HOX Loci Focused CRISPR/sgRNA biblioteca Screening identificazione critico CTCF confini

Huacheng Luo; Amin Sobh; Christopher  D. Vulpe; Edmond Brewer; Sinisa Dovat; Yi Qiu; Suming Huang

doi:10.3791/59382

Method Article

HOX Loci Focused CRISPR/sgRNA biblioteca Screening identificazione critico CTCF confini

DOI:

10.3791/59382

⸱

March 31st, 2019

Huacheng Luo¹ , Amin Sobh² , Christopher D. Vulpe² , Edmond Brewer¹ , Sinisa Dovat¹ , Yi Qiu³ , Suming Huang¹

¹Department of Pediatrics, Pennsylvania State University College of Medicine, ²Department of Physiological Sciences, University of Florida, ³Department of Anatomy and Cell Biology, University of Florida

Summary

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Una libreria CRISPR/sgRNA è stata applicata a interrogare i geni di proteina-codificazione. Tuttavia, la fattibilità di una libreria di sgRNA per scoprire la funzione di un confine CTCF nella regolazione genica rimane inesplorata. Qui, descriviamo una raccolta di specifiche sgRNA loci HOX per delucidare la funzione dei confini CTCF in loci HOX .

Abstract

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CCCTC-associazione fattore (CTCF)-mediata stabile topologicamente associando i domini (TADs) svolgono un ruolo critico in costrittive interazioni degli elementi di DNA che si trovano nella vicina TADs. CTCF svolge un ruolo importante nel regolare l'espressione spaziale e temporale dei geni HOX che controllano lo sviluppo embrionale, patterning di corpo, ematopoiesi e leukemogenesis. Tuttavia, rimane in gran parte sconosciuto se e come i confini HOX loci associati CTCF regolano organizzazione della cromatina ed espressione genica HOX . Nel protocollo attuale, una libreria in pool specifico sgRNA targeting per tutti i siti di legame di CTCF nei loci HOXA/B/C/D è stata generata per esaminare gli effetti di turbare i confini di cromatina CTCF-collegata sulla formazione di TAD e gene HOX espressione. Attraverso CRISPR-Cas9 screening genetico, il sito di legame di CTCF situato tra geni HOXA7/HOXA9 (CBS7/9) è stato identificato come un regolatore critico del dominio della cromatina oncogeno, oltre ad essere importante per mantenere un gene HOX ectopico modelli di espressione in MLL-riorganizzate leucemia mieloide acuta (AML). Così, questa libreria sgRNA approccio di screening fornisce nuove conoscenze sulla organizzazione di genoma CTCF mediata in loci genici specifici e inoltre fornisce una base per la caratterizzazione funzionale degli elementi normativi genetici con annotazioni, entrambi di codifica e non codificante, durante i normali processi biologici in epoca di progetto genoma post-umano.

Introduction

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Recenti studi di interazione tra genoma ha rivelato che le forme di genoma nucleare stabili topologicamente associando domini (TADs) che sono conservati attraverso specie e tipi di cellule. L'organizzazione del genoma in domini distinti facilita e limita le interazioni tra elementi normativi (ad es., esaltatori e promotori). Il fattore di CCCTC-associazione (CTCF) si lega ai limiti di TAD e svolge un ruolo critico in costrittive interazioni degli elementi di DNA che si trovano nella vicina TADs¹. Tuttavia, il genoma vasta CTCF associazione dati hanno rivelato che sebbene CTCF interagisce principalmente con gli stessi siti di DNA in diversi tipi....

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Protocol

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1. CTCF sgRNALibrary Design utilizzando uno strumento Online

Progettare il sgRNA targeting siti di legame di CTCF nei loci HOX umani utilizzando lo strumento di progettazione genetica perturbazione piattaforma (GPP) (https://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/sgrna-design).
Sintetizzare un totale di 1.070 sgRNAs composto sgRNAs targeting 303 geni targeting casuale, 60 controlli positivi, 500 controlli non-Human Target e 207 elementi CTCF o lncRNA targeting geni (Figura 1, tabella 1). Ogni elemento di DNA targeting è bersagliato da 5-10 differenti sgRNAs.

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Results

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La tecnologia CRISPR-Cas9 è un potente strumento di ricerca per gli studi di genomici funzionali. Si sta rapidamente sostituendo il gene convenzionali tecniche di editing ed ha alta utilità per applicazioni orientate al gene genoma e individuali. Qui, la prima individualmente clonato loci specifici CRISPR-Cas9-schierati sgRNA libreria contiene 1.070 sgRNAs composto sgRNAs targeting 303 geni targeting casuale, 60 controlli positivi, 500 controlli non-Human Target e 207 elementi CTCF o lncR.......

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Discussion

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Proteina-codificazione gene relativo sgRNA librerie sono state applicate in un sistema di screening funzionale all'identificazione di geni e i networks che regolano specifiche funzioni cellulari attraverso sgRNA arricchimento²⁴^,²⁵^,²⁶ ^,²⁷^,²⁸. Regione non codificante diversi correlati sgRNA librerie inoltre sono state indicate nelle schermate funzionale gene-sp.......

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Disclosures

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Non abbiamo conflitti di interesse relativi alla presente relazione.

Acknowledgements

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Gli autori ringraziano anche Nicholas Cesari per il manoscritto di editing. Il lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dal National Institute of Health (S.H., R01DK110108, R01CA204044).

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Materials

List of materials used in this article
Name	Company	Catalog Number
Reagente Lipofectamina 3000	Thermo Fisher Scientific	L3000-008
Proteinasi K	Thermo Fisher Scientific	25530049
Puromicina	Thermo Fisher Scientific	A1113802
cellule Stbl3	Tecnologie per la vita
HEK293T	ATCC	CRL-3216
MOLM-13	DSMZ	ACC 554
lentiCRISPRv2	Addgene	52961
pMD2.G	Addgene	12259
psPAX2	Addgene	12260
pGEM®-T Easy Vector Systems	Promega	A137A
T4 ligasi	New England Biolabs	M0202S
Kit per estratto di gel QIAquick	QIAGEN	28706
Kit di purificazione QIAuick PCR	QIAGEN	28106
SingleShot™ SYBR® Kit Verde One-Step	Bio-Rad Laboratories	1725095
QIAGEN Maxi Kit Plasmidico	QIAGEN	12163
Dulbecco' s Aquila modificata media	Thermo Fisher Scientific
RPMI 1640	Thermo Fisher Scientific	11875093
Siero fetale bovino (FBS)	Thermo Fisher Scientific	10-082-147
Penicillina/streptomicina/L-glutammina	Tecnologie per la vita
concentratore Lenti-X	Clontech	631232
Soluzione blu di tripano	Thermo Fisher Scientific	15250061
Polybrene	Santa Cruz Biotechnology	sc-134220
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)	Genessee Scientific	25-507
tampone TAE	Thermo Fisher Scientific	FERB49
Geometra Kit di rilevamento delle mutazioni Tecnologie	DNA integrate	706020
Biorad Universal Hood II Gel Doc System	Bio-Rad	170-8126
Centrifuga 5424 R	Eppendorf	5404000138
Bagni a secco/riscaldatori a blocchi digitali Thermo	Fisher Scientific	88870002
Congelatori ultra-bassi serie TSX	Thermo Fisher Scientific	TSX40086V
Forma&commercio; Steri-Culto & commercio; CO₂ Incubatrici	Thermo Fisher Scientific	3308
Herasafe™ KS, Cabina di Sicurezza Biologica Classe II	Thermo Fisher Scientific	51022484
Sorvall™ Leggenda e commercio; Centrifuga XT/XF Serie	Thermo Fisher Scientific	75004506
Fisherbrand™ Isotemp&commercio; Bagni d'acqua	Thermo Fisher Scientific	FSGPD02
Thermo Scientific™ Localizzatore e commercio; Plus Sistemi rack e box	Thermo Fisher Scientific	13-762-353
CFX96 Touch Sistema di rilevamento PCR in tempo reale	Bio-Rad	1855195
MiniAmp™ Termociclatore	Applied Biosystems technology	A37834
Thermo Scientific™ Gufo&commercio; EC300XL2 alimentatore compatto	Thermo Fisher Scientific	7217581
Thermo Scientific™ Gufo&commercio; EasyCast&commercio; B1 Mini Sistemi di Elettroforesi su Gel	Thermo Fisher Scientific	09-528-178
VWR® Rotatore per tubi e girarrosti	VWR International	10136-084
VWR® Mini agitatore in incubazione	VWR International	12620-942
Bilancia analitica MS104TS/00	METTLER TOLEDO	30133522
Spettrofotometro DS-11 FX e DS-11 FX+	DeNovix Inc.	DS-11 FX

C7373031196508410378016

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dixon, J. R., et al. Topological domains in mammalian genomes identified by analysis of chromatin interactions. Nature. 485 (7398), 376-380 (2012).
Cuddapah, S., et al. Global an....

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