente, utilizzando un catetere di farfalla con un ago 25 G collegato ad una siringa da 5 mL.
  2. Incorpora cuori fissi in paraffina e tagliati in sezioni spesse di 5 μm.
  3. Deparaffinizzare xilene e reidratare in soluzioni di etanolo nel seguente ordine: 100% xilene (3 min), 100% xilene (3 min), etanolo al 100% (1 min), etanolo al 100% (1 min), etanolo al 95% (1 min), 80% di etanolo (1 min), H2O (1 min).
  4. Difficoltà sezioni di tessuto con paraformaldeide al 4% per 8 min a temperatura ambiente.
  5. Immergere i vetrini in citrato di sodio (0,01 M, pH 6.0) ed eseguire il ricupero dell'antigene utilizzando un documentalista di antigene.
  6. Permeabilize sezioni per 1 h a temperatura ambiente con 1% polietilene glicole etere tert-octylphenyl in PBS.
  7. Bloccare le sezioni con siero di capra del 5% in PBS per 1 h a temperatura ambiente.
  8. Incubare le sezioni con l'anticorpo primario diluito (anticorpo anti-distrofina) in PBS (1: 100) durante la notte a 4 ° C, quindi lavare tre volte con PBS per 5 min.
  9. Incubare le sezioni con anticorpo secondario diluito (Alexa Fluor 488 coniugato anti-coniglio di capra IgG) in PBS (1: 400) per 45 min a temperatura ambiente.
  10. Controllo autofluorescence utilizzando un'autofluorescenza tempra kit (vedere la Tabella materiali).
  11. Mezzo di montaggio uso contenente DAPI (Vedi la Tabella materiali) per montare le diapositive.
  12. Osservare vetrini al microscopio confocale.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Risultati

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Un diagramma di flusso per isolare e purificare gli esosomi da cellule C2C12 è illustrato nella Figura 1A. Per confermare la presenza di esosomi, abbiamo effettuato l'analisi di microscopia elettronica di trasmissione. Immagine di microscopia elettronica di trasmissione (Figura 1B) Mostra la morfologia delle vescicole di forma rotonda e brillante degli esosomi C2C12 derivato. L'analisi Western blot ha confermato la presenza di m...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Discussione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il metodo di isolamento esosomi puri è essenziale per studiare la funzione di esosomi. Una delle tecniche comuni per l'isolamento di esosomi è polietilenglicoli (pioli) mediate precipitazioni17,18,25. Esosomi possono essere precipitati in pioli e pellettati mediante centrifugazione a bassa velocità. PEG-mediata di purificazione è molto conveniente, basso costo, non ha bisogno di qualsiasi attrezzatura avanzata, ma c'è preoccupaz...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Dichiarazioni

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutti gli autori dichiara che non hanno conflitti di interesse.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tang erano parzialmente supportato dall'associazione americana del cuore: NIH-AR070029, NIH-HL086555, GRNT31430008, NIH-HL134354.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
0,22 μ m FiltroFisherbrand09-720-004
Piatto per colture cellulari da 15 cmThermo Fisher Scientific157150
Catetere da 24 GTERUMOSR-OX2419CA
Ago da insulina da 31 GBD328291
4% paraformaldeide AffymetrixAAJ19943K2
Provette da centrifuga da 50 mlThermo Fisher Scientific339652
6-0 suturaPro Advantage di NDCP420697
Alexa Fluor 488 capra anti-coniglio IgGThermo Fisher ScientificA-11008
Soluzione antibiotica antimicoticaCorning 30-004-CI
Anticorpo anti-distrofinaAbcamab15277
Recuperatore dell'antigene il recupero dell'antigeneR2100-USAptum Biologics
.Vector LaboratoriesSP-8400
C2C12 linea cellulareATCCCRL-1772
CentrifugaUnicoC8606
Change-A-Tip Cauteri ad alta temperaturaBovie Medical CorporationHIT
Microscopia confocaleZeiss ZeissZeiss 780 Topi DBA
The Jackson Laboratory013141
DMEMCorning 10-013-CM
Siero fetale bovino (FBS)Corning 35-011-CV
Siero di capra MP Biomedicals, LLC191356
IsofluranoPatterson veterinario07-893-1389
KetaminaHenry Schein056344
Mezzo di montaggio con DAPI Vector LaboratoriesH-1500
Kent ScientificSURGI-5001
Polietilenglicole terz-ottilfeniletereScientificBP151-100
Ventilatore per roditoriApparato Harvard55-7066
Rotore SW-28 TiBeckman342207
La piattaformadi imaging Vevo 2100Sistema a ultrasuoni FUJIFILM VisualSonicsVevo 2100
UltracentrifugaBeckman365672
Provette ultratrasparentiBeckman344058
Xilazina (XylaMed)Bimeda-MTC Animal Health Inc.1XYL003 8XYL006
Kit di spegnimento per autofluorescenza per di /2J-mdx confocali verticaliSet di divaricatori per topi Fisher

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Yiu, E. M., Kornberg, A. J. Duchenne muscular dystrophy. Journal of Paediatrics and Child Health. 51 (8), 759-764 (2015).
  2. Nudel, U., et al. Duchenne muscular dystrophy gene product is not identical in muscle and brain. Nature. 337 (6202), 76-78 (1989).
  3. Rae, M. G., O'Malley, D. Cognitive dysfunction in Duchenne muscular dystrophy: a possible role for neuromodulatory immune molecules. Journal of Neurophysiology. 116 (3), 1304-1315 (2016).
  4. Mah, J. K., et al. A systematic review and meta-analysis on the epidemiology of Duchenne and Becker muscular dystrophy. Neuromuscular Disorders. 24 (6), 482-491 (2014).
  5. D'Amario, D., et al. A current approach to heart failure in Duchenne muscular dystrophy. Heart. 103 (22), 1770-1779 (2017).
  6. Koeks, Z., et al. Clinical Outcomes in Duchenne Muscular Dystrophy: A Study of 5345 Patients from the TREAT-NMD DMD Global Database. Journal of Neuromuscular Diseases. 4 (4), 293-306 (2017).
  7. Kamdar, F., Garry, D. J. Dystrophin-Deficient Cardiomyopathy. Journal of the American College of Cardiology. 67 (21), 2533-2546 (2016).
  8. Wang, Z., et al. Regenerative Therapy for Cardiomyopathies. Journal of Cardiovascular Translational Research. , (2018).
  9. Fayssoil, A., Nardi, O., Orlikowski, D., Annane, D. Cardiomyopathy in Duchenne muscular dystrophy: pathogenesis and therapeutics. Heart Failure Reviews. 15 (1), 103-107 (2010).
  10. Hagan, M., Ashraf, M., Kim, I. M., Weintraub, N. L., Tang, Y. Effective regeneration of dystrophic muscle using autologous iPSC-derived progenitors with CRISPR-Cas9 mediated precise correction. Medical Hypotheses. 110, 97-100 (2018).
  11. Quinlan, J. G., et al. Evolution of the mdx mouse cardiomyopathy: physiological and morphological findings. Neuromuscular Disorders. 14 (8-9), 491-496 (2004).
  12. Siemionow, M., et al. Creation of Dystrophin Expressing Chimeric Cells of Myoblast Origin as a Novel Stem Cell Based Therapy for Duchenne Muscular Dystrophy. Stem Cell Reviews and Reports. 14 (2), 189-199 (2018).
  13. Sienkiewicz, D., Kulak, W., Okurowska-Zawada, B., Paszko-Patej, G., Kawnik, K. Duchenne muscular dystrophy: current cell therapies. Therapeutic Advances in Neurological Disorders. 8 (4), 166-177 (2015).
  14. Zhang, Y., et al. Long-term engraftment of myogenic progenitors from adipose-derived stem cells and muscle regeneration in dystrophic mice. Human Molecular Genetics. 24 (21), 6029-6040 (2015).
  15. Ju, C., et al. Transplantation of Cardiac Mesenchymal Stem Cell-Derived Exosomes for Angiogenesis. Journal of Cardiovascular Translational Research. 11 (5), 429-437 (2018).
  16. Ju, C., et al. Transplantation of Cardiac Mesenchymal Stem Cell-Derived Exosomes Promotes Repair in Ischemic Myocardium. Journal of Cardiovascular Translational Research. 11 (5), 420-428 (2018).
  17. Ruan, X. F., et al. Suxiao Jiuxin pill promotes exosome secretion from mouse cardiac mesenchymal stem cells in vitro. Acta Pharmacologica Sinica. 39 (4), 569-578 (2018).
  18. Ruan, X. F., et al. Exosomes from Suxiao Jiuxin pill-treated cardiac mesenchymal stem cells decrease H3K27 demethylase UTX expression in mouse cardiomyocytes in vitro. Acta Pharmacologica Sinica. 39 (4), 579-586 (2018).
  19. Chen, Y., Tang, Y., Fan, G. C., Duan, D. D. Extracellular vesicles as novel biomarkers and pharmaceutic targets of diseases. Acta Pharmacologica Sinica. 39 (4), 499-500 (2018).
  20. Chen, Y., Tang, Y., Long, W., Zhang, C. Stem Cell-Released Microvesicles and Exosomes as Novel Biomarkers and Treatments of Diseases. Stem Cells International. 2016, 2417268(2016).
  21. Murphy, C., et al. Emerging role of extracellular vesicles in musculoskeletal diseases. Molecular Aspects of Medicine. 60, 123-128 (2018).
  22. Su, X., et al. Exosome-Derived Dystrophin from Allograft Myogenic Progenitors Improves Cardiac Function in Duchenne Muscular Dystrophic Mice. Journal of Cardiovascular Translational Research. , (2018).
  23. Hu, G., et al. Exosome-mediated shuttling of microRNA-29 regulates HIV Tat and morphine-mediated neuronal dysfunction. Cell Death & Disease. 3, 381(2012).
  24. Bayoumi, A. S., et al. A carvedilol-responsive microRNA, miR-125b-5p protects the heart from acute myocardial infarction by repressing pro-apoptotic bak1 and klf13 in cardiomyocytes. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 114, 72-82 (2018).
  25. Wang, Y., et al. Exosomes/microvesicles from induced pluripotent stem cells deliver cardioprotective miRNAs and prevent cardiomyocyte apoptosis in the ischemic myocardium. International Journal of Cardiology. 192, 61-69 (2015).
  26. Cheruvanky, A., et al. Rapid isolation of urinary exosomal biomarkers using a nanomembrane ultrafiltration concentrator. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 292 (5), 1657-1661 (2007).
  27. Oksvold, M. P., Neurauter, A., Pedersen, K. W. Magnetic bead-based isolation of exosomes. Methods in Molecular Biology. 1218, 465-481 (2015).
  28. Pedersen, K. W., Kierulf, B., Neurauter, A. Specific and Generic Isolation of Extracellular Vesicles with Magnetic Beads. Methods in Molecular Biology. 1660, 65-87 (2017).
  29. Teng, X., et al. Mesenchymal Stem Cell-Derived Exosomes Improve the Microenvironment of Infarcted Myocardium Contributing to Angiogenesis and Anti-Inflammation. Cellular Physiology and Biochemistry. 37 (6), 2415-2424 (2015).
  30. Aminzadeh, M. A., et al. Exosome-Mediated Benefits of Cell Therapy in Mouse and Human Models of Duchenne Muscular Dystrophy. Stem Cell Reports. 10 (3), 942-955 (2018).

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Ristampe e permessi

Richiedi il permesso di riutilizzare il testo o le figure di questo articolo JoVE

Richiedi permesso

Tag

Cellule progenitrici miogenichepurificazione degli esosomiiniezione intramiocardicadistrofia muscolare di Duchenneanalisi ecocardiograficamicroscopia elettronica a trasmissioneanalisi Western blotcolorazione immunofluorescenteterreno privo di esosomiprotocollo di ultracentrifugazione

Articoli correlati