Visualizzazione della struttura dei linfonodi e della localizzazione cellulare mediante la microscopia confocale Ex-Vivo

Summary

Questo protocollo descrive una tecnica per l'immagine di diverse popolazioni cellulari nel drenaggio dei linfonodi senza alterazioni nella struttura dell'organo.

Abstract

I linfonodi (LN) sono organi sparsi all'interno del corpo, dove le risposte immunitarie innate possono connettersi con l'immunità adattiva. Infatti, le LN sono strategicamente interposte nel percorso dei vasi linfatici, permettendo il contatto intimo degli antigeni tissutali con tutte le cellule immunitarie residenti nella LN. Pertanto, la comprensione della composizione cellulare, della distribuzione, della posizione e dell'interazione utilizzando l'imaging LN intero ex vivo aggiungerà alla conoscenza di come il corpo coordina le risposte immunitarie locali e sistemiche. Questo protocollo mostra una strategia di imaging ex vivo a seguito di una somministrazione in vivo di anticorpi con etichetta fluorescente che consente una metodologia molto riproducibile e facile da eseguire utilizzando microscopi confocali convenzionali e reagenti di magazzino. Attraverso l'iniezione sottocutanea di anticorpi, è possibile etichettare diverse popolazioni di cellule in LN drenanti senza influenzare le strutture tissutali che possono essere potenzialmente danneggiate da una tecnica di microscopia immunofluorescenza convenzionale.

Introduction

I linfonodi (LN) sono organi a forma di ovoide ampiamente presenti in tutto il corpo con la funzione cruciale di colmare le risposte immunitarie innate e adattative. Gli LN filtrano la linfa per identificare le particelle estranee e le cellule cancerose per montare una risposta immunitaria contro di loro¹. Antigeni che presentano cellule (APC), cellule T e cellule B lavorano insieme per generare anticorpi specifici dell'antigene (immunità umoristica) e linfociti citotossici (immunità cellulare) per eliminare le particelle estranee e le cellule cancerose². Pertanto, la comprensione della dinamica delle cellule immunitarie....

Protocol

Il protocollo è stato approvato dal Comitato permanente sugli animali della Harvard Medical School e Brigham and Women's Hospital, protocollo 2016N000230.

1. Topi usati per l'esperimento

1. Utilizzare 8-settimana vecchi topi maschi e femmine sullo sfondo B6 per somministrare il mix di anticorpi.
2. Utilizzare i mouse CX3CR1^GFP/WTCCR2^RFP/WT per determinare se l'imaging LN intero ex vivo può essere applicato anche ai topi reporter senza somministrare la miscela di anticorpi, nonché per studiare la presenza di cellule mononucleari, inclusa la presentazione di antigene cellule e fagociti, e la loro distribuzi....

Results

Questo manoscritto mostra le tecniche per rimuovere i linfonodi inguinali e poplitali senza danneggiarne la struttura a seguito dell'iniezione di anticorpi fluorescenti per macchiare specifiche popolazioni cellulari in questi organi (Figura 1 e Figura 2 ).

La potente combinazione di immunoetichettatura delle cellule LN con BV421 anti-CD4 e BB515 anti-CD19 e analisi dell'imaging confocale ha definito la localizzazione delle cellule T (.......

Discussion

La combinazione di imaging con altre tecniche, tra cui la biologia molecolare e l'immunofenofotipizzazione ad alta dimensione ha migliorato la nostra capacità di studiare le cellule immunitarie nel loro contesto nativo. Infatti, mentre altri approcci possono richiedere la digestione dei tessuti e l'isolamento cellulare – che può portare alla perdita di integrità tissutale – l'uso dell'imaging in vivo o ex vivo offre un grande vantaggio nello studio di diversi sottotipi di cellule in modo geografico³

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
BV421 anti-CD4	BD Horizon	562891	GK1.5; 0,2 mg mL-1
BB515 anti-CD19	BD Horizon	564509	1D3; 0,2 mg mL-1
BB515 Rat IgG2a, κ Controllo isotipico	BD Horizon	564418	R35-95; 0,2 mg mL-1
BV421 IgG2b di topo, controllo dell'isotipo K	BD Horizon	562603	R35-38 0,2 mg mL-1
Cellview piatto di coltura	Greiner-Bio	627861	35x10 mm con fondo in vetro
Siringhe per insulina	BD Plastipak-Insulin		U-100
Kimwipes	Kimtech Science Brand	7557	dimensioni 21 x 20 cm / 100 fogli per scatola
Pinze curve per microchirurgia	Strumenti chirurgici WEP	su misura	12,5 cm
Forbici curve per microchirurgia	Strumenti chirurgici WEP	su misura	11,5 cm
Ago	BD PrecisionGlide-30		calibro & volte; ½ pollici
Nikon Eclipse Te + A1R testa confocale	Nikon	-	caricato con le 4 linee laser principali (405, 488, 543 e 647 nm)
PE anti-F4/80	BD Pharmigen	565410	T45-2342; 0,2 mg mL-1
PE Rat IgG2a, κ Controllo isotipico	BD Pharmigen	553930	R35-95; 0,2 mg mL-1
Zeiss LSM 710 Microscopio confocale	Zeiss		caricato con le 4 linee laser principali (405, 488, 543 e 647 nm)