Abbiamo offerto esche da vaccino per la rabbia placebo delle manguste in cetticone con acido iofenico etilico o metilico come biomarcatore e l'assorbimento verificato delle esche utilizzando una nuova cromatografia liquida con spettrometria di massa tandem (metodo LC-MS/MS).
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Articolo metodologico
Analisi degli analoghi dell'acido iofenostico nella piccola mangusta indiana (Herpestes Auropunctatus) Sera per l'uso come marcatore biologico di vaccinazione della rabbia orale
In questo articolo
Sommario
Abstract
La piccola mangusta indiana(Herpestes auropunctatus) è un serbatoio di virus della rabbia (RABV) a Porto Rico e comprende oltre il 70% dei casi di rabbia animale segnalati annualmente. Il controllo della circolazione RABV nei serbatoi di fauna selvatica è in genere realizzato da una strategia di vaccinazione orale alla rabbia (ORV). Attualmente non esiste alcun programma ORV di fauna selvatica a Porto Rico. È stata condotta una ricerca sui vaccini per la rabbia orale e vari tipi di esche per le manguste con risultati promettenti. Il monitoraggio del successo dell'ORV si basa sulla stima dell'assorbimento delle esche da parte delle specie bersaglio, che in genere comporta la valutazione di un cambiamento negli anticorpi di neutralizzazione RABV (RVNA) dopo la vaccinazione. Questa strategia può essere difficile da interpretare in aree con un programma attivo ORV di fauna selvatica o in aree in cui RABV è enzootico e i livelli di fondo di RVNA sono presenti nelle specie di bacino. In tali situazioni, un biomarcatore incorporato con il vaccino o la matrice di esche può essere utile. Abbiamo offerto 16 manguste in cattività esche placebo ORV contenenti acido etilico-iofenico (et-IPA) in concentrazioni dello 0,4% e 1% all'interno dell'esca e dello 0,14% nella matrice esterna dell'esca. Abbiamo anche offerto 12 manguste in cattività esche ORV contenenti acido metilico-fenossia (me-IPA) in concentrazioni di 0,035%, 0,07% e 0,14% nella matrice di esca esterna. Abbiamo raccolto un campione di siero prima dell'offerta di esche e poi settimanalmente per un massimo di otto settimane dopo l'offerta. Abbiamo estratto gli acidi iofenossia dalla sera in acetonitrile e quantificato usando cromatografia liquida/spettrometria di massa. Abbiamo analizzato sera per et-IPA o me-IPA da spettrometria di cromatografia-massa liquida. Abbiamo trovato un'adeguata capacità di marcatura per almeno otto e quattro settimane rispettivamente per et- e me-IPA. Entrambi i derivati IPA potrebbero essere adatti per la valutazione sul campo dell'assorbimento delle esche ORV nelle manguste. A causa della longevità del marcatore in mangusta sera, bisogna fare attenzione a non confondere i risultati utilizzando lo stesso derivato IPA durante le valutazioni consecutive.
Introduzione
Il virus della rabbia (RABV) è un lyssavirus singolo spiaggiato e circola tra diverse specie di bacini naturali all'interno degli ordini Carnivora e Chiroptera. Molteplici specie di manguste sono serbatoi di RABV, e la piccola mangusta indiana (Herpestes auropunctatus) è l'unico serbatoio in Porto Rico e altre isole caraibiche nell'emisfero occidentale1,2,3 . Il controllo della circolazione RABV nei serbatoi di fauna selvatica è in genere realizzato attraverso una strategia di vaccinazione orale della rabbia (ORV). Negli Stati Uniti (STATI Uniti), questa attività di ....
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Protocollo
Tutte le procedure sono state approvate dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali dell'USDA National Wildlife Research Center nell'ambito del protocollo di ricerca QA-2597.
NOTA: Il seguente protocollo descrive la procedura di analisi per rilevare l'acido metilico-fenossia nel siero di mangusta. Questo metodo è la versione finale di un processo iterativo che ha avuto inizio con l'analisi dell'acido etilico-fenofenico nel siero mangusta. Durante la valutazione iniziale dell'acido etilico-iofenico sono state apportate piccole modifiche ai metodi, con conseguente protocollo finale presentato di seguito. I risultati rappresen....
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Risultati
I cromatogrammi ionici rappresentativi da un'analisi me-IPA sono presentati nella Figura 1. Il siero di manguste di controllo (Figura 1A) illustra il tempo di conservazione di et-IPA (analitico surrogato) e l'assenza di me-IPA al tempo di conservazione indicato. L'esempio di controllo qualità (Figura 1B) illustra la separazione di base di me-IPA da et-IPA, nonché le transizioni di quantificatore e qu.......
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Discussione
Il metodo LC-MS/MS sviluppato per gli studi ha utilizzato la selettività del monitoraggio della reazione multipla per quantificare con precisione me-IPA ed et-IPA nel siero di mangusta. La selettività del rilevamento MS/MS ha anche permesso un semplice protocollo di pulizia basato esclusivamente sull'acetonitrile per far precipitare le proteine dal siero prima dell'analisi.
Gli acidi ifenossia sono solubili in ACN ma sono praticamente insolubili in acqua. Per escludere l'acqua dall'estrazione .......
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Dichiarazioni
Gli autori AV e SO sono dipendenti a tempo pieno di un produttore di esche vaccino rabbia orale.
Ringraziamenti
Questa ricerca è stata sostenuta in parte dal programma di ricerca intramurale del Dipartimento dell'Agricoltura degli Stati Uniti, servizio di ispezione della salute animale e vegetale, servizi naturali, programma nazionale di gestione della rabbia e IDT Biologika (Dessau-Rosslau, Germania).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Acetonitrile, grado Optima Fisher | A996 | ||
| Bilancia analitica | Mettler Toledo | XS204 | |
| C18 colonna, 2,1 x 50 mm, 2,5-µ m granulometria | Waters Corp. | ||
| Fonte ESI | Agilent | G1958-65138 | |
| Acido etil-iofenossico, 97 % | Sigma Aldrich | N/A | Lot MKBP5399V |
| Acido formico, grado LC/MS | Fisher | A117 | |
| Software LCMS | Agilent | MassHunter Acquisizione dati e analisi | |
| Acido metil-iofenossico, 97 % (p/p) | PR EuroChem Ltd. | N/A | Lotto PR0709514717 |
| Bilancia microanalitica | Mettler Toledo | XP6U | |
| Microcentrifuga | Eppendorf | 5415C | |
| MS/MS | Agilent | G6470A | |
| N-Evap | Organomation | 115 | |
| Esche orali per il vaccino contro la rabbia | IDT Biologika, Dessau Rossleau, Germany | N/A | |
| Acido propil-iofenossico, 99 % (p/p) | PR EuroChem Ltd. | N/A | Lotto PR100612108RR |
| pipettatore ripetuto | Eppendorf | M4 | |
| tappi per fiale per autocampionatore a vite, rivestito in PTFE | Agilent | 5190-7024 | |
| cloruro di sodio, certificato ACS grado | Fisher | S271 | |
| Pacchetto software statistico | SAS Institute, Cary, North Carolina, USA | N/A | |
| Acido trifluoroacetico, 99 % | Alfa Aesar | L06374 | |
| UPLC | Agilent | 1290 Series | |
| Vortex Mixer | Glas-Col | 099A PV6 | |
| Puntali per pipettatore da 0,2 mL | Eppendorf | 30089.413 | |
| Puntali per pipettatore da 0,5 mL | Eppendorf | 30089.421 | |
| Provette per microcentrifuga da 1,5 mL | Fisher | 14-666-325 | |
| 1250-& micro; Puntali per pipette con capacità L | GeneMate | P-1233-1250 | |
| Puntali per pipettatore da 1 mL | Eppendorf | 30089.43 | |
| Fiale per autocampionatore con tappo a vite ambrato da 2 mL | Agilent | 5182-0716 | |
| Puntali per pipettatore da 5 mL | Eppendorf | 30089.456 | |
| Rack per provette per microcentrifuga a 80 posizioni | Fisher | 05-541-2 | |
| Fiale ambrate da 8 mL con Tappi rivestiti in PTFE | Wheaton | 224754 | |
| 70 % (v/v) isopropanolo | Fisher | A459 | |
| 100-1000 &; Pipetta a spostamento d'aria L | Eppendorf | ES-100 |
Riferimenti
- Nel, L. H., et al. Mongoose rabies in southern Africa: a re-evaluation based on molecular epidemiology. Virus Research. 109 (2), 165-173 (2005).
- Zieger, Z., et al. The phylogeography of rabies in Grenada, W....
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Ristampe e permessi
