Un modello 3D in vitro e una pipeline computazionale per quantificare il potenziale vasculogenico dei progenitori endoteliali derivati da iPSC

Summary

I progenitori endoteliali derivati da cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC-EP) hanno il potenziale di rivoluzionare i trattamenti delle malattie cardiovascolari e di consentire la creazione di modelli di malattie cardiovascolari più fedeli. Qui, vengono descritti l'incapsulamento di iPS-EP in microambienti tridimensionali di collagene (3D) e un'analisi quantitativa del potenziale vasculogenico di queste cellule.

Abstract

Le cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) sono una fonte di cellule proliferanti specifica per il paziente che può differenziarsi in qualsiasi tipo di cellula somatica. I progenitori endoteliali bipotenti (EP), che possono differenziarsi nei tipi di cellule necessari per assemblare la vascolatura matura e funzionale, sono stati derivati sia da cellule staminali pluripotenti embrionali che indotte. Tuttavia, queste cellule non sono state valutate rigorosamente in ambienti tridimensionali e una misura quantitativa del loro potenziale vasculogenico rimane sfuggente. Qui, la generazione e l'isolamento di iPS-EP tramite lo smistamento cellulare attivato a fluorescente sono prima delineati, seguita da una descrizione dell'incapsulamento e della coltura di iPSC-EP in idrogel di collagene. Questo microambiente di imitazione della matrice extracellulare (ECM) incoraggia una robusta risposta vasculogenica; reti vascolari si formano dopo una settimana di cultura. La creazione di una pipeline computazionale che utilizza software open source per quantificare questa risposta vasculogenica è delineata. Questa pipeline è specificamente progettata per preservare l'architettura 3D del plesso capillare per identificare in modo affidabile il numero di rami, punti di diramazione e la lunghezza totale della rete con un input minimo da parte dell'utente.

Introduction

Cellule endoteliali della vena ombelicale umana (HUVEC) e altri tipi di cellule endoteliali primarie sono stati utilizzati per due decenni per modellare la germogliazione e lo sviluppo dei vasi sanguigni in vitro¹. Tali piattaforme vascolari promettono di illuminare i meccanismi molecolari e tissutali delle malattie cardiovascolari e possono presentare informazioni fisiologiche sullo sviluppo di reti vascolari primitive^2,3. Anche se il campo della modellazione vascolare ha assistito a progressi significativi, un saggio "standard d'oro" in grado di modellare quantitativamente e valutare ....

Protocol

1. Preparazione dei mezzi di coltura e delle soluzioni di rivestimento

1. Per preparare la soluzione di rivestimento della vitronectina, diluire la vitronectina 1:100 nella salina (DPBS) con tamponamento di fosfato di Dulbecco.
   AVVISO: Una volta diluito, non è consigliabile memorizzare questa soluzione per un uso futuro.
2. Dopo aver ricevuto fenolo privo di rosse, la miscela di proteine gelatinose, ridotta dal produttore, ha ridotto il fenolo sul ghiaccio fino a quando la miscela non è trasparente e fluida. Tenendo la miscela sul ghiaccio in una cappa a flusso laminare, pipetta 75 -L della miscela in un tubo di microcentrifuga da 1,8....

Results

Dopo la differenziazione (Figura 1), FACS e incapsulamento di iPSC-EP in idrogel di collagene, le cellule in genere rimarranno arrotondate per 24 h prima di iniziare a migrare e formare lumen iniziali. Dopo circa 6 giorni di cultura, un plesso capillare primitivo sarà visibile nell'idrogel quando visto con microscopia a campo luminoso (Figura 2). Dopo aver creato l'imaging degli idrogel fissi e macchiati carichi di cellule su un .......

Discussion

Questo protocollo prevede la coltura a lungo termine delle cellule in tre tipi di mezzi di coltura cellulare: E8, Basal LaSR ed EGM-2. Pertanto, si dovrebbe fare molta attenzione a sterilizzare in modo appropriato tutti i materiali. Inoltre, i camici da laboratorio e i guanti puliti con etanolo devono essere sempre indossati quando si lavora nella cappa di flusso laminare del laboratorio. Si raccomanda di testare frequentemente la contaminazione da micoplasma; se si osserva una grande quantità di detriti durante la coltu.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
µ-Slide Angiogenesi	Ibidi	N/A	Una piastra piatta per colture tissutali con fondo in vetro e pareti laterali consente un facile imaging confocale
Micropiastra a 96 pozzetti, fondo rotondo, a bassissimo attacco, sterile	Corning	7007	Previene il legame degli idrogel di collagene carichi di cellule alla piastra di coltura cellulare
Accutase	STEMCELL Technologies	7920	Soluzione delicata per il distacco delle cellule; non degrada gli epitopi extracellulari vitali per FACS
Advanced DMEM/F12	Thermo Scientific	12634010	Il terreno di base per la differenziazione iPSC-EP.
Barnstead GenPure xCAD Plus	Thermo Fisher Scientific	50136165	Sistema di purificazione dell'acqua; altri possono essere facilmente sostituiti Soluzione
albumina sierica bovina, 7,5% in DPBS, filtrata sterile, BioXtra, adatta per colture cellulari	Fisher Scientific	A8412	Per preservare la vitalità cellulare quando i FAC selezionano
CD34-PE, umano (clone: AC136)	Miltenyi Biotec	130-098-140	Anticorpo utilizzato per l'isolamento dei FAC di iPSC-EP
CHIR99021	LC Laboratories	C-6556	Induce la formazione di mesoderma da cellule staminali pluripotenti
Collagene I Coda di ratto High Protein 100 mg	VWR	354249	Componente principale del microambiente 3D
Provette da centrifuga coniche (15/50 mL)	Fisher Scientific	14-959-49D/A	Utilizzato per conservare e miscelare volumi relativamente grandi di reagenti e terreni
di coltura cellulareDAPI (4',6-Diamidino-2-Fenilindolo, Dicloridrato)	Thermo Fisher Scientific	D1306	Per controcolorare e visualizzare i nuclei cellulari
DMEM/F12	Thermo Fisher Scientific	11320-082	Per la diluizione di Matrigel e lo scongelamento di cellule staminali pluripotenti
Soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbco (DPBS)	ThermoFisher	14190-250	Per lavare colture monostrato
EDTA	Sigma-Aldrich	E8008	Per il passaggio di colonie di cellule staminali pluripotenti e per prevenire l'aggregazione cellulare durante lo smistamento delle FAC
Terreno di crescita delle cellule endoteliali 2	PromoCell	C-22011	Promuove la vitalità e la proliferazione delle cellule endoteliali
Terreno essenziale 8	Thermo Fisher Scientific	A1517001	Per il mantenimento di cellule staminali pluripotenti
Glicina,BioUltra, per biologia molecolare, >=99,0% (NT)	Sigma-Aldrich	50046	Neutralizza il detergente rimanente
Acido L-ascorbico 2-fosfato sale di sesquimagnesio idrato,>=95%	Sigma-Aldrich	A8960	Componente del mezzo di differenziazione iPSC-EP
MATLAB	MathWorks	1.8.0_152	Ambiente di calcolo numerico multi-paradigma (disponibile gratuitamente presso la maggior parte delle istituzioni accademiche)
Matrigel Matrix GFR PhenolRF Mouse 10 mL (miscela di proteine gelatinose)	Fisher Scientific 356231		Diluito in DMEM/F12 per rivestire le piastre per la differenziazione iPSC-EP
Medium-199 10X	Thermo Fisher Scientific	1825015	Utilizzato per bilanciare l'osmolarità finale dell'idrogel e il pH
Provette per microcentrifuga (1,7 mL)	VWR	87003-294	Conserva piccoli volumi di reagenti
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)	Sigma-Aldrich	P3813	L'ingrediente principale delle soluzioni immunocoloranti
Penicillina-Streptomicina (10.000 U/mL)	Thermo Fisher Scientific	15140122	Antibiotico utilizzato dopo la selezione per rimuovere possibili contaminazioni dallo strumento FACS
Proteina ricombinante umana VEGF 165 R	& D Systems	293-VE	Mitogeno che stimola la proliferazione delle cellule endoteliali e la tubulogenesi
Rodamina falloidina	Themo Fisher Scientific	R415	Per identificare la deposizione di F-actina e quindi delineare i confini delle reti vascolari
Triton X-100 (tensioattivo non ionico)	Sigma-Aldrich	X-100	Detergente utilizzato per permeabilizzare delicatamente le cellule
Tween-20 (reagente emulsionante)	Fisher Scientific	BP337	Aumenta la specificità di legame degli anticorpi aggiunti
VE-Caderrina (F-8)	Santa Cruz Biotechnology	sc-9989	Per identificare il lume endoteliale 3D negli idrogel di collagene
Vitronectin	ThermoFisher	A14700	Per il mantenimento delle cellule staminali pluripotenti
Y-27632	Selleck Chemicals	S1049	Preserva la vitalità delle cellule staminali pluripotenti e delle iPSC-EP quando dissociata e riseminata