Articolo metodologico

Identificazione dei fattori nucleolari durante la replicazione dell'HIV-1 attraverso l'immunoprecipitazioni del rev e la spettrometria di massa

DOI:

10.3791/59329

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26 giugno 2019

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1Molecular and Cellular Biology Department, Beckman Research Institute at the City of Hope, 2Irell & Manella Graduate School of Biological Sciences, 3Department of Molecular Immunology, Beckman Research Institute and the City of Hope

In questo articolo

Sommario

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Qui descriviamo l'immunoprecipitazioni Rev in presenza di replicazione HIV-1 per la spettrometria di massa. I metodi descritti possono essere utilizzati per l'identificazione dei fattori nucleolari coinvolti nel ciclo infettivo dell'HIV-1 e sono applicabili ad altri modelli di malattia per la caratterizzazione di percorsi poco studiati.

Abstract

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Il ciclo infettivo HIV-1 richiede interazioni virali delle proteine con i fattori dell'ospite per facilitare la replicazione, l'imballaggio e il rilascio virali. Il ciclo infettivo richiede ulteriormente la formazione di complessi proteici virali/ospiti con RNA HIV-1 per regolare lo splicing e consentire il trasporto nucleocitoplasmatico. La proteina HIV-1 Rev realizza l'esportazione nucleare di mRNA HIV-1 attraverso la multimerizzazione con obiettivi cis-recidivi intronici - l'elemento di risposta Rev (RRE). Un segnale di localizzazione nucleolare (NoLS) esiste all'interno del COOH-terminus del motivo ricco di arginina Rev (ARM), permettendo l'accumulo di complessi Rev/RRE nel nucleolo. I fattori nucleolari sono ipotizzati per sostenere il ciclo infettivo dell'HIV-1 attraverso varie altre funzioni oltre a mediare l'esportazione nucleare indipendente dall'mRNA e lo splicing. Descriviamo un metodo di immunoprecipitazioni del Rev di tipo selvaggio (WT) rispetto alle mutazioni nucleolare Rev (mutazioni Rev nucleolari e Rev-NoLS) in presenza di replicazione HIV-1 per la spettrometria di massa. Fattori nucleolari implicati nel trasporto nucleocitoplasmatico (nucleophosmin B23 e nucleolin C23), così come i fattori di giunzione cellulare, perdono l'interazione con Rev in presenza di mutazioni Rev-NoLS. Vari altri fattori nucleolari, come la casella SnoRNA C/D 58, sono identificati per perdere l'interazione con le mutazioni Rev, ma la loro funzione nel ciclo di replicazione dell'HIV-1 rimane sconosciuta. I risultati qui presentati dimostrano l'uso di questo approccio per l'identificazione di fattori nucleolari virali/ospiti che mantengono il ciclo infettivo dell'HIV-1. I concetti utilizzati in questo approccio sono applicabili ad altri modelli di malattie e virali che richiedono la caratterizzazione di percorsi poco studiati.

Introduzione

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Il nucleolo è postulato come il terreno di interazione di vari fattori cellulari e virali necessari per la replicazione virale. Il nucleolo è una struttura complessa suddivisa in tre diversi comparti: il compartimento fibrillare, il compartimento fibrillare denso e il compartimento granulare. La proteina HIV-1 Rev si localizza specificamente all'interno di compartimenti granulari; Tuttavia, il motivo di questo modello di localizzazione è sconosciuto. In presenza di mutazioni a punto singolo all'interno della sequenza NoLS (mutazioni Rev 4, 5 e 6), Rev mantiene un modello nucleolare e in precedenza ha dimostrato di salvare la replica HIV-1HXB2, tuttavia, con una minore efficienza rispetto al WT Rev1 . Tutte le mutazioni monopunto non sono in grado di sostenere il ciclo infettivo dell'HIV-1NL4-3. In presenza di più mutazioni monopunto all'interno della sequenza NoLS (mutazioni Rev-NoLS 2 e 9), Rev è stato osservato per disperdersi in tutto il nucleo e il citoplasma e non è stato in grado di salvare la replica HIV-1HXB2 1. L'obiettivo di questo studio proteomica è quello di decifrare i fattori nucleolari e cellulari non nucleolari coinvolti nella via infettiva HIV-1 mediata da Rev. Le condizioni di immunoprecipitazioni del rev sono ottimizzate attraverso l'interazione con il nucleolare B23 fosforproteina, che in precedenza ha dimostrato di perdere l'interazione con Rev in presenza di mutazioni nucleolare.

I fattori cellulari Rev sono stati ampiamente studiati in passato; tuttavia, questo è stato fatto in assenza di patogenesi virale. Una proteina, in particolare, che è caratterizzata in questo studio attraverso l'interazione del rev durante la replicazione HIV-1 è la fosforproteina nucleolare B23 - chiamata anche nucleofosmina (NPM), numatrina o NO38 negli anfibi2,3, 4. B23 è espresso come tre isoformi (NPM1, NPM2 e NPM3) - tutti membri della famiglia chaperone nucleare nucleophosmin/nucleoplasmin5,6. Lo chaperone molecolare NPM1 funziona nell'assemblaggio corretto dei nucleosomi, nella formazione di complessi di acido proteico/nucleico coinvolti nelle strutture di ordine superiore della cromatina7,8,e nella prevenzione dell'aggregazione e misfolding delle proteine bersaglio attraverso un dominio di base N-terminale (residui 1-120)9. La funzionalità NPM1 si estende alla genesi del ribosoma attraverso il trasporto di particelle preribosomiche tra il nucleo e il citoplasma10,11, l'elaborazione dell'RNA preribosomico nella sequenza distanziale trascritto internamente 12,13, e arrestando l'aggregazione nucleolare delle proteine durante l'assemblaggio ribosomiale14,15. NPM1 è implicato nell'inibizione dell'apoptosi16 e nella stabilizzazione dei soppressori tumorali ARF17,18 e p5319, rivelando il suo duplice ruolo come fattore oncogenico e soppressore tumorale. NPM1 partecipa alle attività cellulari di stabilità del genoma, replicazione centrosome e trascrizione. NPM1 si trova nei nucleoli durante l'interfase del ciclo cellulare, lungo la periferia cromosomica durante la mitosi, e nei corpi prenucleolari (PNB) alla conclusione della mitosi. NPM2 e NPM3 non sono ben studiati come NPM1, che subisce livelli di espressione alterati durante la malignità20.

NPM1 è documentato nell'shuttling nucleocitoplasmatica di varie proteine nucleari/nucleolare attraverso un NES interno e NLS9,21 ed è stato precedentemente segnalato per guidare l'importazione nucleare di HIV-1 Tat e Rev proteine. In presenza di proteine di fusione B23-binding-dominio-z-galactosidasi, Tat si smarrisce all'interno del citoplasma e perde l'attività di trasattivazione; questo dimostra una forte affinità di Tat per B232. Un altro studio ha stabilito un complesso stabile Rev/B23 in assenza di mRNA contenenti RRE. In presenza di mRNA RRE, Rev dissocia da B23 e si lega preferibilmente all'HIV RRE, portando allo spostamento di B2322. Non è noto dove, a livello subnucleare, si verificano la trasattivazione tat e il processo di scambio rev di B23 per l'HIV mRNA. Entrambe le proteine sono postulate per entrare contemporaneamente nel nucleolo attraverso l'interazione B23. Si prevede il coinvolgimento di altre proteine cellulari ospiti nella via nucleolare dell'HIV. I metodi descritti in questa indagine proteomica aiuteranno a chiarire l'interazione del nucleolo con i fattori cellulari ospiti coinvolti durante la patogenesi HIV-1.

L'indagine proteomica è stata avviata attraverso l'espressione delle mutazioni a punto singolo del Rev NoLS (M4, M5 e M6) e delle sostituzioni multiple di arginine (M2 e M9) per la produzione HIV-1hXB2. In questo modello, una linea cellulare HeLa che esprime stabilmente HIV-1HXB2 (HLfB) carente di Rev viene trasinata da mutazioni nucleolari WT Rev e Rev contenenti un tag flag alla fine del 3'. La presenza di WT Rev permetterà la replicazione virale nella cultura HLfB, rispetto alle mutazioni Rev-NoLS che non salvano la carenza di Rev (M2 e M9), o consentirà la replicazione virale, ma non in modo efficiente come WT Rev (M4, M5 e M6)1. Il lisato cellulare viene raccolto 48 h più tardi dopo la proliferazione virale in presenza di espressione Rev e sottoposto a immunoprecipitazioni con un buffer di lissi è ottimizzato per l'interazione Rev/B23. Viene descritta l'ottimizzazione del buffer di lisi utilizzando concentrazioni di sale variabili e i metodi di eluizione delle proteine per HIV-1 Rev vengono confrontati e analizzati in gel SDS-PAGE macchiati d'argento o macchiati di Coomassie. Il primo approccio proteomico prevede l'analisi diretta di un campione eluito da Espressi WT Rev, M2, M6, e M9 da spettrometria di massa tandem. Un secondo approccio con il quale gli eluati di WT Rev, M4, M5 e M6 sono stati sottoposti a un processo di estrazione gel viene confrontato con il primo approccio. Viene analizzata l'affinità peptide alle mutazioni Rev-NoLS rispetto a WT Rev e viene visualizzata la probabilità di identificazione delle proteine. Questi approcci rivelano potenziali fattori (nucleolari e nonnucleolari) che partecipano al trasporto e giunzione di mRNA HIV-1 con Rev durante la replicazione dell'HIV-1. Nel complesso, le condizioni di lisi cellulare, IP, e di eluizione descritte sono applicabili alle proteine virali di interesse per la comprensione dei fattori cellulari ospiti che attivano e regolano le vie infettive. Questo è applicabile anche allo studio dei fattori dell'ospite cellulare necessari per la persistenza di vari modelli di malattia. In questo modello proteomico, HIV-1 Rev IP è ottimizzato per l'interazione B23 per chiarire i fattori nucleolari coinvolti nell'attività di shuttling nucleocitoplasmatica e nell'attacco mRNA HIV-1. Inoltre, possono essere sviluppate linee cellulari che esprimano stabilmente modelli di malattie infettive che sono carenti per le proteine chiave di interesse, simile alla linea cellulare HLfB, per studiare le vie infettive di interesse.

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Protocollo

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1. Cultura cellulare

  1. Mantenere l'HLfB nel mezzo modificato di Dulbecco Eagle's Aquila (DMEM) integrato con 10% di siero bovino fetale (FBS), 2 mM L-glutamine e pirvate di sodio da 1 mM all'interno di piastre da 100 mm trattate con coltura tissutale. Mantenere le colture cellulari a 37 gradi centigradi in un'incubatrice umidificata fornita con 5% di CO2. Passare le cellule confluenti a una densità di cellule di 1 x 106 cellule / mL.
  2. Eliminare i supporti di coltura cellulare. Sciacquare delicatamente le cellule con 10 mL di 1x di salina con buffer fosfato (PBS). Rimuovere ed eliminare il 1x PBS senza interrompere il livello della cella.
  3. Aggiungere 2 mL di 1x soluzione trypsin-EDTA alle cellule. Sbottare il piatto per rivestire il monostrato e incubare a 37 gradi centigradi all'interno di una camera umidizzata per 5 min.
  4. Toccare saldamente il lato del piatto con il palmo della mano per staccare le cellule. Risospendere le cellule staccate in 8 mL di supporti di coltura freschi. Girare le cellule a 400 x g per 5 min.
  5. Eliminare i mezzi di coltura senza interrompere il pellet cellulare. Risospendere il pellet cellulare in 10 mL di supporti di coltura freschi. Sottocultura 1 mL di cellule concentrate con 9 mL di supporti di coltura freschi all'interno di piastre da 100 mm trattate con coltura tissutale.
    NOTA: per ogni mutazione Rev-NoLS, le piastre di coltura HLfB o HeLa da 3x 100 mm producono un numero sufficiente di proteine listi per l'analisi delle macchie occidentali e la spettrometria di massa. Aggiungere piastre aggiuntive per un controllo positivo WT Rev e un controllo negativo. Il volume delle cellule delle impostazioni secondarie richiederà l'ottimizzazione con l'uso di diversi tipi di cellule.

2. Espressione delle mutazioni di Rev-NoLS-3'flag durante la replicazione dell'HIV-1

  1. Aumentare la coltura delle cellule HLfB a una densità di cellule di 2 x 106 cellule/mL. Preparare 4 mL di sospensione del fosfato di calcio per ogni piastra di 100 mm come segue.
    1. Etichettare due tubi da 15 mL come 1 e 2. Aggiungere 2 mL di 2x HBS (0,05 M HEPES, 0,28 M NaCl e 1,5 mM Na2HPO4 [pH 7.12]) al tubo 1. Aggiungere TE 79/10 (1 mM Tris-HCl e 0,1 mM EDTA [pH 7.9]) al tubo 2. Il volume di TE 79/10 è 1.760 mL - il volume del DNA.
    2. Aggiungere 20 g di plasmide contenente la mutazione di interesse Rev-NoLs-3'flag al tubo 2 e mescolarne il contenuto attraverso la sospensione. Aggiungere 240 luna di 2 M CaCl2 al tubo 2 e mescolare di nuovo attraverso la sospensione.
    3. Trasferire la miscela di tubo 2 al tubo 1 dropwise, mescolando delicatamente. Lasciare che la sospensione si sieda a temperatura ambiente per 30 min.
  2. Aggiungere 1 mL di sospensione dropwise a ciascuna delle colture a 3 celle, piastre da 100 mm mentre girano delicatamente il supporto. Riportare le piastre all'incubatrice e lasciare la miscela di trasfezione per 6 h. Sostituire la miscela di trasfezione con 10 mL di supporti di coltura freschi e incubare le cellule per 42 h.

3. Raccolta di lisato proteico virale

  1. Eliminare il supporto cellulare 48 h posttrafezione. Mettere ogni piastra da 100 mm su un letto di ghiaccio. Etichettare i tubi da 15 mL per ogni campione di mutazione Rev-NoLS e posizionare i tubi sul ghiaccio.
  2. Sciacquare delicatamente le cellule con 10 mL di 1x PBS prefreddo senza interrompere lo strato cellulare. Eliminare il 1x PBS. Aggiungere 3 mL di buffer di lisi (50 mM Tris-HCl [pH 8.0], 137 mM NaCl e 1% di detersivo X-100 [vedi la Tabella dei Materiali]), trattato con cocktail inibitore della proteasi, a ciascuna delle piastre da 100 mm.
  3. Utilizzare un raschietto di celle per interrompere il livello della cella. Inclinare la piastra e raschiare delicatamente e raccogliere le cellule in una piscina. Raccogliere il lisato cellulare utilizzando una micropipetta 1.000 L e mescolare i lisati delle cellule da ciascuna delle tre piastre da 100 mm nel tubo preetichettato da 15 mL.
  4. Incubare il lisato cellulare sul ghiaccio per 15 min, vortice ogni 5 min. Centrifugare il lisato cellulare a 15.000 x g per 5 min.
  5. Raccogliere il supernatante proteico senza interrompere il pellet di detriti cellulari e trasferirlo in un altro tubo sterile da 15 mL. Ottenere la concentrazione di lisato proteico virale utilizzando il metodo Bradford (vedi sezione 4).
  6. Salvare un'aliquota del campione di input (20 g) per l'analisi dell'immunoblot occidentale. Aggiungere 2x buffer campione (20% glicerolo, 0.02% blu bromofenolo, 125 mM Tris-Cl [pH 6,8], 5% SDS e 10% 2-mercaptoetanolo) al volume finale. Far bollire a 95 gradi centigradi per 10 min, e conservare il campione di ingresso a -20 gradi centigradi.

4. Il saggio DiBradford

NOTA: Preparare l'albumina del siero bovino 10x (BSA) da 100x stock BSA prima di generare curve standard proteiche.

  1. Acqua in tubi di microcentrismo per i seguenti vuoti e standard: Vuoto : 800 l; Standard 1 : 2 mg/mL, 798 l; Standard 2 - 4 mg/mL, 796 l; Standard 3 - 6 mg/mL, 794 l; Standard 4 - 8 mg/mL, 792 l; Standard 5 - 10 mg/mL, 790 - L. Aliquota 10x BSA nei seguenti standard designati: Standard 1 - 2 -L; Standard 2 - 4 l; Standard 3 : 6 L; Standard 4 : 8 l; Standard 5 : 10 l.
  2. Preparare una miscela di campioni di proteine mescolando 795 ll di acqua con 5 campioni di proteine. Aggiungere 200 l di reagente di tintura di prova proteica (vedere la Tabella dei materiali) a ogni campione vuoto, standard e proteico. Vorticare brevemente i campioni per una miscela uniforme e incubare a temperatura ambiente (18-20 gradi centigradi) per 5 min.
  3. Trasferire i campioni vuoti, standard e proteici in cuvette. Misurare le concentrazioni proteiche a un OD di 595 nm.

5. Coimmunoprecipitazionazione della bandiera Rev-NoLS-3'

  1. Risciacquare 25 l di perline di gel di affinità M2 (si veda la Tabella dei Materiali) con 500 - L di list, trattato con cocktail inibitore della proteasi. Risciacquare più perline di gel di affinità per ogni campione di mutazione e controlli.
    NOTA: Preparare un numero sufficiente di perline di gel di affinità M2 per due gel (50 gradi centigradi) - uno per l'analisi dell'immunoblot occidentale e l'altro per la colorazione proteica e la spettrometria di massa.
  2. Girare a 820 x g per 2 min a 4 gradi centigradi. Togliete il super-acletterante. Risciacquare 2x di più.
  3. Aggiungere la proteina virale lisata (1 mg/mL in 5 mL di volume totale) alle perline di affinità M2 prerinse. Regolare il volume totale utilizzando il buffer di lisi.
  4. Incubare la reazione per 3 h, ruotando a 4 gradi centigradi. Centrifugare le perline di affinità M2/proteina virale lisa a 820 x g per 1 min.
  5. Raccogliere il supernatante e salvare un campione post-IP (20 g) per l'analisi immunoblot occidentale. Misurare la concentrazione proteica del lisato post-IP. Raccogliere 20 g per l'immunoblotting occidentale.
  6. Aggiungere il buffer di esempio 2x al volume finale. Far bollire a 95 gradi centigradi per 10 min, e conservare il campione post-IP a -20 gradi centigradi.
  7. Sciacquare le perle M2 con 750 gradi l- di lisi tampone e lavare le perline su un rotatore a 4 gradi centigradi per 5 min. Centrifugare le perline M2 a 820 x g e scartare il supernatante.
  8. Ripetere i passaggi 5.7 per altri due fumi su un rotatore a 4 gradi centigradi per 5 min. Dopo il terzo lavaggio, rimuovere eventuali tracce di tampone di lisi dal complesso M2 perline/co-IP utilizzando una lunga punta di caricamento gel.
    NOTA: Pizzicare l'estremità della punta di caricamento gel con pinzette piatte prima di rimuovere eventuali tracce del buffer di lisi. Ciò impedirà l'interruzione e l'assorbimento delle perline M2.
  9. Risospendere le perline M2 in 55 - L di 2 x buffer di carico. Far bollire il campione a 95 gradi centigradi per 10 min.
  10. Caricare 25 l di eluate su due gel SDS-PAGE separati (uno per immunoblotting occidentale e l'altro per la colorazione Coomassie).

6. Preparazione di gel SDS-PAGE

  1. Lanciare due gel di risoluzione SDS-acrilamide 15% mescolando i seguenti reagenti in un tubo da 50 mL (ad un volume finale di 40 mL, sufficiente per quattro gel): 4,16 mL di acqua ultrapura, 15 mL del 40% di acrilammide:bisacrylamide (29:1), 10 mL di 1,5 M-HCl (8,5 M-HCl). , 400 -L del 10% di SDS, 400 -L di 10% di perdino di ammonio e 40 l di TEMED.
  2. Mescolare il gel di risoluzione invertendo il tubo da 50 mL più volte. Pipette la miscela di gel di risoluzione in un apparato gel occidentale prepulato (quattro gel - tre per immunoblotting occidentale e uno per la colorazione Coomassie/argento).
  3. Delicatamente pipette abbastanza acqua per coprire lo strato superiore della miscela di gel. Lasciare che il gel di risoluzione sia polimerizzato.
  4. Versare lo strato d'acqua dal gel di risoluzione, utilizzando un delicato tergicristallo compito (vedi la tabella dei materiali) per assorbire l'acqua in eccesso.
  5. Lanciare due gel di impilamento SDS-acrilamide 5% mescolando i seguenti reagenti in un tubo da 50 mL (ad un volume finale di 20 mL, sufficienti per quattro gel): 11,88 mL di acqua ultrapura, 2,5 mL del 40% di acrilammide:bisacrilamide (29:1), 5,2 mL di 1,5 M Tris-HCl (pH 8,8) , 200 -L del 10% di SDS, 200 -L di 10% di perdino di ammonio e 20 L di TEMED.
  6. Mescolare il gel di impilamento invertendo il tubo da 50 mL più volte. Pipette la miscela di gel impilamento sopra il gel di risoluzione alla parte superiore dell'apparato.
  7. Inserire un pettine a cassetta di gel contenente il numero appropriato di corsie nel gel di impilamento. Assorbire qualsiasi overflow della miscela di gel utilizzando un tergicristallo compito delicato (vedere la Tabella dei Materiali). Lasciare che il gel di impilamento sia completamente polimerizzato.
  8. Inondare l'apparato gel occidentale con 1x tampone da corsa occidentale (5x concentrazione: 250 mM Tris-Cl [pH 8.3], 1,92 M glicina, 0.5% SDS e 10 mM EDTA).
  9. Estrarre delicatamente il pettine della cassetta del gel dal gel di impilamento. Lasciare che il buffer di corsa occidentale 1x riempia i pozzi di carico. Lavare ogni pozzo con 1x buffer in esecuzione occidentale utilizzando una siringa prima di caricare i campioni.
  10. Caricare i campioni di immunoblot occidentali in ogni gel corrispondente (campioni di ingresso, campioni coimmunoprecipitati e campioni post-IP). Caricare i marcatori proteici gel occidentali.
  11. Caricare i campioni coimmunoprecipitati per la colorazione Coomassie/argento in un altro gel. Caricare i marcatori proteici gel occidentali.
  12. Collegare l'apparato gel in esecuzione a una fonte di alimentazione ed eseguire i gel a 100 V fino a quando il colorante di carico raggiunge il gel di risoluzione. Aumentare la tensione a 140 V fino a quando il colorante di carico raggiunge il fondo del gel di risoluzione.

7. Trasferimento macchia occidentale

  1. Smontare l'apparato gel occidentale. Affettare e scartare il gel di impilamento, lasciando intatto il gel di risoluzione.
  2. Trasferire delicatamente i gel di risoluzione in un vassoio pulito riempito con tampone di trasferimento occidentale (25 mM Tris, 194 mM glicine, 0.005% SDS, 20% metanolo) e immergerli per 15 min.
  3. Assemblare l'apparato di trasferimento del gel come segue.
    1. Tagliare tre membrane di trasferimento PVDF e sei pezzi di carta da filtro (vedere la tabella dei materiali) alle dimensioni del gel di risoluzione.
    2. Immergere la membrana PVDF in metanolo per 5 min. Idrataino in acqua per 5 min.
    3. Posizionare la cassetta del supporto del gel in una teglia di vetro riempita parzialmente con tampone di trasferimento occidentale, con il lato nero sul fondo.
    4. Posizionare un cuscinetto di schiuma imbevuto di tampone di trasferimento occidentale contro il lato nero della cassetta del supporto del gel.
    5. Sormontare un pezzo di carta da filtro nel buffer di trasferimento occidentale e posizionarlo sulla parte superiore del tampone di schiuma. Posizionare il gel di risoluzione sopra la carta da filtro.
      NOTA: Posizionare il gel di risoluzione nell'orientamento di carico corretto per essere trasferito alla membrana PVDF.
    6. Posizionare una membrana di trasferimento PVDF sopra il gel di risoluzione. Sormontare un pezzo di carta da filtro con buffer di trasferimento occidentale e posizionarlo sulla parte superiore della membrana di trasferimento PVDF.
    7. Posizionare un altro cuscinetto di schiuma imbevuto di tampone di trasferimento occidentale sulla carta da filtro. Piegare con cura il lato bianco della cassetta del supporto gel sulla parte superiore del pad di schiuma imbevuta. Bloccare saldamente la cassetta.
    8. Posizionare la cassetta del supporto del gel nell'assemblaggio dell'elettrodo dell'apparato di trasferimento. Ripetere i passaggi 7.3.4-7.3.8 per ogni gel di risoluzione rimanente.
    9. Riempire il serbatoio dell'apparato di trasferimento con il buffer di trasferimento occidentale. Inserire un'asta di agitazione nel serbatoio dell'apparato.
    10. Posizionare il serbatoio dell'apparecchio sopra una piastra di mescolare. Regolare l'impostazione di agitazione a 5-6, assicurandosi che la barra di agitazione non sia bloccata o colpendo le cassette del supporto del gel.
    11. Collegare l'apparecchio di trasferimento del gel a una fonte di alimentazione e trasferire il gel a 100 V per 1 h a 4 gradi centigradi.

8. Immunoblotting

  1. Rimuovere la cassetta del supporto del gel e posizionare il lato nero contro una teglia di vetro pulito. Aprire la cassetta e scartare con cura il tampone di schiuma e filtrare la carta. Contrassegnare un angolo della membrana PVDF per identificare l'orientamento di caricamento corretto. Mantenere la membrana bagnata.
    NOTA: La membrana PVDF può essere essiccata all'aria e conservata in un contenitore pulito e sigillato. Reidratare la membrana ripetendo i passi 7.3.2.
  2. Posizionare la membrana in 100 mL di soluzione di blocco (5% latte, 1x TBS e 0,1% Tween 20). Bloccare la membrana dondolo delicato a temperatura ambiente (18-20 gradi centigradi) per 1 h.
  3. Tagliare la membrana sopra il marcatore proteico 25 kDa. Posizionare la parte superiore della membrana, contenente bande proteiche superiori a 25 kDa, in soluzione di blocco contenente B23 mouse monoclonal IgG1 (1:500 diluizione). Bloccare durante la notte, dondolando a 4 gradi centigradi.
  4. Posizionare la parte inferiore della membrana, contenente bande proteiche inferiori a 25 kDa, in soluzione di blocco contenente M2 mouse monoclonal IgG1 (1:1,000 diluizione, vedere la Tabella dei materiali). Bloccare durante la notte, dondolando a 4 gradi centigradi.
  5. Lavare la membrana 3x per 10 min in 25 mL di soluzione di lavaggio occidentale (1x TBS, 0,1% Tween 20) su una piattaforma a dondolo.
  6. Incubare le membrane in capra-anti-topo IgG1-HRP (1:5.000 diluizione) diluito in soluzione di blocco per 1 h a temperatura ambiente. Lavare la membrana 3x per 10 min in 25 mL di soluzione di lavaggio occidentale su una piattaforma di dondolo.
  7. Preparare la chemiluminescenza substrato di battesimo occidentale. Utilizzare una micropipetta p1000 per aggiungere il substrato alla membrana.
  8. Sviluppare ogni membrana nel substrato di chemiluminescenza occidentale per 5 min. Rimuovere la membrana dal substrato. Assorbire il substrato in eccesso utilizzando un tergicristallo delicato (vedere la Tabella dei Materiali).
  9. Posizionare la membrana in una protezione del foglio pulita attaccata all'interno di una cassetta. Prendere la cassetta in una stanza buia e inserire un foglio di pellicola nella cassetta. Bloccare la cassetta in posizione e incubare per 5-15 min. Rimuovere il film dalla cassetta e svilupparlo.

9. Colorazione Coomassie

  1. Smontare l'apparato gel occidentale. Affettare e scartare il gel di impilamento, lasciando intatto il gel di risoluzione. Trasferire delicatamente il gel di risoluzione in un vassoio pulito riempito con 25 mL di acqua ultrapura.
  2. Incubare il gel su una piattaforma a dondolo per 15 min. Scartare l'acqua ultrapura e ripetere la fase di lavaggio 2 volte di più.
    NOTA: Se le bolle SDS rimangono dopo le fasi di lavaggio, il gel può essere lavato in acqua ultrapura durante la notte. SDS residua può causare un'elevata colorazione di fondo del gel.
  3. Mescolare il reagente di macchie Coomassie invertendo la bottiglia (vedere la Tabella dei Materiali). Mettere 100 mL di giacco di macchie di Coomassie per coprire il gel di risoluzione e incubare il gel su una piattaforma di dondolo per 1 h. Scartare il reagente di macchie di Coomassie e lavare il gel in acqua deionizzata su una piattaforma a dondolo per 15 min.
  4. Scartare l'acqua deionizzata. Ripetere il passaggio di lavaggio 2 volte di più. Continuare a lavare il gel fino a quando non viene osservata la risoluzione desiderata delle bande proteiche.

10. Colorazione argento

  1. Smontare l'apparato gel occidentale. Affettare e scartare il gel di impilamento, lasciando intatto il gel di risoluzione. Trasferire delicatamente il gel di risoluzione in un vassoio pulito riempito con 25 mL di acqua ultrapura.
  2. Incubare il gel su una piattaforma a dondolo per 15 min. Scartare l'acqua ultrapura e ripetere la fase di lavaggio 2 volte di più.
    NOTA: Se le bolle SDS rimangono dopo le fasi di lavaggio, il gel può essere lavato in acqua ultrapura durante la notte. SDS residua può causare un'elevata colorazione di fondo del gel.
  3. Fissare il gel in 30% di etanolo:10% soluzione di acido acetico (6:3:1 acqua:etanolo:acido acetico) durante la notte a temperatura ambiente. Lavare il gel in una soluzione di etanolo al 10% per 5 min a temperatura ambiente. Sostituire la soluzione di etanolo e lavare per altri 5 min.
  4. Preparare la soluzione di lavoro del sensitista del kit di macchie d'argento Pierce Silver mescolando un'una parte di sensibilizzazione con 500 parti di acqua ultrapura (50 l l di sensibilità con 25 mL di acqua ultrapura). Incubare il gel di risoluzione nella soluzione di lavoro sensibile per 1 min. Lavare il gel in acqua ultrapura per 1 min, sostituire l'acqua e lavare nuovamente il gel per 1 min.
  5. Preparare la soluzione di lavoro delle macchie mescolando un esaltatore di macchie d'argento in una parte con 50 parti di colorazione d'argento (500 l di esaltatore con 25 mL di macchia d'argento). Incubare il gel in soluzione di lavoro macchia per 30 min.
  6. Preparare la soluzione di lavoro dello sviluppatore mescolando 1 parte di esaltatore di macchie d'argento con 50 parti di sviluppo macchia d'argento (500 l di potenziatore con 25 mL di sviluppatore). Preparare la soluzione del 5% dell'acido acetico come soluzione di arresto. Lavare il gel con acqua ultrapura per 1 min, sostituire l'acqua e lavare il gel per un ulteriore 1 min.
  7. Sostituire l'acqua con la soluzione di lavoro dello sviluppatore e incubare fino a quando l'intensità della banda proteica desiderata è risolta (5 min). Sostituire la soluzione di lavoro dello sviluppatore con la soluzione di arresto e incubare per 10 min.

11. Riduzione in gel, alchilazione e digestione delle bande gel macchiate di Coomassie

  1. Tagliare le bande gel dal gel con una lama di rasoio pulita. Tagliare ogni banda di gel a cubetti di circa 5 mm e metterli in un tubo di microcentrifuga pulito da 0,5 ml.
  2. Destain i pezzi di gel coprendoli con bicarbonato di ammonio da 100 mm in 1:1 acetonitrile:acqua a temperatura ambiente per 15 min. Scartare il sovrinnava. Ripetere questo passaggio.
  3. Asciugare i pezzi di gel per 5 min in una centrifuga sottovuoto. Ridurre le proteine coprendo i pezzi di gel essiccati con 10 mM dithiothreitol in bicarbonato di ammonio da 100 mM e incubandoli per 1 h a 56 gradi centigradi.
  4. Pipette fuori qualsiasi supernatante. Alkylate le proteine coprendo i pezzi di gel con 100 mM di iodoacetamide in acqua e incubandole per 1 h a temperatura ambiente al buio.
  5. Pipette fuori il supernatante e ridurre i pezzi di gel coprendoli con acetonitrile e scuotendoli delicatamente a temperatura ambiente per 15 min. Pipette fuori dal supernatante e reswell i pezzi di gel coprendoli con 100 mM di bicarbonato di ammonio e scuotendoli delicatamente a temperatura ambiente per 15 min.
  6. Ripetere il passaggio 11.5. Asciugare i pezzi di gel per 5 min in una centrifuga sottovuoto.
  7. Coprire i pezzi di gel con una trypsin a 50 ng/SL di grado di sequenziamento modificata (vedi la Tabella dei Materiali) in bicarbonato di ammonio da 100 mM. Lasciare gonfiare il gel per 5 min; poi, pipette fuori qualsiasi soluzione rimanente. Coprire i pezzi di gel con bicarbonato di ammonio da 100 mm e consentire loro di risfare completamente, aggiungendo ulteriori 100 mM di bicarbonato di ammonio in modo che i pezzi di gel siano completamente coperti.
  8. Incubare i pezzi di gel durante la notte a 37 gradi centigradi. Interrompere la reazione aggiungendo 1/10 del volume del 10% di acido formica in acqua. Raccogliere il supernatante da ogni tubo.
  9. Estrarre i pezzi di gel coprendoli con l'1% di acido formico nel 60% acetonitrile e incubandoli per 15 min con agitazione delicata.
  10. Ridurre il volume dei supernatanti combinati a meno di 20 anni in una centrifuga sottovuoto, facendo attenzione a evitare di asciugare completamente i supernatanti. Aggiungere l'1% di acido formica per riportare il volume totale a 20.

12. cromatografia liquida/spettrometria di massa

NOTA: i campioni sono stati analizzati utilizzando uno spettrometro di massa dotato di ultra HPLC, una sorgente di nanospray e una colonna (vedere la Tabella dei materiali). I solventi A e B sono rispettivamente dello 0,1% dell'acido formionello nell'acqua e nell'acetonitrile.

  1. Caricare le proteine digerite in fiale autocampionate in polipropilene ad alto recupero. Caricare le fiale nel gestore campione di un sistema UPLC.
  2. Iniettare 6 l di ogni campione. Caricare ogni campione sulla colonna di intrappolamento del nanotile per 1,5 min a 8 l/min, utilizzando il 99% solvente A/1% solvente B.
  3. Eluire i peptidi nello spettrometro di massa con un gradiente lineare dal 3% al 35% del solvente B superiore a 30 min, seguito da un gradiente dal 35% al 50% del solvente B superiore a 4 min e dal 50% al 90% del solvente B su 1 min. Mantenere il 90% di acetonitonile per 3 min; quindi ridurre il %B di nuovo al 3% oltre 5 min.
  4. Acquisire dati di specifiche di massa profilo ioio positivo in modalità risoluzione (risoluzione 20.000). Acquisire dati da 100 a 2.000 Da ad una velocità di una scansione ogni 0,6 s. Acquisire dati in modalità MSE alternando scansioni senza energia di collisione e scansioni con energia di collisione elevata.
  5. Per l'energia di collisione elevata, aumentare l'energia di collisione nella cella Trappola da 15 V a 40 V. Acquisire una scansione di massa di blocco ogni 30 s, utilizzando lo ione da 2 dollari di [Glu1]-Fibrinopeptide B come massa di blocco. Acquisire un file di dati utilizzando un'iniezione vuota di solvente A, utilizzando lo stesso metodo di acquisizione tra ogni coppia di campioni per controllare il riporto.

13. Analisi dei dati per la spettrometria di massa

  1. Copiare i file dei risultati della spettrometria di massa nel computer che esegue una piattaforma di ricerca proteomica quantitativa e qualitativa (ad esempio, ProteinLynx Global Server). L'analisi dei dati richiede un utilizzo intensivo della CPU e deve essere eseguita in un computer di analisi dei dati separato e ad alte prestazioni.
  2. Creare un nuovo progetto per i dati. Creare una nuova piastra microtitera che rappresenta la piastra autocampionatore. Assegnare i campioni nella stessa posizione nella piastra del microtitero della loro posizione nell'autocampionatore.
  3. Assegnare ogni parametro di elaborazione campione. I parametri da utilizzare sono la larghezza del picco cromatico automatico e la risoluzione MSTOF; soglia a bassa energia, 100 conteggi; soglia di energia elevata, 5 conteggi; soglia di intensità, 500 conteggi.
  4. Assegnare ogni campione di parametri del flusso di lavoro. I parametri da utilizzare sono database, swissProt umani concatenati e HIV, con sequenze invertite; tolleranza automatica di peptidi e frammenti; min frammento ios) corrisponde al peptide, 3; corrispondenze di ioni min per proteina, 7; corrispondenze di peptidi min per proteina, 1; reagente di digerire primario, trypsin; scissione mancate, 1; reagenti modificatori fissi, carbamidomethyl C; reagenti modificatori di variabile, ossidazione M; tasso di scoperta falso, 100.
  5. Selezionare gli esempi e scegliere Elabora dati non elaborati più recenti. Al termine della ricerca, selezionare gli esempi e scegliere Esporta dati in scaffold (versione 3). Aprire Scaffold, creare un nuovo file e importare ogni file esportato dalla piattaforma proteomica come nuovo biocampione utilizzando la quantitazione iografica precursore.
  6. Una volta importati tutti i file, passare alla schermata Carica e analizza dati. Selezionare lo stesso database utilizzato per i dati di ricerca e importazione utilizzando il punteggio LFDR e il raggruppamento di proteine standard a livello di esperimento. Impostare le opzioni di visualizzazione su Probabilità di identificazione delleproteine, la soglia della proteina al 20%, il numero minimo di peptidi su 1 e la soglia del peptide allo 0% durante l'analisi.

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Risultati

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Le mutazioni di arginina monopunto e multipunto Rev-NoLS, corrispondenti a una varietà di modelli di localizzazione subcellulare, sono state esaminate nellaloro capacità di interagire con i fattori dell'host cellulare rispetto a WT Rev. vettore sono stati espressi nella cultura HLfB. I complessi proteici sono stati elaborati dal lisa totale delle cellule e macchiati con reagente di macchie d'argento. Rev-NoLS-3'flag è rilevabile (circa 18 kDa) in tre diverse condizioni del buffer di lisi contenenti varie concent...

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Discussione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sono state valutate le analisi spettrometriche di massa che confrontano le mutazioni Rev-NoLS e WT Rev in presenza di HIV-1 per comprendere i fattori nucleolari coinvolti nel ciclo di replicazione virale. Ciò identificherebbe i componenti nucleolari necessari per l'infettività virale. Nucleolar B23 ha un'alta affinità con Rev-NoLS e funziona nella localizzazione nucleolare del Rev3 e del trasporto nucleocitoplasmatico di mRNA HIV legati al Rev222. L'affinità di B23 con muta...

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

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Gli autori riconoscono Dr. Barbara K. Felber e Dr. George N. Pavlakis per la cultura aderente HLfB fornito dal National Institutes of Health (NIH) AIDS Research and Reference Reagent Program, Division of AIDS, National Institute of Allergy and Infectious Infectious Malattie (NIAID), NIH. Gli autori riconoscono anche le fonti finanziarie fornite dal NIH, Grants AI042552 e AI029329.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Acido aceticoFisher ChemicalA38S-212
AcetonitrileFisher ChemicalA955-500
Acrilammide: BisacrilammideBioRad1610158
Bicarbonato di ammonioFisher ChemicalA643-500
Persolfato di ammonioSigma-Aldrich7727-54-0
ANTI-Flag Affinità M2 gelSigma-AldrichA2220
anti-Flag M2 topo monoclonale IgGSigma-AldrichF3165
BioMax MS filmCarestream8294985
Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate, 450 mLBio-Rad5000006
B23 topo monoclonale IgGSanta Cruz Biotechnologiessc-47725
Bromofenolo bluSigma-AldrichB0126
Garofano latte in polvere scrematoNestléN/A
Raschietto cellulareThermoFisher Scientific179693PK
C18IonKey nanoTile colonnaWaters186003763
Corning Piastre di coltura trattate con TC da 100 mmFisher Scientific08-772-22
DitiotreitoloThermo ScientificJ1539714
1 x DPBSCorning21-030-CVRS
ECL Substrato di tamponamento EsternPierce32106
Etanolo, 200 proofFisher ChemicalA409-4
FBSGibco16000044
Acido formicoFisher ChemicalA117-50
Reagente colorante blu GelCodeThermoFisher24590
GliceroloFisher Chemical56-81-5
capra-anti-topo IgG-HRPSanta Cruz Biotechnologiessc-2005
IodoacetamideACROS Organics122270050
KimWipe tergicristallo per attività delicateKimberly Clark Professional34120
L-glutamminaGibco
MetanoloFisher Chemical67-56-1
NanoAcuity UPLCWatersN/A
Pierce Silver Stain KitThermo Scientific24600df
15-mL Tubo conicoin polipropilene Falcon352097
Scala per proteine prestate, da 10 a 180 kDaThermo Scientific26616
Cocktail di inibitori della proteasiRoche4693132001
Purificato BSANew England BiolabsB9001
PVDF  Membrana Western blottingRoche3010040001
Sodium PyruvatoGibco11360070
10 x TBSFisher BioreagentsBP2471500
TEMEDBioRad1610880edu
Triton X-100 soluzione detergenteBioRad1610407
Fonte trizaicaAcqueN/A
tripsina-EDTACorning25-051-CIS
Tween 20BioRad1706531
Spettrometro di massa Synapt G2WatersN/A Carta
da filtro WhatmanTisch Scientific10427813
25030081

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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