Articolo metodologico

Isolamento e colorazione dei Keratinociti della pelle del topo per l'analisi specifica del ciclo cellulare dell'espressione proteica cellulare da citometria di massa

DOI:

10.3791/59353

⸱

9 maggio 2019

 , 
1Department of Dermatology and Charles C. Gates Center for Regenerative Medicine, University of Colorado Anschutz Medical Campus

In questo articolo

Sommario

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Questo protocollo descrive come isolare i cheratinociti cutanei dai modelli murinari, per macchiare con anticorpi con tag metallici e analizzare le cellule colorate per citometria di massa al fine di profilare il modello di espressione delle proteine di interesse nelle diverse fasi del ciclo cellulare.

Abstract

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L'obiettivo di questo protocollo è quello di rilevare e quantificare i cambiamenti dell'espressione proteica in modo dipendente dal ciclo cellulare utilizzando singole cellule isolate dall'epidermide della pelle del topo. Ci sono sette passi importanti: separazione dell'epidermide dal dermide, digestione dell'epidermide, colorazione delle popolazioni di cellule epidermiche con cisplatina, codice a barre campione, colorazione con anticorpi metallici marcati per marcatori del ciclo cellulare e proteine di l'interesse, la rilevazione di anticorpi con etichettatura metallica mediante citometria di massa e l'analisi dell'espressione nelle varie fasi del ciclo cellulare. Il vantaggio di questo approccio rispetto ai metodi istologici è il potenziale per esaminare il modello di espressione di >40 marcatori diversi in una singola cella in diverse fasi del ciclo cellulare. Questo approccio consente anche l'analisi di correlazione multivariata dell'espressione proteica che è più quantificabile rispetto ai metodi istologici/immagini. Lo svantaggio di questo protocollo è che è necessaria una sospensione di singole cellule, che si traduce nella perdita di informazioni sulla posizione fornite dalla colorazione delle sezioni di tessuto. Questo approccio può anche richiedere l'inclusione di marcatori aggiuntivi per identificare diversi tipi di cellule nelle sospensioni cellulari grezze. L'applicazione di questo protocollo è evidente nell'analisi dei modelli di malattia iperplastica della pelle. Inoltre, questo protocollo può essere adattato per l'analisi di specifici sottotipi di cellule (ad esempio, cellule staminali) mediante l'aggiunta di anticorpi specifici del lignaggio. Questo protocollo può anche essere adattato per l'analisi delle cellule della pelle in altre specie sperimentali.

Introduzione

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La correlazione dell'espressione genica con le fasi del ciclo cellulare rimane una sfida nell'analisi di modelli animali di malattie iperplastiche come il cancro. Parte di questa sfida è la coordinazione delle proteine di interesse (POI) con marcatori di proliferazione. Le cellule proliferative possono essere trovate in varie fasi del ciclo cellulare tra cui G1, S, G2 e M. Ki67 è uno dei marcatori più comunemente utilizzati di proliferazione ed è espresso in tutte le fasi del ciclo cellulare. È stato ampiamente utilizzato nell'analisi dei tessuti sia umani che murini1,2,3. Tuttavia, come altri marcatori di proliferazione generale, Ki67 non discerne singole fasi del ciclo cellulare. Un approccio più preciso utilizza l'incorporazione di analoghi nucleotiditici tiofini come Bromodeoxyuridina (BrdU) in cellule che stanno replicando attivamente il loro genoma (cioè, S-fase)4,5. Uno svantaggio dell'uso di analoghi nucleotidi è la necessità di somministrarli agli animali vivi ore prima dell'analisi. Ki67 e BrdU sono comunemente rilevati su sezioni di tessuto fisso dall'uso di anticorpi. Un vantaggio di questo approccio è che la posizione dei POI può essere accertata all'interno dell'architettura dei tessuti (ad esempio, lo strato basale dell'epidermide cutanea). Questo approccio inoltre non richiede la dissociazione dei tessuti che può portare a cambiamenti nell'espressione genica. Uno svantaggio è che la fissazione dei tessuti o l'elaborazione del tessuto per il congelato dello Strumento di personalizzazione di Office o la sezionamento della paraffina possono occludere i bersagli degli anticorpi (ad esempio, gli antigeni). Il recupero degli antigeni richiede in genere la digestione di calore o tessuto. Anche la quantificazione delle intensità di colorazione può essere difficile. Ciò è dovuto alle variazioni nella colorazione, nello spessore della sezione, nel rilevamento del segnale e nella distorsione dello sperimentatore. Inoltre, un numero limitato di marcatori può essere rilevato contemporaneamente nella maggior parte delle configurazioni di laboratorio tipiche. Tuttavia, gli approcci di colorazione multiplex più recenti promettono di superare questi limiti; esempi sono la citometria di massa di imaging e l'amplificazione del segnale Tyramide6,7.

La citometria di flusso è un'altra potente tecnologia per rilevare le cellule che proliferano. Permette il rilevamento multiplex di marcatori nelle stesse cellule, ma richiede la dissociazione dei tessuti per la maggior parte dei tipi di cellule non ematopoietiche. L'analisi delle cellule che proliferano viene eseguita regolarmente mediante l'uso di coloranti che legano il DNA (ad esempio, Propidium Iodide (PI))8. La citometria di flusso permette anche una determinazione più precisa delle fasi del ciclo cellulare quando accoppiato con il rilevamento dell'incorporazione BrdU9. Anche se un approccio potente, la citometria di flusso BrdU/PI ha i suoi svantaggi. Non è in grado di risolvere le fasi G2/M e G0/G1 senza l'inclusione di anticorpi specifici per fase. Tuttavia, il numero di anticorpi che possono essere utilizzati è limitato dall'autofluorescenza cellulare, dalla fuoriuscita spettrale delle emissioni di fluoroforo e dall'uso di controlli di compensazione. Questa limitazione segna più difficile e laborioso rilevare co-rilevare l'espressione dei marcatori del ciclo cellulare con i POI. Un approccio più facile è quello di utilizzare la citometria di massa10,11. Questa tecnologia utilizza anticorpi coniugati in metallo che hanno uno spettro di rilevamento più stretto. Una volta che le cellule sono macchiate con anticorpi marcati metallici, vengono vaporizzate e i metalli rilevati dalla spettrometria di massa del tempo di volo della citometria (CyTOF). A causa di queste proprietà, la citometria di massa consente il rilevamento multiplex di >40 marcatori diversi utilizzando piattaforme esistenti10,11. Inoltre, è possibile codici a barre campioni con metalli che si traducono in risparmio di anticorpi preziosi, riducendo al contempo la variabilità di colorazione da campione a campione. D'altra parte, la citometria di massa ha diversi svantaggi. Ci sono un numero limitato di anticorpi con etichettatura metallica disponibile in commercio per le cellule non derivate dal sangue. La quantificazione del contenuto del DNA è meno sensibile rispetto all'uso di coloranti del DNA fluorescente e la citometria di massa ha una gamma dinamica ridotta di rilevamento del segnale rispetto alla citometria del flusso di fluorescenza.

Il protocollo qui descritto è stato progettato per analizzare la dinamica del ciclo cellulare dai cheratinociti appena isolati (KC) dalla pelle del topo e caratterizzare l'espressione della proteina specifica del ciclo cellulare in queste cellule usando la citometria di massa. Questo protocollo può essere utilizzato anche con cellule coltivate o adattato ad altri tipi di cellule.

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Protocollo

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Il Comitato istituzionale per la cura e l'uso del campus medico dell'Università del Colorado ha approvato gli esperimenti sugli animali descritti in questo protocollo.

1. Preparativi

  1. Progettare un pannello anticorpo con tag metallici. Utilizzare il software di progettazione pannello online gratuito12 e includere 127IododeoxyUridina (IdU), 164Dy (Dysprosium) etichettato anti-CCNB1 (CYCLIN B1), 175Lu (Lutetium) phospho (p)-HISTONEH3Ser28 (pHH3), e 150 Nd (Neodymium)-pRETINOBLASTOMA proteinaSer807/811 (pRB)13. Aggiungere altri anticorpi con etichetta metallica che non si sovrappongono nel segnale di canale14.
  2. Preparare una soluzione stock IdU. Sciogliere la polvere IdU a 10 mg/mL in 0,1 N NaOH a 60 gradi centigradi. Soluzione di stock Aliquot IdU in tubi di microcentrismo e congelare a -20 gradi centigradi per lo stoccaggio a lungo termine.
    1. Regolare il pH della soluzione IdU a 7,5 con 12 N HCl immediatamente prima dell'uso. Testare con una striscia di pH su uno scarto per assicurarsi che la soluzione sia a pH 7.5.
      NOTA: Il tempo prolungato (>5 min) di IdU a pH 7.5 comporterà precipitazioni e una nuova aliquota di IdU è necessaria quando questo accade.
    2. Utilizzare adeguate dispositivi di protezione personale (ad esempio, guanti, camice da laboratorio e occhiali di sicurezza) e lavorare in un armadietto di sicurezza nella movimentazione di soluzioni NaOH o HCl.
  3. Preparare una soluzione di fissaggio di paraformaldeide 2x (PFA). Combinare 5 mL di 10x PBS (pH 7.5) e 1 mL di 16% PFA con 44 mL di grado molecolare puro dH2O (3,2% concentrazione finale).
    NOTA: Uno stock di PFA può essere preparato come pubblicato in precedenza15 o acquistare il 16% di scorte prive di metalli contaminati.
    1. Utilizzare adeguate attrezzature di protezione personale e lavorare in un armadio di sicurezza durante la movimentazione di polvere e soluzioni PFA.
  4. Preparare il barium (Ba2 )gratuito 1x PBS combinando 5 mL di 10x PBS (pH 7.5) senza metalli con 45 mL di puro grado molecolare dH2O.
    NOTA: La qualità di PBS e di altri reagenti è molto importante per evitare di contaminare i metalli che possono introdurre rumore di fondo durante l'analisi dei dati citometrici di massa.
  5. Preparare una soluzione di 100 mm di cisplatina. Sciogliere 300.5 mg di cisplatina polvere in 10 mL di DMSO. Conservare in aliquote a -80 gradi centigradi. Preparare una soluzione di lavoro cisplatina da 10 mM per esperimenti da utilizzare oltre 1 d.
  6. Preparare soluzioni di separazione epidermide/dermide. Preparare una soluzione di stock 20x dispase sciogliendo 30 mg in 1 mL di HBSS o PBS. Filtrare sterilizzare attraverso un filtro di 0,22 m e conservare in aliquote a -20 gradi centigradi. Preparare una soluzione di brodo di collagenasi di tipo 1x IV a 1 mg/mL in HBSS, filtrare sterilizzare attraverso un filtro da 0,22 m e conservare le aliquote a -20 gradi centigradi.

2. Etichettatura della fase S per incorporazione IdU

  1. Pesare i topi. Utilizzare p1-P3 cuccioli neooatici o topi adulti di 8-10 settimane e utilizzare topi maschi o femmine da un C57BL/6, FvB, o 129 sfondi. Determinare una dose a 0,1 mg IdU (pH 7.5)/g peso corporeo. Ad esempio, un mouse da 25 g richiede 0,25 mL di IdU.
  2. Somministrare la dose di IdU mediante un'iniezione intraperitoneale e attendere 2 h prima della raccolta delle cellule. Utilizzare una siringa di tubercolina per iniettare cuccioli neooatali.
    NOTA: Una dose di 2 mg/mL di IdU può essere utilizzata con cellule di coltura tissutale con un'incubazione di 1 h a 37 gradi centigradi prima della raccolta e dell'etichettatura per la citometria di massa.

3. Isolamento delle celle per l'etichettatura

  1. Soluzioni stock disaffetto disaffetto e collagenase. Diluire la soluzione di stock 20x dispase a 1x (1,5 mg/mL) in STERILe HBSS o PBS. Tenere sul ghiaccio fino a quando pronto per l'uso.
  2. Combina 2 volumi di dispasi con 1 volume di collagene in un volume totale che permette alla pelle di galleggiare liberamente. Ad esempio, la digestione di 5 pelli di topo neonale può essere galleggiata su 8 mL di 1x dispase con 4 mL di collagene in un piatto Petri da 100 mm.
  3. Seguire i metodi approvati per eutanasia i topi sperimentali (ad esempio, il controllo del sovradosaggio/punta dell'isoflurano o l'inalazione di CO 2/lussazione cervicale). Pulire la pelle dell'orecchio adulto con una soluzione di iodio (vedi Tabella deimateriali) e risciacquare con acqua sterile quando le cellule isolate devono essere utilizzate per la coltura dei tessuti.
  4. Rimuovere chirurgicamente l'orecchio alla base (Figura 1A). Sciacquare le orecchie in PBS sterile quando le cellule isolate devono essere utilizzate per la coltura dei tessuti. Mettere su una piastra petri secco da 100 mm.
  5. Separare con cura anteriore dalla pelle posteriore creando inizialmente una tasca al centro o al bordo dell'area di taglio utilizzando pinze sottili e tirando i due lembi della pelle a parte ( Figura 1B-D). Procedere con entrambe le pelli anteriori e posteriori.
    NOTA: istruzioni dettagliate per sezionare la pelle di topo neoooattale sono fornite da Litchi et al.16 Inoltre, l'uso di un ambito di dissezione può aiutare nella separazione della pelle anteriore da posteriore e nell'identificazione dei lati epidermis/dermici pelle: i capelli sono visibili sul lato dell'epidermide, mentre il derma avrà un aspetto gelatinoso.
  6. Posizionare con attenzione le pelli anteriori e posteriori dell'orecchio con il lato derma della pelle che tocca la soluzione dispasi/collagenase ( Figura 1E). Utilizzare 1 mL sia per la pelle anteriore che posteriore di un singolo orecchio per pozzo di una piastra di coltura 12 bene. Incubare a 37 oC per 1 h. In alternativa, galleggiare pelli su 1x soluzione dispasi a 4 gradi centigradi per 16-18 h.
    NOTA: Lavorare in una cappa di coltura tissutale con tecnica sterile quando le cellule devono essere coltivate.
  7. Posizionare la pelle digerita con il lato dell'epidermide toccando la superficie di un piatto Petri pulito. Appiattire la pelle e far scorrere delicatamente il derisito fuori l'epidermide lavorando dal centro ai bordi in un modello circolare.
  8. Scartare il derma o digerirlo ulteriormente per liberare i fibroblasti per la coltura o l'analisi dei tessuti16.
    NOTA: Il derma sarà più scuro in apparenza e hanno una composizione gelatinosa e appiccicosa. Il derma dovrebbe facilmente staccarsi. Il fallimento o la difficoltà di rimuovere il derma suggerisce una digestione dei tessuti insufficiente. Tuttavia, l'incubazione estesa nel buffer di digestione ridurrà la vitalità cellulare. L'epidermide rimarrà sul piatto Petri e avrà un aspetto sbiancato.
  9. Sollevare delicatamente l'epidermide afferrando i bordi e staccarlo dalla superficie del piatto Petri. Posizionare con attenzione l'epidermide su una soluzione di distacco cellulare preriscaldata (vedere Tabella dei materiali) per 5 min a 37 o 20 min a RT. Utilizzare 500 l di soluzione di distacco cellulare per 2 epidermises dell'orecchio adulto per bene di una piastra di coltura 12 pozzi e utilizzare 750 L di distacco cellulare soluzione per una singola epidermide neooatale per pozzo di un piatto di 6 pozzi.
  10. Afferrare l'epidermide con pinze sterili e strofinare trascinando l'epidermide contro il fondo del piatto per dissociare le cellule. Aggiungere 1 mL di DMEM contenente l'1% di FBS (0,01 mL) e passare attraverso un setaccio di 40 celle in un tubo di raccolta. Sciacquare bene con altri 2 mL di DMEM e aggiungere alla sospensione cellulare.
  11. Centrifuga a 120 x g per 5 min. Aspirare il supernatante con attenzione.
  12. Risospendere il pellet cellulare in 1-2 mL di DMEM contenente l'1% di FBS. Determinare la cella e % conteggi di cellule vive utilizzando Trypan Blue e un emocitometro o un dispositivo di conteggio automatizzato. Cellule di Pellet come descritto al punto 3.11.
    NOTA: Dopo il passaggio 3.12, le cellule possono essere coltivate in supporti di coltura tissutale appropriati. 17 mi lato

4. Etichettatura Cisplatina per determinare le cellule vive / morte

  1. Risospendere 1-3 x 106 celle per 1 mL di DMEM contenente 25 cisplatin (2,5 - L di stock/mL). Incubare per 1 min e dissetare pipettando con un volume uguale di FBS (ad esempio, 1 mL).
  2. Centrifuga a 120 x g per 5 min. Decant supernatant in un becher contenente candeggina diluita e tubi invertiti per drenare la soluzione rimanente su un tovagliolo di carta. Toccare delicatamente per liberare la soluzione rimanente su pellet e sidewall del tubo.
  3. Risospendere il pellet cellulare in2 mL di PBS senza Ba 2. Cellule di Pellet come descritto nel passaggio 4.2.
    NOTA: Si consiglia di fissare le cellule se non possono essere macchiate immediatamente.

5. Fissazione delle cellule con etichetta cisplatin (opzionale)

  1. Risospendere 1-3 x 106 cellule con etichetta tura cisplatina in 1 mL di PBS senza Ba2. Vorticare le cellule a bassa potenza continua e aggiungere dropwise 1 mL (1 volume) del buffer di fissaggio PFA 2x. Incubare a RT per 10 min su una piattaforma a dondolo.
  2. Cellule di Pellet come descritto al punto 4.2, ma centrifugare a 500 x g per 5 min.
  3. Lavare le celle con2 mL di cellule PBS e pellet senza Ba 2, come descritto nel passaggio 5.2. Ripetere il passaggio 5.3 una volta.
  4. Risospendere il pellet in 2mL di PBS senza Ba 2. Conservare a 4oC per <3 d. Aggiungere FBS al 3% (ad esempio, 0,3 mL di FBS/mL di celle) del volume totale se si conserva più a lungo >3 d, quindi mescolare e congelare a -80 gradi centigradi.
    NOTA: la fissazione può influire sul rilevamento di alcuni incarnati. Gli effetti della fissazione sul segnale anticorpale devono essere determinati empiricamente.

6. Codifica a barre dei campioni (opzionale ma consigliato)

  1. Cellule di Pellet come descritto nel passaggio 5.2 e quindi risospendere 1-3 x 106 celle in 1 mL di 1x buffer di fissaggio (vedere Tabella dei materiali). Incubare a RT per 10 min.
  2. Lavare le celle con 1 mL di buffer permeabilizzazione del codice a barre (vedere Tabella dei materiali). Cellule di Pellet come descritto nel passaggio 5.2. Ripetere il passaggio 6.2 una volta.
  3. Aggiungete 100 l di buffer di permeabilizzazione del codice a barre ai codici a barre (vedere Tabella deimateriali)18 e mescolate immediatamente mentre le celle del passaggio 6.2 sono a pelletizzazione.
  4. Risospendere il pellet cellulare in un buffer di permeabilizzazione di 800 ll di codice a barre. Aggiungere la soluzione del codice a barre alle celle, mescolare e incubare a RT per 30 min. Pellet come descritto nel passaggio 5.2. Lavare nuovamente le celle in 2 mL di buffer di colorazione cellulare (vedere Tabella deimateriali) e pellet.
    NOTA: Fino a 20 campioni possono essere etichettati con varie combinazioni di metalli Palladium18. Altre strategie di codifica a barre sono descritte altrove15.

7. Etichettatura delle cellule per la citometria di massa

  1. Risospendere 1-3 x 106 celle in 1 mL di soluzione di lavoro buffer di colorazione dell'antigentà nucleare (vedere Tabella dei materiali). Combinare i campioni in un unico tubo per i passaggi successivi quando si utilizzano campioni con codice a barre. Incubare a RT per 30 min. Pellet come descritto nel passaggio 5.2.
  2. Risospendere 1-3 x 106 celle in 2 mL di buffer di permeabilizzazione della colorazione dell'antigen nucleare (vedere Tabella dei materiali). Scalare in base alle esigenze. Ad esempio, utilizzare 6 mL di buffer per 10 campioni combinati con un numero di celle di 9 x 106 celle. Pellet come descritto nel passaggio 5.2.
  3. Ripetere il passaggio 7.2. Vorticare delicatamente il pellet cellulare nel volume residuo lasciato nel tubo.
  4. Aggiungere 50 - L di cocktail anticorpale intracellulare per 1-3 x 106 cellule. Scalare in base alle esigenze. Ad esempio, utilizzare 150 l del cocktail anticorpale per 10 campioni combinati con un numero di cellule di 9 x 106 cellule. Mescolare e incubare a RT per 45 min. Aggiungere 2 mL di buffer di colorazione cellulare e pellet come descritto nel passaggio 5.2.
  5. Risospendere il pellet 1-3 x 106 celle in 2 mL di buffer di colorazione cellulare. Cellule di Pellet come descritto nel passaggio 5.2. Ripetere il passaggio 7.5 una volta.
    NOTA: Altre soluzioni tampone possono essere utilizzate per colorare la membrana extracellulare o i marcatori citolasmici e lo sperimentatore potrebbe dover ottimizzare la colorazione se è necessario rilevare gli epitopi in diverse posizioni cellulari. Le cellule possono anche essere fissate in PFA dopo il passaggio 7.5 quando si utilizzano celle vive per la colorazione.
  6. Risospendere 1-3 x 106 celle in 1 mL di soluzione di intercalazione e conservare per 1-3 d a 4 gradi centigradi.
    1. Conservare le celle a -80 gradi centigradi in DMSO contenente la soluzione per le celle >3 d. Pellet come descritto nel passaggio 5.2 se le cellule sono in soluzione di intercalazione. Risospendere il pellet (1-3 x 106 celle) in 1 mL di celle di colorazione cellulare e di pellet come descritto nel passaggio 5.2. Resuspend pellet in 1 mL del 10% DMSO/90% FBS19, trasferire in un crioviale, mettere in un contenitore di congelamento isopropanolo, e conservare a -80 .
  7. Cellule di Pellet come descritto nel passaggio 5.2. Lavare 1-3 x 106 celle con 2 mL di buffer di colorazione cellulare, pellendo come descritto nel passaggio 5.2. Eseguire due lavature aggiuntive con 2 mL di acqua, pellendo come descritto nel passaggio 5.2.
  8. Diluire le perline di calibrazione EQ 1:9 in acqua (soluzione di riserva a 3,3 x 105 perline/mL).
  9. Risospendere il pellet cellulare a una concentrazione di 1 x 106 cellule/mL con soluzione diluita perline EQ. Filtrare le cellule attraverso tubi di flusso del farro da 35 m.
  10. Eseguire campioni sul citometro di massa e acquisire dati. I dati verranno depositati in un formato di file Flow Cytometry Standard (FCS).

8. Elaborazione e analisi dei file di dati di citometria di massa

  1. Normalizzare i file FCS. Utilizzare un programma gratuito disponibile allhttps://github.com/nolanlab/bead-normalization/releases/latest20
  2. Deconvolute file FCS con codice a barre. Separare la popolazione di codici a barre raggruppati in file con codice a barre separati con un programma gratuito disponibile allhttps://github.com/nolanlab/single-cell-debarcoder/releases/latest18
  3. Analizzare i file FCS normalizzati. Utilizzare programmi commerciali21,22 o freeware (vedi web.stanford.edu/group/nolan/resources.html).

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Risultati

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La tabella 1 mostra le rese cellulari e la fattibilità previste dall'orecchio adulto del topo (Figura 1) e dalla pelle neoatale in condizioni non patologiche. La tabella mostra anche i dati rappresentativi degli animali provenienti da uno sfondo misto C57/126. Si prevede che la pelle di altri ceppi si tradurrà in rese cellulari e vitalità simili. La resa approssimativa dipende dalla superficie della pelle e indica che la pelle neonale sarebbe...

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Discussione

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Il protocollo descritto in questo documento può essere completato in circa 8 ore. Il risultato finale è una sospensione delle cellule arricchite in PC che possono essere analizzati per l'espressione proteica in modo dipendente dal ciclo cellulare. Diversi studi precedenti hanno delineato metodi per isolare i K dalla pelle umana e del topo16,25. Questi studi includono anche protocolli per l'isolamento dei KC per la citometria di flusso26. T...

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

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Il sostegno a questo lavoro è stato fornito dal Dipartimento di Dermatologia, dal Gates Center for Regenerative Medicine presso l'Università del Colorado (UC) Skin Disease Center Morphology and Phenotyping Cores (NIAMS P30 AR057212). Gli autori riconoscono la sovvenzione di supporto e risorsa di supporto Cytometry Shared Resource and support (NCI P30 CA046934) per il funzionamento del citometro di massa e sono grati per Karen Helm e Christine Childs al centro per i loro consigli di esperti sul flusso e sulla citometrica di massa Tecniche.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Piastra a 12 pozzettiCell Treat229512
Soluzione intercalatriceFluidigm201192A125 &; M - Soluzione intercalatrice Ir
Microscopia elettronicaParaformaldeideScienze 30525-89-416 %  PFA
Tappo filtro tubi di flussoFisher/Corning35223535 &; m dimensione dei pori 
Setaccio per celleFisher2236354740 μ m dimensione dei pori 
Soluzione di distacco cellulareCELLnTECCnT-ACCUTASE-100accutasio
ThermoFisher/Purdue67618-151-17Betadine 7,5%-iodio scrub chirurgico
Tampone di permeabilizzazione del codice a barre Fluidigm201060Cell-ID 20-Plex Pd Barcoding Kit
Codici a barreFluidigm201060Cell-ID 20-Plex Pd Barcoding Kit
Strisce pHEMD9590colorpHast
DMEMHycloneSH30022.01Dulbecco' s Eagle Media
modificato Pinza fineDumont & Fils0109-5-PODumostar #5
Pinza curva di precisioneDumont & Fils0109-7-PODumostar #7
Perle di calibrazioneFluidigm201078EQ Perle di calibrazione a quattro elementi
HBSSGibco14175-095Hank's Balanced Salt Solution
WaterFisherSH30538.03Hyclone Acqua di grado di biologia molecolare
Iododeossiuridina  SigmaI7125IdU
Fiale criogenicheThermoFisher366656PKfilettatura interna
Tampone di colorazione cellulareFluidigm201068Maxpar Tampone di colorazione cellulare
Fix & tampone permanenteFluidigm201067Maxpar Fix & Tampone permanente
Fix I tamponeFluidigm201065Maxpar Fix I tampone
Soluzione salina tamponata con fosfatoRocklandMB-00810x PBS senza metallo
ThermoFisher5100-0001Mr.Frosty
Idrossido di sodioFisherBP359-500
Piastra di PetriNaOH Kord-Valmark2900Fornito da Genesee 32-107 
15 mL conicoOlympus/Genesee28-101
50 mL conicoOlympus/Genesee28-106
piastra a 6 pozzettiCell Treat229506
CisplatinoSigma479306
Dispase IISigma/Roche4942078001
DMSOSigmaD2650
FBSAtlanta BiologicalsS11150
Acido cloridricoFisherA144-212
Tampone di permeabilizzazione per colorazione con antigene nucleareFluidigm201063
Tampone per colorazione con antigene nucleareFluidigm201063
Trypan blueSigmaT8154
Siringa per tubercolinaBD309626
Collagenasi di tipo IVWorthington BioscienceCLSS-4
Soluzione di iodio Contenitore per il congelamento dell'isopropanolo

Riferimenti

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  1. Guzinska-Ustymowicz, K., Pryczynicz, A., Kemona, A., Czyzewska, J. Correlation between proliferation markers: PCNA, Ki-67, MCM-2 and antiapoptotic protein Bcl-2 in colorectal cancer. Anticancer Research. 29 (8), 3049-3052 (2009).
  2. Ladstein, R. G., Bachmann, I. M., Straume, O., Akslen, L. A. Ki-67 expression is superior to mitotic count and novel proliferation markers PHH3, MCM4 and mitosin as a prognostic factor in thick cutaneous melanoma. BioMedCentral Cancer. 10, 140(2010).
  3. Ryan, W. K. Activation of S6 signaling is associated with cell survival and multinucleation in hyperplastic skin after epidermal loss of AURORA-A Kinase. Cell Death & Differentiation. , (2018).
  4. Magaud, J. P. Double immunocytochemical labeling of cell and tissue samples with monoclonal anti-bromodeoxyuridine. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 37 (10), 1517-1527 (1989).
  5. Dolbeare, F., Gratzner, H., Pallavicini, M. G., Gray, J. W. Flow cytometric measurement of total DNA content and incorporated bromodeoxyuridine. Proc Natl Acad Sci U S A. 80 (18), 5573-5577 (1983).
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