Un modello 3D in vitro e una pipeline computazionale per quantificare il potenziale vasculogenico dei progenitori endoteliali derivati da iPSC

Sommario

I progenitori endoteliali derivati da cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC-EP) hanno il potenziale di rivoluzionare i trattamenti delle malattie cardiovascolari e di consentire la creazione di modelli di malattie cardiovascolari più fedeli. Qui, vengono descritti l'incapsulamento di iPS-EP in microambienti tridimensionali di collagene (3D) e un'analisi quantitativa del potenziale vasculogenico di queste cellule.

Abstract

Le cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) sono una fonte di cellule proliferanti specifica per il paziente che può differenziarsi in qualsiasi tipo di cellula somatica. I progenitori endoteliali bipotenti (EP), che possono differenziarsi nei tipi di cellule necessari per assemblare la vascolatura matura e funzionale, sono stati derivati sia da cellule staminali pluripotenti embrionali che indotte. Tuttavia, queste cellule non sono state valutate rigorosamente in ambienti tridimensionali e una misura quantitativa del loro potenziale vasculogenico rimane sfuggente. Qui, la generazione e l'isolamento di iPS-EP tramite lo smistamento cellulare attivato a fluorescente sono prima delineati, seguita da una descrizione dell'incapsulamento e della coltura di iPSC-EP in idrogel di collagene. Questo microambiente di imitazione della matrice extracellulare (ECM) incoraggia una robusta risposta vasculogenica; reti vascolari si formano dopo una settimana di cultura. La creazione di una pipeline computazionale che utilizza software open source per quantificare questa risposta vasculogenica è delineata. Questa pipeline è specificamente progettata per preservare l'architettura 3D del plesso capillare per identificare in modo affidabile il numero di rami, punti di diramazione e la lunghezza totale della rete con un input minimo da parte dell'utente.

Introduzione

Cellule endoteliali della vena ombelicale umana (HUVEC) e altri tipi di cellule endoteliali primarie sono stati utilizzati per due decenni per modellare la germogliazione e lo sviluppo dei vasi sanguigni in vitro¹. Tali piattaforme vascolari promettono di illuminare i meccanismi molecolari e tissutali delle malattie cardiovascolari e possono presentare informazioni fisiologiche sullo sviluppo di reti vascolari primitive^2,3. Anche se il campo della modellazione vascolare ha assistito a progressi significativi, un saggio "standard d'oro" in grado di modellare quantitativamente e valutare lo sviluppo vascolare fisiologico rimane elusivo. La maggior parte dei protocolli pubblicati non riassumono adeguatamente la nicchia vascolare per incoraggiare la formazione di vasi sanguigni maturi e funzionali o non dispongono di un metodo per confrontare quantitativamente il potenziale vasculogenico dei tipi di cellule valutate in tre dimensioni ( 3D).

Molti modelli vascolari attuali sono limitati nella loro capacità di imitare la nicchia vascolare fisiologica. Una delle piattaforme in vitro più comunemente impiegate è il saggio di formazione del tubo a base di miscela proteica gelatinosa. In breve, gli HUVEC sono semidati come singole cellule su un sottile strato di gel che consiste di proteine raccolte da murini sarcoma matrice extracellulare (ECM); entro uno o due giorni, gli HUVEC si auto-assemblano in tubi primitivi⁴. Tuttavia, questo processo si verifica in due dimensioni (2D) e le cellule endoteliali (EC) utilizzate in questo saggio non formano lumen vuoti chiusi, limitando così il significato fisiologico di questi studi. Più recentemente, eCs e cellule di supporto (ad esempio, cellule staminali mesenchymal (MSC) e periciti) sono stati co-coltivati in microambienti 3D che simulano l'architettura fibrosa dell'ECM nativo, come collagene o idrogel⁵. Per modellare lo sviluppo vascolare in questo microambiente, le perline polimeriche rivestite con EC sono in genere impiegate⁶. L'aggiunta di fattori di crescita esogeni e/o di fattori di crescita secreti da altre cellule interstizialmente incorporate nell'idrogel può indurre le EC, ricoprendo le perline polimeriche, a germogliare e formare singoli lumen; il numero e il diametro dei germogli e dei vasi possono quindi essere calcolati. Tuttavia, questi germogli sono singolari e non formano una rete chiusa e connessa come si vede in condizioni fisiologiche e quindi ricorda più un modello di vascolatura tumorale. Sono stati utilizzati anche dispositivi microfluidici per imitare la nicchia vascolare e promuovere la formazione di vascolatura negli idrogel carico CE^7,8. Tipicamente, un fattore di crescita angiogenico-gradiente viene applicato al mezzo di coltura cellulare circolante per indurre la migrazione e la germogliazione della CE. Le EC che costituiscono il lume dei vasi sviluppati sono sensibili allo stress di taglio indotto dall'applicazione del flusso di liquidi attraverso il dispositivo microfluidico; pertanto, questi dispositivi microfluidici catturano parametri fisiologici chiave che non sono accessibili nei modelli statici. Tuttavia, questi dispositivi richiedono costose capacità di microfabbricazione.

Ancora più importante, tutti e tre i modelli vascolari (2D, 3D, microfluidici) utilizzano in modo schiacciante le EC primarie e i tipi di cellule di supporto primari. Le cellule primarie non possono essere sviluppate in un'efficace terapia cardiovascolare perché le cellule darebbero una risposta immunitaria al momento dell'impianto; inoltre, gli HUVEC e tipi di cellule primarie simili non sono specifici del paziente e non catturano anomalie vascolari che si verificano in pazienti con una disposizione genetica o condizioni di salute preesistenti, ad esempio il diabete mellito. Le cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) sono emerse nell'ultimo decennio come una fonte cellulare proliferale specifica del paziente che può essere differenziata in tutte le cellule somatiche nel corpo umano⁹. In particolare, sono stati pubblicati protocolli che delineano la generazione e l'isolamento di progenitori endoteliali derivati da iPSC (iPS-EP)^10,11; Gli iPS-EP sono bipopotenti e possono, quindi, essere ulteriormente differenziati in cellule endoteliali e cellule muscolari lisce/periciti, i mattoni della vascolatura matura e funzionale. Solo uno studio ha dettagliato in modo convincente lo sviluppo di un plesso capillare primario da iPS-EP in un microambiente 3D¹²; sebbene questo studio sia fondamentale per comprendere l'assemblaggio iPSC-EP e differenziare gli idrogel naturali e sintetici, non ha confrontato quantitativamente le topologie di rete della vascolatura risultante. Un altro studio recente ha utilizzato il modello di perline polimerico per confrontare la germogliazione di HUVEC e ECs⁵derivati da iPSC . Pertanto, vi è una chiara necessità di chiarire ulteriormente i meccanismi di segnalazione fisica e chimica che regolano la vasculogenesi iPSC-EP nei microambienti 3D e di determinare se queste cellule sono adatte per la terapia ischemica e le malattie cardiovascolari Modellazione.

Nell'ultimo decennio, sono state sviluppate diverse pipeline computazionali e algoritmi di scheletrazione open source per quantificare e confrontare la lunghezza e la connettività della rete vascolare. Ad esempio, Charwat et al. ha sviluppato una pipeline basata su Photoshop per estrarre un'immagine filtrata e binaria di reti vascolari derivate da una co-cultura di cellule staminali derivate da adipose e superano gli EC in una matrice di fibrina^13,14. Forse lo strumento di confronto delle topologie più utilizzato è AngioTool, un programma pubblicato online dal National Cancer Institute¹⁵; nonostante l'adozione diffusa del programma e la fedeltà ben documentata, il programma si limita ad analizzare le strutture simili a navi in due dimensioni e altri programmi, tra cui AngioSys e Wimasis, condividono la stessa limitazione dimensionale¹⁶. Potenti suite software come Imaris, Lucis e Metamorph sono state sviluppate per analizzare la topologia di rete della microvascolatura ingegnerizzata; tuttavia, queste suite sono proibitive dal costo per la maggior parte dei laboratori accademici e limitano l'accesso al codice sorgente, il che può ostacolare la capacità dell'utente finale di personalizzare l'algoritmo in base all'applicazione specifica. 3D Slicer, un pacchetto di imaging a risonanza magnetica/tomografia computerizzata open source, contiene un Toolkit di modellazione vascolare in grado di analizzare efficacemente la topologia delle reti vascolari 3D^17; tuttavia, l'analisi dipende dal posizionamento manuale dei punti finali della rete da parte dell'utente, che possono diventare noiosi quando si analizza un set di dati di grandi dimensioni e può essere influenzato dalle distorsioni subconsce dell'utente. In questo manoscritto, una pipeline computazionale in grado di quantificare le reti vascolari 3D è descritta in dettaglio. Per superare le limitazioni sopra delineate, questa pipeline computazionale open source utilizza ImageJ per pre-elaborare le immagini confocali acquisite per caricare il volume 3D in un analizzatore di scheletri. L'analizzatore di scheletri utilizza un algoritmo di assottigliamento dell'asse mediale parallelo, ed è stato originariamente sviluppato da Kerschnitzki et al. per analizzare la lunghezza e la connettività delle reti di osteociti¹⁸; questo algoritmo può essere applicato in modo efficace per caratterizzare la lunghezza e la connettività della microvascolatura ingegnerizzata.

Complessivamente, questo protocollo delinea la creazione di reti microvascolari in microambienti 3D e fornisce una pipeline computazionale libera open source e user-bias per confrontare facilmente il potenziale vasculogenico degli iPS-EP.

Protocollo

1. Preparazione dei mezzi di coltura e delle soluzioni di rivestimento

1. Per preparare la soluzione di rivestimento della vitronectina, diluire la vitronectina 1:100 nella salina (DPBS) con tamponamento di fosfato di Dulbecco.
   AVVISO: Una volta diluito, non è consigliabile memorizzare questa soluzione per un uso futuro.
2. Dopo aver ricevuto fenolo privo di rosse, la miscela di proteine gelatinose, ridotta dal produttore, ha ridotto il fenolo sul ghiaccio fino a quando la miscela non è trasparente e fluida. Tenendo la miscela sul ghiaccio in una cappa a flusso laminare, pipetta 75 -L della miscela in un tubo di microcentrifuga da 1,8 ml e congelata immediatamente a -20 gradi centigradi. Questi aliquote possono essere conservati per un massimo di un anno.
   AVVISO: Questa miscela proteica gelatinosa diventa molto viscosa se mantenuta a temperatura ambiente e si solidificherà a temperature più elevate. Mantenere questa soluzione ghiacciata.
3. Per preparare questa miscela per il rivestimento, scongelare una aliquota 75 -L sul ghiaccio e diluire con 6 mL di Dulbecco Modified Eagle Medium di ghiaccio: Miscela nutritiva F-12 (DMEM/F12). Questo volume preparato è sufficiente per ricoprire una piastra di 12 pozze.
4. Preparare una soluzione di 100 mg/mL di acido ascorbico magnesio-2-fosfato (una polvere di lofilofing bianca) in acqua ultrapura aggiungendo 500 mg di polvere a 5 mL di acqua in una fiala di vetro 10 mL. Agitare con una barra di agitazione fino a quando la soluzione è completamente trasparente (questo può richiedere fino a un'ora). Questa soluzione può essere conservata a -20 gradi centigradi per un massimo di un anno.
5. Creare uno stock di 10 mM di CHIR99021 (CHIR) sciogliendo 10 mg di polvere liofilizzata in 1,9928 mL di zolfo dimetilo (DMSO) in un tubo di centrifuga conicala da 15 mL e riscaldare in un bagno di perline (o acqua) da 37 km fino a quando la soluzione non è trasparente. Aliquota in tubi di microcentrismo da 1,8 ml e conservata a -20 gradi centigradi per un massimo di un anno.
6. Creare uno stock di 10 mM di Y-27632, un inibitore ROCK (ROCKi), sciogliendo 10 mg di polvere liofilizzata in 3.1225 mL di zolfo dimetilo (DMSO) in un tubo conicale da 15 mL e riscaldato in un bagno di perline (o acqua) di 37 gradi centigradi fino a quando la soluzione non sarà trasparente. Aliquota in tubi di microcentrismo da 1,8 ml e conservata a -20 gradi centigradi per un massimo di un anno.
7. Per preparare il mezzo Essential 8 (E8), scongelare i supplementi surgelati, aggiungere alla bottiglia da 500 mL del mezzo basale e sterilizzare il filtro. Questa soluzione può essere conservata a 4 gradi centigradi per un massimo di due settimane.
   AMMONIMento: È molto importante non riscaldare questo mezzo a 37 gradi centigradi, poiché le proteine nella formulazione media possono degradarsi con un uso prolungato. Invece, mantenere questo mezzo a temperatura ambiente per 15 a 30 min prima dell'uso.
8. Per preparare il buffer di ordinamento, aggiungere 1,33 mL di 7,5% di albumina di siero bovino (BSA) in DPBS e 200 -L di 0,5 mM di acido etilenediaminetraacetica (EDTA) a 48,5 mL di DPBS per creare una soluzione finale di 0,5% BSA e 2 mM EDTA.
9. Per preparare LaSR Basal, aggiungere 300 l un massimo di 100 mg/mL di magnesio ascorbico-2 fosfato e 5 mL di GlutaMAX a 500 mL di DMEM/F12 avanzato. Questa soluzione può essere conservata a 4 gradi centigradi per un massimo di un mese.
10. Per preparare Endotelia Cell Growth Medium-2 (EGM-2), scongelare gli integratori e aggiungere a 500 mL bottiglia di mezzo basale. Questa soluzione può essere conservata a 4 gradi centigradi per un massimo di un mese.
11. Per preparare il buffer di blocco, aggiungere 500 mg di albumina di siero bovino liofilizzato (BSA) e 50 -L di un reagente emulsionante (vedi Tabella dei materiali) a 48 mL di DPBS. Incubare a 37 oC per almeno 15 min per garantire che la BSA non si agglomera e successivamente si separi dalla soluzione.

2. Scongelamento, manutenzione e passaggio di iPSC

1. Prima di scongelare una fiala iPSC crioconservata, ricoprire un singolo pozzo di una piastra di 6 pozzetti con 1 mL di soluzione di vitronectina (preparata come descritto nel passaggio 1.1). Incubare per una h a temperatura ambiente. Non lasciare asciugare quest'aria di rivestimento prima di aggiungere il mezzo E8 alla piastra.
2. Per scongelare gli iPSC, recuperare una fiala crioconservata di iPSC dal suo contenitore di stoccaggio di azoto liquido e scongelare a 37 s fino a quando non rimane un piccolo cristallo di ghiaccio. Trasferire con attenzione (dropwise) il contenuto della fiala scongelata in un tubo centrifuga conico da 15 mL contenente 8 mL di DMEM/F12 ghiacciato. Lavare la fiala scongelata con un'aggiunta di 1 mL di DMEM/F12 ghiacciata per ridurre al minimo la perdita di cellule. Centrifuga per 5 min a 300 x g.
3. In attesa della centrifuga, aspirare la soluzione di vitronectina e aggiungere 1 mL di mezzo E8 (preparato come descritto nel passaggio 1.6) al pozzo. Quindi, rimuovere il supernatante DMEM/F12 dal tubo conico centrifugo e sospendere nuovamente il pellet in 1 mL di mezzo E8. Trasferire le cellule alla piastra appena rivestita, assicurandosi di agitare la sospensione per evitare che le colonie si aggrovigliano al momento della semina.
4. Di solito c'è una morte sostanziale nelle cellule dopo lo scongelamento. La mattina successiva, rimuovere il mezzo e sostituire con nuovo mezzo E8.
   NOTA: Anche in condizioni ottimali, gli iPSC tendono a recuperare male dalla crioconservazione. Si raccomanda di crioconservare un pozzo quasi confluente 6 per la futura seminazione in un unico pozzo 6. La presenza di detriti cellulari è normale per i primi 2-3 giorni durante il recupero delle cellule.
5. Sostituire E8 medio giornalmente fino a quando le cellule sono pronte per il passaggio (70%-80% confluenza).
6. Per passare, prima preparare pozzi rivestiti di vitronectin (come descritto al punto 2.1).
   1. Una volta che i pozzi rivestiti di vitronectina sono pronti (circa 1 h), aspirare e8 medio da ben essere svernato e lavare due volte con 1 mL di DPBS. Incubare con 1 mL di 0,5 mM EDTA per 5-7 min a 37 gradi centigradi. Durante l'incubazione, rimuovere la soluzione di vitronectina dal pozzo appena rivestito e sostituirla con 1-2 mL di mezzo E8.
   2. Togliere la soluzione EDTA dai pozzi da passare e staccare le colonie lavando delicatamente una o due volte con 1 mL di E8. Trasferire 75-200 -L di sospensione cellulare nei pozzi e8 appena rivestiti, agitare la piastra per garantire una copertura uniforme e mettere immediatamente nell'incubatrice.
      AVVISO: il tempo di incubazione del distacco dell'iPSC dipende dalla linea cellulare; si raccomanda all'utente di questo protocollo di testare un intervallo di volte dopo l'espansione sufficiente di una linea iPSC ricevuta/generata. 75 - L di sospensione cellulare si traduce generalmente in 4 giorni tra i passaggi; 150 o più l porta a 2-3 giorni tra i passaggi.

3. Generazione di progenitori endoteliali derivati da iPSC (Figura 1).

1. Quando si mantengono iPSC, assicurarsi che le colonie siano ben compattate e che ci sia un basso numero di cellule differenziate nella coltura. Se le colonie iniziano a contattarsi, le cellule sono molto probabilmente troppo confluenti e devono essere passaggiate immediatamente.
2. Quando gli iPSC sono confluenti al 70%-80%, mancheranno una piastra di 24 pozzetti con la miscela proteica gelatinosa (preparata come descritto nel 1.2/1.3). Pipette 250 -L di questa miscela in ogni pozzo e tenere per 1 h a temperatura ambiente.
3. Durante l'incubazione di 1-h, rimuovere il mezzo E8 e Y-27632 rispettivamente dal frigorifero e dal congelatore. Una volta che il mezzo E8 e l'Y-27632 raggiungono la temperatura ambiente, preparate e8 - ROCKi aggiungendo 13 -L di 10-M Y-27632 a 13 mL di E8 in un tubo di centrifuga conico da 15 mL.
4. Togliere il supporto E8 dai pozzetti iPSC, lavare due volte con 1 mL di DPBS, quindi incubare con 0,5 mM EDTA per 5-7 min a 37 gradi centigradi. Dopo il periodo di incubazione, rimuovere l'EDTA e inclinare rapidamente le cellule in una sospensione a singola cella con una punta di pipetta P1000 con 1 mL di mezzo E8 - ROCKi.
5. Conta le celle con un emocitometro. Per una sospensione che può contenere milioni di iPSC, aggiungere 20 litri di sospensione cellulare a 180 o L di blu trypan. Determinare il numero totale di celle nella sospensione a cella singola.
6. Trasferire da 0,432 x 10 da 10⁶ a 1,296 x 10⁶ celle (da 10⁴ a 3 x 10⁴ celle/cm²⁾al mezzo restante E8 - ROCKi. Rimuovere il rivestimento della miscela gelatinosa dalla piastra di 12 pozze appena rivestita e aggiungere 500 l'l di sospensione cellulare ad ogni pozzo, assicurando che le cellule siano ben distribuite e non formino piccoli grumi.
   NOTA: questa gamma di densità è ottimale per la differenziazione delle cellule positive CD34; Tuttavia, queste densità di seeding dipendono dalla cella e potrebbe essere necessario ottimizzarle dall'utente di questo protocollo.
7. Dopo 24 ore di coltura, sostituire il mezzo con 500 l una delle medie E8 fresche. Incubare per ulteriori 24 h nelle stesse condizioni.
8. Rimuovere il supporto E8 e sostituirlo con LaSR Basal integrato con 6-12 M di CHIR99021. Questo timepoint è definito come D0 di differenziazione. Dopo 24 h di coltura, sostituire con lo stesso mezzo di coltura cellulare.
   NOTA: come descritto in precedenza, la quantità di CHIR99021 aggiunta a questo supporto dipenderà dalla linea iPSC utilizzata. Si prega di testare una gamma di concentrazioni di CHIR99021 per garantire risultati ottimali.
9. Dopo 48 h di incubazione con CHIR99021, sostituire con 1 mL di LaSR Basal.
10. Sostituire il mezzo giornaliero con 2 mL di LaSR Basal per 2-3 giorni aggiuntivi. In questo momento (D5 di differenziazione), una parte significativa di queste cellule esprimerà CD34 e può essere caratterizzata come progenitori endoteliali. Uno schema di questo protocollo è delineato con risultati rappresentativi nella Figura 1 e descritto per intero dagli inquirenti che hanno pubblicato per la prima volta questo metodo ^11,19.
    NOTA: questi progenitori endoteliali possono essere ulteriormente differenziati lungo un lignaggio endoteliale (35%-99%) o un lignaggio muscolare liscio (1%-65%). L'efficienza di differenziazione varia a seconda del tipo di rivestimento ECM e del mezzo di coltura cellulare utilizzato durante la differenziazione ²⁰.

4. FACS di progenitori endoteliali

1. Prima di dissociare le celle differenziate D5/D6, preparare il buffer di ordinamento come descritto al punto 1.8 e tenere sul ghiaccio.
2. Incubare le cellule differenziate con 250 -L di soluzione di distacco cellulare per pozzo (vedi Tabella dei materiali) per 10 min a 37 .
3. Dissociare le cellule con una punta di pipetta P1000 in una sospensione a cella singola nella soluzione di distacco cellulare. Consolidare la miscela di soluzione di distacco cellulare-cellula in un tubo di centrifuga conicante da 15 mL e centrifugare per 5 min a 300 x g.
4. Rimuovere il supernatante e risospendere in 200 gradi di tampone di cernita di smistamento ghiacciato (preparato come descritto nel passaggio 1.7. Aggiungete 5 l dell'anticorpo concentrato CD34-PE alla sospensione tampone di smistamento cellulare e incubate per 10 min a 4 gradi centigradi.
5. Sospendere nuovamente in 5 mL di tampone di smistamento a freddo ghiaccio. Filtrare questa sospensione attraverso un colino cellulare con un tappo di 40 m prima di essere posizionato sulla selezionatrice.
6. Sul canale fluorescente appropriato, ordinare 10.000 cellule che non sono state etichettate con un anticorpo fluorescente. Cancellare una regione ad alta intensità fluorescente che non contiene nessuna di queste 10.000 celle (Figura 1D). Questo servirà come un controllo negativo.
7. Eseguire il campione contenente iPSC-EP etichettato con una soluzione fluorescente e iniziare l'ordinamento. CD34 è altamente espresso in questi progenitori endoteliali ed è facilmente separato dalla popolazione principale. Dopo lo smistamento, trasferire la soluzione in un tubo di centrifuga conica da 15 mL e centrifugare per 5 min a 300 x g. Togliete il super-acletterante.
   NOTA: Se la soluzione si trova in un tubo più grande di un tubo di microcentrismo (ad esempio, un tubo in polistirolo da 5 mL comunemente impiegato in molti protocolli FAC), sospendere nuovamente il pellet di cellule smigiate in 1 mL di buffer di smistamento e trasferire questa soluzione in un tubo di microcentrifuga. Centrifuga a 300 x g per 5 min e rimuovere il supernatante.
   1. Facoltativo: se si desidera un'ulteriore caratterizzazione iPSC-EP, aggiungere contemporaneamente altri anticorpi primari (ad esempio, CD31-APC) contemporaneamente a CD34-PE. Assicurarsi che il crosstalk tra diversi canali fluorescenti sia ridotto al minimo.

5. Incapsulamento e coltura a lungo termine di idrogel di collagene carichi di iPSC-EP

1. Preparare il mezzo di seeding aggiungendo 40 gradi l di 10x medio 199 a 400 - L di mezzo di crescita endoteliale (EGM-2) integrato con 10 .M Y-27632 in una microcentrifuga da 1,8 mL e posizionare il tubo sul ghiaccio.
   NOTA: Mentre l'uso di antibiotici è sconsigliato per la coltura delle cellule staminali e il mantenimento di cellule differenziate, il dosaggio con penna / streptop è raccomandato dopo lo smistamento perché è difficile garantire la sterilità nell'ambiente di smistamento (questo è più imperativo se la selezionatrice è condivisa tra molti laboratori).
2. Togliere tutti i solatori dalla sospensione cellulare e aggiungere 200 l di EGM-2 integrati con 10 SM Y-27632. Trasferire la sospensione cellulare al mezzo di semina e mescolare vigorosamente.
3. Aggiungere 350 - L di collagene alla soluzione preparata al punto 5.2 e mescolare bene. La soluzione diventerà giallo pallido.
   NOTA: La concentrazione finale di collagene può avere un impatto significativo sulla formazione del plesso capillare. Questo protocollo presuppone che il collagene sia stato fornito a 10 mg/mL e che gli idrogel abbiano una concentrazione finale di 3,5 mg/mL. Regolare questi volumi per raggiungere la loro concentrazione finale di collagene; si raccomanda di limitare la concentrazione finale di collagene da 2 mg/mL a 4 mg/mL.
4. Aggiungere 5 -L l di 1M NaOH alla soluzione preparata in 5.3 e mescolare bene, evitando l'introduzione di bolle d'aria. La soluzione diventerà rosa brillante.
5. Pipette 56 - di soluzione di cellule di collagene neutro preparato in 5.4 in singoli pozzi di una piastra di coltura cellulare U-bottom a bassissimo 96-po' di ben basso. Incubare a 37 gradi centigradi per 30 min. Prima di aggiungere supporti, verificare che le cellule siano state distribuite uniformemente esaminando i campioni con un microscopio a campo luminoso.
6. Preparare 1 mL di mezzo di coltura composto da EGM-2 integrato con 10 sM Y-27632 e 50 ng/mL del fattore di crescita endoteliale vascolare (VEGF) aggiungendo 1 l di ogni soluzione di stock a un tubo di microcentrismo. Dopo la miscelazione bene, pipetta 100 L di questo mezzo di coltura cellulare sugli idrogel carichi di cellule. Trasferire la piastra a 37 gradi centigradi per la coltura a lungo termine.
7. Sostituire il mezzo di coltura al giorno, aggiungendo ulteriori fattori di crescita angiogenici o piccoli inibitori di molecola come dettato dall'obiettivo dello studio. Per rimuovere in modo ottimale il supporto, inclinare la piastra e utilizzare una punta P100 per aspirare delicatamente il mezzo senza disturbare l'idrogel.

6. Fissaggio, immunostaining e visualizzazione di reti vascolari basate su EP

1. Dopo una settimana di coltura, aggiungere 250 l una soluzione del 4% di paraformaldeide (PFA) a una piastra di 48 pozze. Riempire come molti pozzi come ci sono idrogel. Rimuovere il mezzo dagli idrogel (PFA) e utilizzare una pinzetta a punta fine per trasferire gli idrogel in PFA contenenti pozzi. Incubare per 10 min a temperatura ambiente e rimuovere il PFA lavando rapidamente con PBS.
2. Permeabilizzare aggiungendo 250 - L di 0,5% di un surfactant nonionico (vedi Tabella dei materiali) per 5 min a temperatura ambiente. Lavare due volte con 250 gradi di PBS integrati con 300 mM di glicina. Incubare a temperatura ambiente per 5 min per ogni fase di lavaggio per garantire la rimozione del detergente in eccesso. Bloccare immergendo gli idrogel in 250 - L di buffer di blocco per 30 min.
3. Incubare con gli anticorpi primari desiderati diluiti nel buffer di blocco durante la notte a 4 gradi centigradi. Ad esempio, se l'immunostaining con phalloidin e VE-cadherin, diluire 1:40 e 1:200, rispettivamente, nel buffer di blocco.
4. Il giorno successivo, rimuovere la soluzione anticorpale primaria e lavare due volte con 0.5% reagente emulsionante in DPBS. Coprire con un foglio di alluminio e incubare con un anticorpo secondario specifico della specie (ad esempio, 1:200 Alexa Fluor 488 in PBS) per 2 h a temperatura ambiente.
5. Rimuovere la soluzione anticorpale secondaria e lavare due volte con 0,5% reagente emulsionante in DPBS. Incubare a temperatura ambiente per 5 min per ogni fase di lavaggio per garantire la rimozione di fluorofori liberi.
6. Per visualizzare i nuclei cellulari, diluire 4', 6-diamidino-2-fenilindole (DAPI) 1:10000 in PBS e aggiungere al campione(s).
   1. Incubare per 2 min a temperatura ambiente e lavare due volte con PBS. Incubare a temperatura ambiente per 5 min per ogni fase di lavaggio per garantire la rimozione di fluorofori liberi.
7. Trasferire i campioni in un'angiogenesi - Diapositiva o una piastra di Petri inferiore di vetro utilizzando una pinzetta con punta fine. Assicurarsi che non vi siano bolle d'aria intrappolate sotto l'idrogel.
8. Immagine su un microscopio confocale acquisendo z-stack che si estendono dal basso verso l'alto del campione. Assicurarsi che il rivelatore non sia saturo e che l'ingrandimento più basso disponibile sia in uso (è auspicabile un ampio campo visivo).
   NOTA: per l'elaborazione futura, assicurarsi che gli stack z vengano salvati con una compressione minima (ad esempio, .czi).

7. Utilizzo della pipeline computazionale per analizzare e confrontare le topologie di rete vascolare

1. Ispezionare ogni z-stack per assicurarsi che le fette contengano solo vasi. Aprite lo z-stack in ImageJ e aumentate il contrasto facendo clic su Immagine > Regola > Luminosità/Contrasto. I confini della nave sono ora chiaramente delimitati e il livello di fondo è ridotto al minimo. Spesso, le dimensioni z non corrispondono alle dimensioni x/y. Per risolvere il problema, fate clic su Immagine > Regola > Dimensioni e modificate il numero di sezioni z in modo che la distanza tra ogni sezione sia equivalente a un pixel in x/y. ImageJ verrà interpolata automaticamente. Se questo passaggio non viene eseguito correttamente, i volumi 3D finali appariranno compressi.
   AMMONIMento: le EC migreranno verso i bordi del gel e formeranno piccole colonie di ciottoli. Mentre questi sono utili per stimare i confini dell'idrogel, interferiranno con l'analisi dell'immagine finale e dovrebbero essere eliminati.
   NOTA: ImageJ è un software di analisi delle immagini open source basato su Java sviluppato in concerto dai National Institutes of Health e dal Laboratorio per la Strumentazione Ottica e Computazionale. Si consiglia di scaricare Fiji, che è semplicemente ImageJ in bundle con plugin utili (https://fiji.sc/).
2. In ImageJ, sfocate l'immagine in 3 dimensioni facendo clic su Processo > Filtri > Sfocatura gaussiana 3D e quindi impostando i valori sigma in tutte e 3 le dimensioni su 2.0 (questo valore potrebbe dover essere regolato dall'utente finale).
3. In ImageJ fare clic su Elabora > Binario > Rendi binario, quindi selezionare un algoritmo di soglia appropriato. L'algoritmo di soglia di entropia trasversale sviluppato da Li et al. è efficace nel separare i vasi dallo sfondo²¹. Calcolare la soglia per ogni immagine e impostare lo sfondo su "Predefinito".
4. In ImageJ, rimuovere il disturbo spurio e riempire i "buchi" in lummen facendo clic su Elabora > Disturbo > Rimuovi outlier.
   NOTA: la rimozione di valori anomali "luminosi" riempirà piccoli fori nei recipienti collegati; rimuovendo outlier "oscuri" rimuoverà le cellule morte. La dimensione del raggio di rimozione varierà in base all'ingrandimento e alle dimensioni dei vasi. Per le immagini acquisite con un obiettivo di campo largo di 512 x 512 pixel, i raggi variano in genere da 4-6 pixel.
5. Elaborare tutti i file non elaborati (ad esempio, estensione czi) e convertirlo in file .tif prima di procedere al passaggio 7.6. Per aiutare in questa elaborazione, un script ImageJ, "Binarize e Filter.ijm" è stato allegato a questo manoscritto.
6. Salvare i file .tif elaborati nella stessa cartella del file "BatchProcessSkeleton.m", disponibile per il download nel manoscritto. Questo script, sviluppato dagli autori, chiama le funzioni pubblicate da Phillip Kollmannsberger²² e conduce alcune ulteriori manipolazioni dei file.
7. Scaricare e decomprimere tutti i file associati alle due funzioni principali "Skel2Graph3D" (https://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/43527-skel2graph-3d) e "Skeleton3D" (https://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/43400-skeleton3d). Salvare tutte le funzioni nella stessa cartella dello z-stack elaborato aperto.
8. Aprire un ambiente di elaborazione numerica multiparadigma (vedere Tabella dei materiali) e passare alla cartella in cui sono stati salvati tutti i file descritti in precedenza.
9. Eseguire "BatchProcessSkeleton.m" digitando BatchProcessSkeleton nella finestra di comando o premendo il pulsante Esegui (freccia verde rivolta a destra) nell'editor.
   NOTA: per analizzare un set di dati di grandi dimensioni con un singolo comando, assicurarsi che la stringa all'interno della funzione dir nella riga 6 contenga un asterisco (ad esempio, '.tif'). In caso contrario, sostituire l'asterisco con il nome del file se si desidera l'analisi di un singolo file.
10. Il tempo necessario per l'esecuzione dello script varia notevolmente in base alla potenza di calcolo disponibile. Si consiglia di eseguire questa analisi su un computer con almeno 8 GB di RAM in modo che l'utente possa accedere ad altri programmi durante l'esecuzione dello script.
    AVVISO: Anche se non strettamente necessario, rappresentare graficamente l'acquisizione confocale originale (in grigio) e la sovrapposizione con questa matrice di immagini con la matrice dello scheletro (in rosso) può aiutare a valutare le prestazioni dell'algoritmo di scheletrazione. Inoltre, il lettore può creare un grafico nodale, come implementato da Kollmannsberger et al., per valutare l'accuratezza dell'analisi di rete. La creazione di entrambi i grafici, sebbene utile, aumenterà notevolmente il tempo di esecuzione dello script e richiederà memoria aggiuntiva; se l'utente richiede semplicemente un'analisi finale della topologia e non desidera visualizzare il set di dati, è sufficiente impostare come commento le righe da 44 a 61 (grafico dello scheletro) e le linee da 104 a 143 (grafico della topologia).
11. Al termine, la matrice di dati, visibile nell'area di lavoro, ora contiene i dati elaborati. Fare doppio clic su Dati e aprire questa cella nell'editor variabili.
    1. Si noti che questa matrice conterrà, da sinistra a destra: 1) il nome del file, 2) il numero di nodi (punti di diramazione , punti finali), 3) punti ramo, 4) collegamenti (ad esempio, navi), 5) lunghezza della rete (compresi i vasi isolati) e 6) il numero di fette contenute nello stack z. Salvare questi dati come file .csv ed esportare per ulteriori analisi a qualsiasi software di scelta.

Risultati

Dopo la differenziazione (Figura 1), FACS e incapsulamento di iPSC-EP in idrogel di collagene, le cellule in genere rimarranno arrotondate per 24 h prima di iniziare a migrare e formare lumen iniziali. Dopo circa 6 giorni di cultura, un plesso capillare primitivo sarà visibile nell'idrogel quando visto con microscopia a campo luminoso (Figura 2). Dopo aver creato l'imaging degli idrogel fissi e macchiati carichi di cellule su un ...

Discussione

Questo protocollo prevede la coltura a lungo termine delle cellule in tre tipi di mezzi di coltura cellulare: E8, Basal LaSR ed EGM-2. Pertanto, si dovrebbe fare molta attenzione a sterilizzare in modo appropriato tutti i materiali. Inoltre, i camici da laboratorio e i guanti puliti con etanolo devono essere sempre indossati quando si lavora nella cappa di flusso laminare del laboratorio. Si raccomanda di testare frequentemente la contaminazione da micoplasma; se si osserva una grande quantità di detriti durante la coltu...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
µ-Slide Angiogenesi	Ibidi	N/A	Una piastra piatta per colture tissutali con fondo in vetro e pareti laterali consente un facile imaging confocale
Micropiastra a 96 pozzetti, fondo rotondo, a bassissimo attacco, sterile	Corning	7007	Previene il legame degli idrogel di collagene carichi di cellule alla piastra di coltura cellulare
Accutase	STEMCELL Technologies	7920	Soluzione delicata per il distacco delle cellule; non degrada gli epitopi extracellulari vitali per FACS
Advanced DMEM/F12	Thermo Scientific	12634010	Il terreno di base per la differenziazione iPSC-EP.
Barnstead GenPure xCAD Plus	Thermo Fisher Scientific	50136165	Sistema di purificazione dell'acqua; altri possono essere facilmente sostituiti Soluzione
albumina sierica bovina, 7,5% in DPBS, filtrata sterile, BioXtra, adatta per colture cellulari	Fisher Scientific	A8412	Per preservare la vitalità cellulare quando i FAC selezionano
CD34-PE, umano (clone: AC136)	Miltenyi Biotec	130-098-140	Anticorpo utilizzato per l'isolamento dei FAC di iPSC-EP
CHIR99021	LC Laboratories	C-6556	Induce la formazione di mesoderma da cellule staminali pluripotenti
Collagene I Coda di ratto High Protein 100 mg	VWR	354249	Componente principale del microambiente 3D
Provette da centrifuga coniche (15/50 mL)	Fisher Scientific	14-959-49D/A	Utilizzato per conservare e miscelare volumi relativamente grandi di reagenti e terreni
di coltura cellulareDAPI (4',6-Diamidino-2-Fenilindolo, Dicloridrato)	Thermo Fisher Scientific	D1306	Per controcolorare e visualizzare i nuclei cellulari
DMEM/F12	Thermo Fisher Scientific	11320-082	Per la diluizione di Matrigel e lo scongelamento di cellule staminali pluripotenti
Soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbco (DPBS)	ThermoFisher	14190-250	Per lavare colture monostrato
EDTA	Sigma-Aldrich	E8008	Per il passaggio di colonie di cellule staminali pluripotenti e per prevenire l'aggregazione cellulare durante lo smistamento delle FAC
Terreno di crescita delle cellule endoteliali 2	PromoCell	C-22011	Promuove la vitalità e la proliferazione delle cellule endoteliali
Terreno essenziale 8	Thermo Fisher Scientific	A1517001	Per il mantenimento di cellule staminali pluripotenti
Glicina,BioUltra, per biologia molecolare, >=99,0% (NT)	Sigma-Aldrich	50046	Neutralizza il detergente rimanente
Acido L-ascorbico 2-fosfato sale di sesquimagnesio idrato,>=95%	Sigma-Aldrich	A8960	Componente del mezzo di differenziazione iPSC-EP
MATLAB	MathWorks	1.8.0_152	Ambiente di calcolo numerico multi-paradigma (disponibile gratuitamente presso la maggior parte delle istituzioni accademiche)
Matrigel Matrix GFR PhenolRF Mouse 10 mL (miscela di proteine gelatinose)	Fisher Scientific 356231		Diluito in DMEM/F12 per rivestire le piastre per la differenziazione iPSC-EP
Medium-199 10X	Thermo Fisher Scientific	1825015	Utilizzato per bilanciare l'osmolarità finale dell'idrogel e il pH
Provette per microcentrifuga (1,7 mL)	VWR	87003-294	Conserva piccoli volumi di reagenti
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)	Sigma-Aldrich	P3813	L'ingrediente principale delle soluzioni immunocoloranti
Penicillina-Streptomicina (10.000 U/mL)	Thermo Fisher Scientific	15140122	Antibiotico utilizzato dopo la selezione per rimuovere possibili contaminazioni dallo strumento FACS
Proteina ricombinante umana VEGF 165 R	& D Systems	293-VE	Mitogeno che stimola la proliferazione delle cellule endoteliali e la tubulogenesi
Rodamina falloidina	Themo Fisher Scientific	R415	Per identificare la deposizione di F-actina e quindi delineare i confini delle reti vascolari
Triton X-100 (tensioattivo non ionico)	Sigma-Aldrich	X-100	Detergente utilizzato per permeabilizzare delicatamente le cellule
Tween-20 (reagente emulsionante)	Fisher Scientific	BP337	Aumenta la specificità di legame degli anticorpi aggiunti
VE-Caderrina (F-8)	Santa Cruz Biotechnology	sc-9989	Per identificare il lume endoteliale 3D negli idrogel di collagene
Vitronectin	ThermoFisher	A14700	Per il mantenimento delle cellule staminali pluripotenti
Y-27632	Selleck Chemicals	S1049	Preserva la vitalità delle cellule staminali pluripotenti e delle iPSC-EP quando dissociata e riseminata