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Articolo metodologico

Un modello di cancro endometriale ortotopico con retroperitoneale Lmphadenopatia fatta da cellule VX2 in vivo propagate e coltivate

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DOI:

10.3791/59340

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12 settembre 2019

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1Institute of Medical Science, University of Toronto, 2Department of Obstetrics and Gynecology, University of Toronto, 3Guided Therapeutics Laboratory, TECHNA Institute, University Health Network, 4Department of Pathology, Princess Margaret Cancer Center, University Health Network, 5Department of Medical Biophysics, University of Toronto, 6Princess Margaret Cancer Center, University Health Network, 7Techna Institute, University Health Network, 8Department of Surgery, University of Toronto, 9Department of Otolaryngology, Head and Neck Surgery, University of Toronto, 10Division of Gynecologic Oncology, University of Toronto /Princess Margaret Cancer Center, University Health Network, 11Princess Margaret Cancer Center, University Health Network

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo presenta un metodo standardizzato per far crescere le cellule VX2 in coltura e per creare un modello ortotopico VX2 di cancro endometriale con metastasi di linfonodi retroperitoneali nei conigli. I modelli di cancro endometriali ortotopici sono importanti per lo studio preclinico di nuove modalità di imaging per la diagnosi delle metastasi dei linfonodi.

Abstract

Il cancro dell'endometrio è la malignità ginecologica più comune in Nord America e l'incidenza è in aumento in tutto il mondo. Il trattamento consiste in un intervento chirurgico con o senza terapia adiuvante a seconda del coinvolgimento del linfonodo determinato dalla linfadenectomia. La linfodenectomia è una procedura morbosa, che non è stata dimostrata avere un beneficio terapeutico in molti pazienti, e quindi è necessario un nuovo metodo per diagnosticare le metastasi dei linfonodi. Per testare nuovi agenti di imaging, è necessario un modello affidabile di cancro endometriale con metastasi di linfonodi retroperitoneali. Il modello di cancro endometriale VX2 è stato descritto frequentemente nella letteratura; tuttavia, esiste una variazione significativa rispetto al metodo di stabilimento del modello. Inoltre, non sono stati riportati studi sull'uso di cellule VX2 coltivate per creare questo modello in quanto solo le cellule propagate in vivo sono state utilizzate in precedenza. Qui, vi presentiamo un metodo chirurgico standardizzato e un metodo di monitoraggio post-operatorio per la creazione del modello di cancro endometriale VX2 e riferiamo sul primo utilizzo di cellule VX2 coltivate per creare questo modello.

Introduzione

Il cancro dell'endometrio, o cancro del rivestimento dell'utero, è la seconda malignità ginecologica più comune al mondo e la malignità più comune nelle nazioni sviluppate1. L'incidenza del cancro endometriale è aumentata costantemente, aumentando del 2,3% all'anno tra il 2005 e il 2013 con un corrispondente aumento del 2,2% della mortalità1,2,3. La diagnosi delle metastasi dei linfonodi è fondamentale in quanto la presenza di linfonodi positivi è un forte predittore negativo di sopravvivenza4,5,6,7 e può guidare la somministrazione di terapia adiuvante8,9,10,11,12,13. Le metastasi dei linfonodi sono attualmente diagnosticate rimuovendo chirurgicamente il tessuto linfatico sovrastante i principali vasi sanguigni del bacino e dell'addome. Questa procedura, nota come linfodenectomia, è controversa a causa di dati di sopravvivenza contrastanti da due grandi prove14,15,16,17,18 e il noto rischio di15,19,20 e morbilità post-operatoria21,22,23. Poiché le attuali modalità di imaging non invasivo non hanno la sensibilità e la specificità necessarie per sostituire la dissezionen. 24dei linfonodi, c'è stata una spinta a sviluppare nuove tecniche di imaging diagnostico. Per testare queste nuove tecniche in un ambiente preclinico, è necessario un modello affidabile di cancro endometriale con metastasi di linfonodi retroperitoneali.

Il coniglio VX2 modello tumorale è un modello ben consolidato che è stato ampiamente utilizzato per studiare più tumori dell'organo solido umano25 tra cui polmone26, testa e collo27,28, fegato29, rene30, osso31,32, cervello33, pancreas34 e utero35,36,37. Il modello VX2 è stato originariamente sviluppato nel 1940 da Kidd e Rous38 trapiantando con successo un papilloma di coniglio di cotone scoperto da Shope nel 193339. Da quel momento, il modello VX2 è stato mantenuto in vivo, richiedendo il passaggio seriale nel muscolo quadricipite dei conigli bianchi della Nuova èelanda40. Più recentemente, tuttavia, più gruppi sono cresciuti con successo cellule VX2 in vitro40,41,42 e dimostrato la tumorigeneità mantenuta della linea cellulare coltivata31, 42,43. I tumori VX2 sono istologicamente definiti come carcinomi a cellule squamose anaplastiche44 e contengono caratteristiche ghiandolari che assomigliano adenocarcinoma26. I tumori sono caratterizzati da facilità di impianto, rapida crescita e ipervascolarizzazione44,45 e metastatizza in modo affidabile, più comunemente ai linfonodi regionali e distanti45. Le somiglianze nell'anatomia vascolare e linfatica uterina46 così come il sito di crescita ortotopica assicurano che il modello metastatico del coniglio VX2 carcinoma mimi quello del cancro endometriale umano, rendendo il modello VX2 un modello affidabile per lo studio umano malattia metastatica. Inoltre, caratteristiche istologiche come la proliferazione microvascolare anormale47 , così come immunologiche48 e somiglianze genetiche49,50 tra gli esseri umani e i conigli suggeriscono che il tumore microambiente può riflettere quello del cancro dell'endometrio umano.

Più gruppi hanno riferito sull'uso di VX2 per creare un modello di cancro endometriale con metastasi retroperitoneali con un alto tasso riportato di successo36,51,52; tuttavia, esiste una variazione significativa all'interno della letteratura attuale rispetto al metodo di creazione del modello. Dosi di sospensione cellulare a partire da 4 x 105 cellule / corno uterino51 e fino a 5 x 109 cellule / corno uterino37,53 sono stati segnalati con nessun consenso standard sulla dose cellulare VX2 richiesta. Inoltre, una varietà di metodi di inoculazione sono stati segnalati tra cui l'impianto micro-chirurgico del tumore nel miometrio uterino36, iniezione di sospensione cellulare VX237,44,52 , 53 e in alcuni casi, l'aggiunta di corno uterino sutura prima dell'innoculazione52. Infine, nessun gruppo ha segnalato l'uso di cellule VX2 coltivate per creare questo modello. Pertanto, lo scopo di questo studio è quello di dimostrare un metodo standardizzato di successo di creazione del modello VX2 e di segnalare il primo utilizzo di cellule VX2 coltivate per creare un modello di cancro endometriale con metastasi retroperitoneali in un coniglio.

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Protocollo

Chiusura profonda della parete addominale: Identificare l'apice dell'incisione peritoneale e afferrare il peritoneo, il muscolo retto e la forza del tessuto della fascia. Tutti gli studi sugli animali sono stati condotti nelle strutture approvate dall'Animal Resource Center (ARC) dell'University Health Network e in conformità con i protocolli approvati per l'uso e la cura degli animali (AUP #3994/#4299). La linea cellulare VX2 è stata ottenuta dal Dr. Aken's Lab presso l'University Health Network.

1. Creazione della linea cellulare VX2 in vitro

  1. Raccogliere il tumore VX2 dal muscolo quadricep coniglio e la crescita nel fianco del topo.
    1. Scongelare i blocchi tumorali VX2 congelati (1 cm x 1 cm), macinata su una piastra di coltura utilizzando una lama del bisturi e sforzare attraverso un filtro di 70 m aggiungendo piccole quantità di Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) in sequenza per garantire che tutte le cellule siano tese per un volume finale di 1 mL.
    2. Contare le cellule e diluire con 0.9% fosfato soluzione salina tamponata ad una concentrazione di 1 x 107/ mL e mettere sul ghiaccio in un tubo sterile.
      NOTA: I blocchi tumorali sono stati ottenuti da un collaboratore di laboratorio dalla precedente propagazione dei tumori VX2 nei muscoli del quadricipite del coniglio.
    3. Anestesizzare un coniglio bianco neozelandese femmina (peso 2,5-3,5 kg) con 2-5% isoflurane inalato, rimuovere la pelliccia sovrastante il sito di iniezione e pulire il sito di iniezione con soluzione povidone-iodio. Iniettare 500 l della sospensione cellulare VX2 preparata (5 x 106 cellule/mL) nel muscolo quadricipite del coniglio. Monitorare clinicamente il coniglio per la crescita del tumore a partire dal giorno 10.
    4. Eutanasia i conigli dopo i tumori raggiungono 1-1,5 cm di diametro (misurato esternamente con pinze) utilizzando un metodo approvato dal veterinario. Confermare l'eutanasia controllando i segni vitali, tra cui la frequenza cardiaca e la frequenza respiratoria. Accisa il tumore utilizzando strumenti sterili dopo la pulizia dell'area con soluzione betadina.
    5. In un armadio di sicurezza biologica utilizzando strumenti sterili, tritare il tumore in piccoli pezzi (0,2 cm) su un piatto di coltura del tessuto di 10 cm utilizzando una lama del bisturi. Passare i frammenti tumorali attraverso un colino cellulare di 70 m utilizzando 1 mL di HBSS come descritto al punto 1.1.1. Contare le celle e diluire utilizzando la soluzione salina dello 0,9% per ottenere 7,5 x 105 celle in 200 .
    6. Anestetizza i topi gamma di fantascientino maschi NOD (peso 25 g) utilizzando il 4% di isoflurane a 1 L/min e mantieni l'anestesia utilizzando 2% isoflurane. Una volta che i topi sono anestesizzati, iniettare 200 l della soluzione dal punto 1.1.5 nel tessuto sottocutaneo del fianco del topo utilizzando un ago calibro 27.
  2. Raccolta e passaggio di cellule VX2 in vitro
    1. Monitorare la crescita dello xenotrapianto clinicamente due volte alla settimana fino a quando i tumori raggiungono 1 cm di diametro utilizzando pinze.
    2. Topi eutanasi mettendo in una camera di CO2 o eseguendo lussazione cervicale dopo l'anestesizzazione con 4% di gas isoflurane. Tumori delle accise in condizioni sterili in un armadietto di sicurezza biologica.
    3. Mito i tumori con un bisturi in pezzi da 1-2 mm in un piatto di coltura tissutale di 6 cm contenente 3 mL di Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)/Il siero bovino fetale FBS (FBS) di Dulbecco.
    4. Lasciare i frammenti tumorali indisturbati in un'incubatrice di 37 gradi centigradi con 5% di CO2 per due giorni fino a quando le cellule iniziano a crescere dai pezzi tumorali. Successivamente, controllare quotidianamente le lastre coltivate mediante microscopia leggera per la confluenza cellulare. Una volta raggiunta il 70% di confluenza, provare le cellule aggiungendo 1 mL dello 0,05% di trypsin al flacone e rimettendo indietro nell'incubatrice a 37 gradi per 5 min.
    5. Neutralizzare la trypsin a 6 mL di F12 di DMEM/Ham: mezzo FBS del 10%, raccogliere le cellule e centrifugare a 4 gradi centigradi per 5 min a 300 x g. Rimuovere il pellet supernatante e sospendi di nuovo in 3,5 mL del nuovo supporto F12 di F12/Ham del nuovo DMEM/Ham. Seme fresco 6 cm collagene I piastre rivestite con 1,6 x 106 cellule per piastra per ottenere circa 50% densità di semina cellulare.
      NOTA: la densità delle cellule del 50% si riferisce alle cellule che occupano il 50% della superficie della piastra quando sono attaccate.
    6. Passaggio anticipato: Ripetere il processo di cui sopra (provare, semina) fino a quando le cellule sono state passate 5 volte e quindi valutare la purezza della linea cellulare con PCR utilizzando un test PCR quantitativo per distinguere il DNA genomico del coniglio dal DNA genomico del topo (vedere passo 1.3.1-1.3.4).
      NOTA: Dopo 8 passaggi, le cellule possono essere propagate su piastre di coltura tissutali aderenti regolari non rivestite.
    7. Passaggio, provare e congelare le cellule in DMEM/HAM F12-30% FBS-10% DMSO ad una concentrazione di 2 x 106 per fiala. Conservare le cellule in azoto liquido fino a quando necessario per gli esperimenti.
  3. Conferma dell'origine VX2 delle cellule sopravvissute:
    1. Creare una cura standard dal DNA purificato di topi e conigli (Passaggio 1.3.2 e Passo 1.3.3). Utilizzare primer che prendono di mira sequenze specifiche della specie all'interno del secondo frame di lettura aperto dell'elemento retrotrasposon LINE-1.
      NOTA: le sequenze di primer per CRPV E6 sono: 5'- GATCCTGGACCACCAGTGe 5'-CCTGCCGGTCCCTCTCTTTAT. Sono stati utilizzati gli elementi retrotraposon line-1. Sequenze di primer per coniglio LINE-1 sono: 5'-TCAGGAAccAGAAGAAGTATGC e 5'-TTGATTTTTGAATGACCCAGTGT Primer per mouse LINE-1 sono: 5'-AATGGAAGCCAACATTCAGTGG e 5'-CCTTTTTTAccAGTATCAT
    2. Per creare una curva standard per CRPV E6, purificare il lisato delle cellule tumorali VX2 (Passaggio 1.1.1) utilizzando un kit commerciale seguendo il protocollo del produttore. Quantificare questo DNA utilizzando un saggio commerciale. Eseguire 6 diluizioni seriali da 225 pg/l a 0,925 pg/L in un buffer EDTA-TE basso. Per creare una curva standard per il DNA genomico del topo, diluire 100 g di DNA genomico di topo commerciale in un buffer EDTA-TE basso in 5 diluizioni da 125 pg/L fino a 0,0125 pg/L.
    3. Collocare 4 l.l da ogni soluzione diluita dai campioni del passaggio 1.3.2 in pozze ed eseguire i campioni in un termociclista PCR. Utilizzare i valori Cq di ogni esecuzione insieme agli importi di DNA per bene per calcolare una curva standard utilizzando le impostazioni di soglia automatica del software termociclista.
    4. Utilizzare le procedure qPCR standard per eseguire la PCR con 40 cicli di ciclismo in 2 fasi (98 e 60 gradi centigradi) su un termociclore. Stabilire i valori di soglia e impostare i valori Delta Ct su >35 per garantire che vi sia una contaminazione minima del mouse nella linea cellulare VX2 del coniglio. Il volume totale di ogni reazione era di 10 gradi, composto da 5 luna di 2x Mastermix, 1 luna di primer inversi con concentrazione finale di primer in reazione a 250 nM e 4 L di campione di DNA.
      NOTA: Vedere i riferimenti54,55 per informazioni dettagliate sull'esecuzione di PCR. Vengono stabiliti i valori di soglia e i valori Di Superficie delta vengono impostati su >35 per garantire una contaminazione minima del mouse nella linea cellulare VX2 del coniglio. Il livello consigliato di DNA VX2 per un rilevamento affidabile da parte di qPCR è 1-10 pg.

2. Coltura cellulare VX2 e creazione di sospensioni cellulari

  1. Scongelare le fiale contenenti cellule VX2 (congelate al punto 1.2.7) in un bagno d'acqua a 37 gradi centigradi per 1 minuto e trasferire le cellule in un tubo centrifuga conico con 10 mL di mezzo di coltura (1:1 DMEM/F-12 - 10% FBS e 1% Penicillina-streptomycin). Centrifuga per 8 min a 107 x g, scartare il supernatante e ri-sospendere il pellet cellulare in 9 mL di supporto.
  2. Trasferire le celle ri-sospese in una grande fiaschetta di coltura. Incubare le cellule senza agitare a 37 gradi centigradi. Controllare quotidianamente le cellule per la confluenza utilizzando la microscopia leggera e cambiare i media di coltura ogni tre giorni.
  3. Creazione di sospensione cellulare VX2 coltivata per l'iniezione
    1. Orpsinize cellule aggiungendo 3 mL di 0.25% trypsin a fiaschetta una volta che le cellule hanno raggiunto 80% confluenza. Mettere il flacone nell'incubatrice (37 gradi centigradi) per 5 min. Trasferire la soluzione in un tubo centrifuga conico e centrifugare per 8 min a 107 x g e quindi rimuovere il supernatante.
    2. Lavare i pellet cellulari 3 volte con 9 mL di fosfato tamponato salino, centrifugare e rimuovere supernatante come sopra. Contare le cellule e diluire con 0.9% fosfato soluzione salina tamponata ad una concentrazione di 4 x 107 cellule / mL e mettere in un tubo centrifuga conico sterile sul ghiaccio.
  4. Creazione di sospensione cellulare VX2 propagata in vivo per l'iniezione
    1. Scongelare i blocchi tumorali VX2 congelati (1 cm x 1 cm), macinata su una piastra di coltura utilizzando una lama del bisturi e sforzare attraverso un filtro di 70 m come nel passo 1.1.1. Aggiungere piccole quantità di HBSS in sequenza per garantire che tutte le celle siano tese per un volume finale di 1 mL. Contare le cellule e diluire con 0.9% fosfato tamponato salina ad una concentrazione di 1 x107/ mL e mettere sul ghiaccio in un tubo sterile.
      NOTA: I blocchi tumorali sono stati ottenuti da un collaboratore di laboratorio dalla precedente propagazione dei tumori VX2 nei muscoli del quadricipite del coniglio.

3. Stabilimento del modello chirurgico

  1. Istituzione di anestesia chirurgica e preparazione pre-operatoria
    1. Pre-medicate femmina bianco conigli neozelandesi (2.5-3.5 kg) 1 h prima della procedura chirurgica pianificata utilizzando iniezioni di acepromazina (1 mg/kg IM) e meloscama (0,2 mg/kg SQ). Anestesizzare un coniglio bianco neozelandese femmina (peso 2,5-3,5 kg) con 2-5% isoflurane inalato, rimuovere la pelliccia sovrastante il sito di iniezione e pulire il sito di iniezione con soluzione povidone-iodio.
    2. Intubate anestized conigli utilizzando una maschera laciloga levigo (LMA) e fissare in posizione con nastro adesivo, mantenendo l'anestesia profonda titando la dose isoflurane inalata tra il 2-5%. Monitorare regolarmente l'anestesia chirurgica durante la procedura controllando i segni vitali (frequenza respiratoria, ricarica capillare, saturazione dell'ossigeno se disponibile) e il monitoraggio dei segni che suggeriscono il dolore (movimento, ritiro da stimoli, rumori) o della luce anestesia (movimento, masticazione su tubo LMA).
      NOTA: Questo dovrebbe essere fatto da qualcuno con esperienza di monitoraggio dell'anestesia chirurgica.
    3. Posizionare un catetere orecchio-vena calibro 22 nella vena dorsale marginale. Somministrare la cefazolina (20 mg/kg) per via endovenosa 10 minuti prima dell'incisione chirurgica cutanea.
    4. Tagliare i capelli sopra il bacino e l'addome prima di posizionare il coniglio sul tavolo operatorio, quindi posizionare i conigli in posizione dorsale sul tavolo operatorio. Pulire il campo chirurgico utilizzando una preparazione chirurgica della pelle in 3 fasi (sapone betadine, soluzione di clorlessidina, soluzione betadine). Drappo il campo chirurgico con tende laparotomia dopo aver segnato il terreno la parte superiore dell'osso pubico, lasciando una zona di 5 cm x 5 cm dell'addome inferiore esposto.
  2. Creazione dell'incisione della laparotomia e identificazione delle corna uterine
    1. Indossare un berretto chirurgico e maschera facciale. Scrub mani utilizzando clorhesidina o betadina soluzione scrub chirurgico. Utilizzando una tecnica sterile, mettere su un abito sterile e guanti chirurgici sterili.
    2. Utilizzando un bisturi da 11 lame, fai un'incisione lunga 2,5 cm e un cranio del pube della simfisi attraverso la pelle e il tessuto sottocutaneo dell'addome del coniglio. Incise la fascia di retto e sezionare lateralmente i muscoli del retto per esporre il peritoneo sottostante. Inserire il peritoneo bruscamente dopo aver assicurato che il sottosuolo è libero da intestinale o altri organi addominali.
    3. Individuare le corna uterine identificando la vescica urinaria e spazzando un dito guantato in modo superiore, posteriore e lateralmente sopra l'apice della vescica.
      NOTA: Se necessario, la vescica piena può essere svuotata utilizzando la pressione digitale. Una volta individuato, porta le corna uterine attraverso l'incisione addominale a poggiare sulla parete addominale.
    4. Utilizzando una sutura traciata assorbibile 3-0, eseguire una singola legatura di sutura di ogni corno uterino di circa 1,5-2,0 cm distale alle cervice. Posizionare la sutura appena mediale alle arterie uterine, che corrono lungo l'aspetto laterale di ogni corno. Legare le suture comodamente per occludere le corna uterine disstese (Figura 1).
  3. Inoculazione Miometriale VX2
    1. Utilizzando un ago da 27 calibro, iniettare 0,5 mL della sospensione cellulare VX2 precedentemente preparata dal passaggio 2.3.2 (per il modello VX2 coltivato) o 2,4 (per il modello VX2 propagato in vivo) nel miometrio di ogni corno uterino proximal al sito di sutura (tra il sito di sutura e la cervice). Iniettare più di 1 minuto e assicurarsi che le cellule non vengano iniettate nella cavità uterina sottostante. Anestesizzare gli animali che utilizzano isoflurane inalato (2-5%) e una macchina anestetica con un circuito Bain.
    2. Applicare la pressione al sito di iniezione del miometrio per 30 s dopo l'iniezione per ridurre al minimo la perdita di cellule. Ispezionare i siti di iniezione e sutura per l'emostasi e riporre le corna uterine nell'addome.
  4. Chiusura dell'incisione chirurgica
    1. Chiusura profonda della parete addominale: Identificare l'apice dell'incisione peritoneale e afferrare il peritoneo, il muscolo retto e la forza del tessuto della fascia.
      1. Per fare questo, ancorare la sutura ad un apice dell'incisione suturando superficiale a profondo su un lato dell'incisione e profondo a superficiale dall'altro. Legare un nodo. Utilizzando la sutura attaccata, rendere i punti di corsa perpendicolari all'incisione attraverso gli strati della parete addominale lavorando passo-saggio lungo l'incisione da un lato all'altro. Legare la sutura e tagliare.
    2. Chiusura superficiale della parete addominale: Identificare l'apice dell'incisione cutanea e suturare la pelle addominale utilizzando sutura polifilatura subcuticolare 3-0 assorbenata a 3-0 sepolta. Applicare la colla chirurgica all'incisione chiusa per opporsi ai bordi della pelle.
      1. Per fare questo, ancorare la sutura ad un apice dell'incisione, suturando da profondità a superficiale su un lato dell'incisione e superficiale al profondo dall'altro. Legare un nodo. Utilizzando le suture attaccate, rendere i punti di corsa nello strato dermico paralleli all'incisione lavorando passo-saggio lungo l'incisione da un lato all'altro. Legare la sutura e tagliare.
  5. Assistenza post-operatoria
    1. Risveglio dall'anestesia: Spegnere l'isoflurane una volta che l'incisione è chiusa e lasciare che il coniglio respiro ossigeno per maschera durante il monitoraggio per i segni di risveglio (ad esempio, movimenti spontanei, apertura degli occhi e movimenti di masticazione sulle vie aeree maschera largole). Espatriare il coniglio una volta che questi segni sono noti e fornire ossigeno da maschera e una coperta calda fino a quando i conigli sono attenti e in grado di sedersi in modo indipendente.
    2. Monitoraggio post-operatorio: monitorare i conigli due volte al giorno per 4 giorni e ogni giorno per altri 10 giorni post-operatori. Per monitorare, valutare le loro condizioni generali, la loro assunzione di cibo e acqua, urina e produzione fecale, valutazione del dolore, peso, segni vitali (frequenza cardiaca, frequenza respiratoria) e il loro sito chirurgico alla ricerca di gonfiore, erithema, scarico o dehiscenza.
    3. Controllo del dolore post-operatorio: Somministrare la Melossicam quotidianamente (0,2 mg/kg SQ) per 48 h post-operatori e quindi in base alla valutazione del dolore. Somministrare immediatamente la buprenorfina post-operatoria e ogni 12 h (0,01-0,05 mg/kg SQ) per 24 ore e poi, se necessario, in base alla valutazione del dolore
    4. Gli antibiotici (enrofloxacin 5mg/kg IM) possono essere somministrati quotidianamente per sette giorni post-operatori per prevenire l'infezione della ferita come raccomandato dal veterinario. Somministrare i fluidi sottocutanei (15 mL di SQ) due volte al giorno come necessario per la disidratazione e cibi morbidi o altri integratori alimentari sono forniti ogni giorno come necessario per la perdita di peso.

4. Monitoraggio della crescita tumorale

  1. Monitoraggio clinico: Monitorare i conigli ogni 2 giorni per i segni clinici di crescita del tumore a partire dal giorno post-operatorio 14. I segni clinici di crescita del tumore possono includere diminuzione dell'assunzione orale, letargia, tenerezza addominale, massa addominale palpabile e perdita di cecotrofia.
  2. Imaging e monitoraggio invasivo
    1. Ct imaging: Il giorno post-operatorio 21-28, pre-medicare, anthetizzare e intubare i conigli come descritto in precedenza nel 3.1.1-3.1.2. Posizionare i conigli in una posizione dorsale in uno scanner TC preclinico e ottenere immagini del bacino e dell'addome dopo la somministrazione di 10 mL di agente di contrasto iohexol endovenoso.
    2. Monitoraggio chirurgico: Trasferire i conigli in sala operatoria dopo l'imaging mentre sono ancora in anestesia generale. Posizionare, preparare e drappeggiare i conigli come descritto in precedenza al punto 3.1.4 ed eseguire una ripetizione della laparotomia incisione di circa 1,5 cm attraverso l'incisione precedente. Identificare le corna uterine e guardare attentamente per il tumore. Chiudere l'incisione e fornire cure post-operatorie come descritto in precedenza nel passaggio 3.5.2-3.5.4.
    3. Uso del modello di coniglio: Se si scopre che i conigli hanno tumori al momento del monitoraggio chirurgico, utilizzare modelli di cancro endometriali del coniglio per esperimenti pianificati. Utilizzare conigli creati da cellule in vivo propagate per ulteriori esperimenti a 4 settimane di post-inoculazione e utilizzare modelli di coniglio creati da cellule VX2 coltivate a circa 5-6 settimane dopo l'inoculazione per tenere conto della crescita del tumore più lenta. Eutanasia i conigli dopo i tumori raggiungono 1-1,5 cm di diametro (misurato esternamente con pinze) utilizzando un metodo approvato dal veterinario. Confermare l'eutanasia controllando i segni vitali, tra cui la frequenza cardiaca e la frequenza respiratoria. Accisa il tumore utilizzando strumenti sterili dopo la pulizia dell'area con soluzione betadina.

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Risultati

Ventotto conigli sono stati utilizzati per la creazione del modello di cancro dell'endometriale. I conigli avevano un peso medio di 2,83 kg (2,71-3,58 kg) al momento dell'esperimento. I tumori uterini sono cresciuti con successo in 21 conigli per un tasso di successo generale del modello del 75%. Prima dell'inclusione della sutura uterina nel protocollo, il tasso di successo era del 57% rispetto all'81% dopo l'aggiunta della sutura uterina. La sutura uterina è stata aggiunta al protocollo...

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Discussione

Qui, abbiamo segnalato un metodo chirurgico standardizzato per la creazione di un modello di cancro dell'endometrio VX2 e riportato sul primo uso di cellule VX2 coltivate per creare questo modello. Il tumore prendere tasso di 75% è inferiore al 100% percentuale tasso precedentemente riportato nella letteratura35,37,53,56; tuttavia, il tasso del 90% di metastasi di linfonodi patologicamente conf...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Questo studio è stato finanziato dal Terry Fox Research Institute (PPG-1075), dal Canadian Institute of Health Research (Foundation Grant #154326), dal Canadian Cancer Society Research Institute (704718), dal Natural Sciences and Engineering Research Council del Canada, Fondazione per l'Innovazione e Principessa Margaret Cancer Foundation.

Vorrei ringraziare il Dr. Marguerite Akens per aver fornito le cellule VX2 iniziali per la creazione del modello VX2 iniziale e i blocchi tumorali VX2 congelati. Vorrei ringraziare Marco DiGrappa per aver contribuito a eseguire esperimenti iniziali di coltura cellulare VX2 e Lili Ding per aver contribuito con la coltura cellulare VX2.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Bisturi a 11 lame, sterile, monousoAspen Surgical (VWR)80094-086
Catetere venoso auricolare a 22 gagheCDMV14332
Sutura in polifilamento assorbibile 3-0 3-0 (Polysorb)Sutura assorbibile intrecciata Covidien356718
3-0 (Polysorb)cellulare Covidien356718
70uM, Confezionato singolarmente, NylonFalcon352350
Acepromazina (Atravet)CDMV1047
Sapone Betadine (Poviodone iodio 7,5%)CDMV4363
Soluzione Betadine (Poviodone iodio 10%)UHN Stores457955
BuprenorphineMcGill University
CefazolinUHN farmacia ospedalieraNo Cat # Needed
Soluzione di clorexidinaCDMV119872
Corning BioCoatCellware, Collagene di tipo I, piastre da 100 mmMarca Corning354450non importante
Corning BioCoatCellware, Collagene di tipo I, piastre a 24 pozzettiMarca Corning354408non importante
Corning BioCoatCellware, Collagene di tipo I, piastre a 6 pozzettiMarca Corning354400no importante
Corning Matrigel Basement Membrane Matrix, *LDEV-free, 10 mLCorning354234
DMEM/HAM F12 1:1Life Technologies11320marca non importante
DMSOCaledon Lab Chem1/10/4100
Enrofloxacina (Baytril iniettabile)CDMV11242
Falcon TubeCorning Centri-Star430828
Siero fetale bovino, qualificato, origine canadese, 500 mlLife Technologies12483020marca/fonte non importante
IsofluranoUHN farmacia ospedalieraNo Cat # Necessario
Contrasto isoesoloGE Healthcare407141210
Meloxicam (Metacam 0,5%)CDMV104674
Normal SalineHouse Brand (UofT Medstore)1011
PBSMulticell o Sigma331-010-CL o D8537-500mL
Penicillina/Streptomicina (100mL; 10000U Penicillina, 10000ug Streptomicina)Corning-CellgroCA45000-652
Soluzione salina bilanciata sterile per matasse (-Ca++, -Mg++, -Rosso fenolo)T.C.M.F (Dr Bristow)28-Gen-11
Colla chirurgica (adesivo per tessuti)3M Vetbond14695B
Tripsina (0,25%), Grado di proteomicaSigmaT-6567-5X20UG
Tripsina-EDTA, 0,05%, 100mlWisent Inc325-542-ELmarca non importante
Colino

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