Questo protocollo descrive una tecnica per l'immagine di diverse popolazioni cellulari nel drenaggio dei linfonodi senza alterazioni nella struttura dell'organo.
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Articolo metodologico
Visualizzazione della struttura dei linfonodi e della localizzazione cellulare mediante la microscopia confocale Ex-Vivo
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
I linfonodi (LN) sono organi sparsi all'interno del corpo, dove le risposte immunitarie innate possono connettersi con l'immunità adattiva. Infatti, le LN sono strategicamente interposte nel percorso dei vasi linfatici, permettendo il contatto intimo degli antigeni tissutali con tutte le cellule immunitarie residenti nella LN. Pertanto, la comprensione della composizione cellulare, della distribuzione, della posizione e dell'interazione utilizzando l'imaging LN intero ex vivo aggiungerà alla conoscenza di come il corpo coordina le risposte immunitarie locali e sistemiche. Questo protocollo mostra una strategia di imaging ex vivo a seguito di una somministrazione in vivo di anticorpi con etichetta fluorescente che consente una metodologia molto riproducibile e facile da eseguire utilizzando microscopi confocali convenzionali e reagenti di magazzino. Attraverso l'iniezione sottocutanea di anticorpi, è possibile etichettare diverse popolazioni di cellule in LN drenanti senza influenzare le strutture tissutali che possono essere potenzialmente danneggiate da una tecnica di microscopia immunofluorescenza convenzionale.
Introduzione
I linfonodi (LN) sono organi a forma di ovoide ampiamente presenti in tutto il corpo con la funzione cruciale di colmare le risposte immunitarie innate e adattative. Gli LN filtrano la linfa per identificare le particelle estranee e le cellule cancerose per montare una risposta immunitaria contro di loro1. Antigeni che presentano cellule (APC), cellule T e cellule B lavorano insieme per generare anticorpi specifici dell'antigene (immunità umoristica) e linfociti citotossici (immunità cellulare) per eliminare le particelle estranee e le cellule cancerose2. Pertanto, la comprensione della dinamica delle cellule immunitarie....
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Protocollo
Il protocollo è stato approvato dal Comitato permanente sugli animali della Harvard Medical School e Brigham and Women's Hospital, protocollo 2016N000230.
1. Topi usati per l'esperimento
- Utilizzare 8-settimana vecchi topi maschi e femmine sullo sfondo B6 per somministrare il mix di anticorpi.
- Utilizzare i mouse CX3CR1GFP/WTCCR2RFP/WT per determinare se l'imaging LN intero ex vivo può essere applicato anche ai topi reporter senza somministrare la miscela di anticorpi, nonché per studiare la presenza di cellule mononucleari, inclusa la presentazione di antigene cellule e fagociti, e la loro distribuzi....
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Risultati
Questo manoscritto mostra le tecniche per rimuovere i linfonodi inguinali e poplitali senza danneggiarne la struttura a seguito dell'iniezione di anticorpi fluorescenti per macchiare specifiche popolazioni cellulari in questi organi (Figura 1 e Figura 2 ).
La potente combinazione di immunoetichettatura delle cellule LN con BV421 anti-CD4 e BB515 anti-CD19 e analisi dell'imaging confocale ha definito la localizzazione delle cellule T (.......
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Discussione
La combinazione di imaging con altre tecniche, tra cui la biologia molecolare e l'immunofenofotipizzazione ad alta dimensione ha migliorato la nostra capacità di studiare le cellule immunitarie nel loro contesto nativo. Infatti, mentre altri approcci possono richiedere la digestione dei tessuti e l'isolamento cellulare – che può portare alla perdita di integrità tissutale – l'uso dell'imaging in vivo o ex vivo offre un grande vantaggio nello studio di diversi sottotipi di cellule in modo geografico3
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato dal NIH (R01 AI43458 a H.L.W.).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| BV421 anti-CD4 | BD Horizon | 562891 | GK1.5; 0,2 mg mL-1 |
| BB515 anti-CD19 | BD Horizon | 564509 | 1D3; 0,2 mg mL-1 |
| BB515 Rat IgG2a, κ Controllo isotipico | BD Horizon | 564418 | R35-95; 0,2 mg mL-1 |
| BV421 IgG2b di topo, controllo dell'isotipo K | BD Horizon | 562603 | R35-38 0,2 mg mL-1 |
| Cellview piatto di coltura | Greiner-Bio | 627861 | 35x10 mm con fondo in vetro |
| Siringhe per insulina | BD Plastipak-Insulin | U-100 | |
| Kimwipes | Kimtech Science Brand | 7557 | dimensioni 21 x 20 cm / 100 fogli per scatola |
| Pinze curve per microchirurgia | Strumenti chirurgici WEP | su misura | 12,5 cm |
| Forbici curve per microchirurgia | Strumenti chirurgici WEP | su misura | 11,5 cm |
| Ago | BD PrecisionGlide-30 | calibro & volte; ½ pollici | |
| Nikon Eclipse Te + A1R testa confocale | Nikon | - | caricato con le 4 linee laser principali (405, 488, 543 e 647 nm) |
| PE anti-F4/80 | BD Pharmigen | 565410 | T45-2342; 0,2 mg mL-1 |
| PE Rat IgG2a, κ Controllo isotipico | BD Pharmigen | 553930 | R35-95; 0,2 mg mL-1 |
| Zeiss LSM 710 Microscopio confocale | Zeiss | caricato con le 4 linee laser principali (405, 488, 543 e 647 nm) |
Riferimenti
- Willard-Mack, C. L. Normal structure, function, and histology of lymph nodes. Toxicologic Pathology. 34, 409-424 (2006).
- Tas, J. M., et al. Visualizing antibody affinity maturation in germinal centers. Science. 351, 1048-1054 (2016).
- David, B. A....
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Ristampe e permessi
