Microscopia di tracciamento a singola molecola - Uno strumento per determinare gli stati diffusivi delle molecole citosoliche

Summary

La microscopia di localizzazione 3D a molecola singola viene utilizzata per sondare le posizioni spaziali e le traiettorie di movimento delle proteine fluorescenti etichettate nelle cellule batteriche viventi. Il protocollo sperimentale e di analisi dei dati descritto nel presente documento determina i comportamenti diffusivi prevalenti delle proteine citosoliche basate su traiettorie a singola molecola raggruppate.

Abstract

La microscopia di localizzazione a singola molecola sonda la posizione e i movimenti delle singole molecole nelle cellule viventi con decine di nanometri di risoluzione spaziale e temporale al millisecondo. Queste capacità rendono la microscopia di localizzazione a singola molecola ideale per studiare le funzioni biologiche a livello molecolare in ambienti fisiologicamente rilevanti. Qui, dimostriamo un protocollo integrato per l'acquisizione e l'elaborazione/analisi di dati di tracciamento a singola molecola per estrarre i diversi stati diffusive che una proteina di interesse può mostrare. Queste informazioni possono essere utilizzate per quantificare la formazione di complessi molecolari nelle cellule viventi. Forniamo una descrizione dettagliata di un esperimento di localizzazione 3D a singola molecola basato su telecamera, così come le successive fasi di elaborazione dei dati che producono le traiettorie delle singole molecole. Queste traiettorie vengono quindi analizzate utilizzando un quadro di analisi numerica per estrarre gli stati diffusi prevalenti delle molecole fluorescenti etichettate e l'abbondanza relativa di questi stati. Il quadro di analisi si basa su simulazioni stocastiche di traiettorie di diffusione browniana intracellulari che sono confinate spazialmente da una geometria cellulare arbitraria. Sulla base delle traiettorie simulate, le immagini a singola molecola grezze vengono generate e analizzate allo stesso modo delle immagini sperimentali. In questo modo, le limitazioni sperimentali di precisione e precisione, che sono difficili da calibrare sperimentalmente, sono esplicitamente incorporate nel flusso di lavoro di analisi. Il coefficiente di diffusione e le frazioni di popolazione relativa degli stati diffusi sono determinati adattando le distribuzioni di valori sperimentali utilizzando combinazioni lineari di distribuzioni simulate. Dimostriamo l'utilità del nostro protocollo risolvendo gli stati diffusivi di una proteina che presenta diversi stati diffusi dopo la formazione di complessi omo- ed etero-oligomerici nel citosol di un patogeno batterico.

Introduction

L'esame del comportamento diffuso delle biomolecole fornisce informazioni sulle loro funzioni biologiche. Le tecniche basate sulla microscopia a fluorescenza sono diventate strumenti preziosi per osservare le biomolecole nel loro ambiente cellulare nativo. Il recupero della fluorescenza dopo la fotobleaching (FRAP) e la spettroscopia di correlazione della fluorescenza (FCS)¹ forniscono comportamenti diffusischi con la media dell'insieme. Al contrario, la microscopia di localizzazione a singola molecola consente l'osservazione di singole molecole fluorescenti con alta risoluzione spaziale e temporale^2,

Protocol

1. Calibrazione a doppia elica point-spread-function

NOTA: le immagini descritte in questa e nelle sezioni seguenti vengono acquisite utilizzando un microscopio a fluorescenza invertito personalizzato, come descritto in Rocha et al.²³. La stessa procedura è applicabile a diverse implementazioni al microscopio progettate per la localizzazione di una singola molecola e la microscopia di tracciamento^2,3,4. Tutto il software per l'acquisizione di immagini e l'elaborazione dei dati descritto in questo articolo è disponibile (https:....

Results

Nelle condizioni sperimentali qui descritte (20.000 fotogrammi, lunghezza minima di 4 localizzazioni) e a seconda dei livelli di espressione delle proteine di fusione fluorescenti, circa 200-3.000 localizzazioni che producono 10-150 le traiettorie possono essere generate per cella (Figura 2a,b). Un gran numero di traiettorie è necessario per produrre una distribuzione ben campionata di coefficienti di diffusione apparente. La dimensione del F.......

Discussion

Un fattore critico per la corretta applicazione del protocollo presentato è quello di garantire che i segnali a singola molecola siano ben separati l'uno dall'altro (cioè, devono essere sparse nello spazio e nel tempo (Supplementary Mov. 1)). Se c'è più di una molecola fluorente in una cellula allo stesso tempo, la localizzazione potrebbe essere erroneamente assegnata alla traiettoria di un'altra molecola. Questo è indicato come il problema di collegamento³⁰. Per evitare il proble.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acido 2,6-diaminopimelico	Chem Impex International	5411	Necessario per la crescita delle cellule Y. enterocolitica utilizzate.
Lenti 4f	Thorlabs	AC508-080-A	f = 80mm, laser 2"
514 nm	Coherent	Genesis MX514 MTM	Utilizzo per eccitazione a fluorescenza
agarosio	Inivtrogen	16520100	Utilizzato per realizzare cuscinetti in gel per montare campioni batterici liquidi al microscopio.
Cloruro di ammonio	Sigma Aldrich	A9434	M2G ingrediente.
filtro passa-banda	Chroma	ET510/bp	Percorso di eccitazione.
Brain Heart Infusion	Sigma Aldrich	53286	Terreni di crescita per Y. enterocolitica.
cloruro di calcio	Sigma Aldrich	223506	M2G ingrediente.
Fotocamera	Fonte di imaging	DMK 23UP031	Fotocamera per imaging a contrasto di fase.
maschera di fase dielettrica	Double Helix, LLC	N/	A produce il segnale DHPSF.
fosfato disodico	Sigma Aldrich	795410	M2G ingrediente.
acido etilendiamminotetraacetico	Fisher Scientific	S311-100	Chelati Ca2+. Induce la secrezione nel T3SS.
specchio ribaltabile	Newport	8892-K	Consente di passare tra i percorsi di fluorescenza e contrasto di fase.
fluospheres	Invitrogen	F8792	Perle fluorescenti. 540/560 lunghezze d'onda di exication ed emissione. Diametro 40 nm.
vetrino coprioggetto	VWR	16004-302	#1.5, 22mmx22mm
glucosio	Chem Impex International	811	M2G ingrediente.
olio da immersione	Olympus	Z-81025	Posizionato sulla lente dell'obiettivo.
solfato di ferro (II)	Sigma Aldrich	F0518	M2G ingrediente.
filtro passa lungo	Semrock	LP02-514RU-25	Percorso di emissione.
solfato di magnesio	Fisher Scientific	S25414A	M2G ingrediente.
piattaforma per microscopio	Mad City Labs	piattaforma personalizzata	per microscopio invertito.
nalidixico	Sigma Aldrich	N4382	Y. enterocolitica le cellule utilizzate sono resistenti all'acido nalidixico.
obiettivo	Olympus	1-U2B991	60X, 1.4 NA
Detergente all'ozono	Novascan	PSD-UV4	Utilizzato per eliminare la fluorescenza di fondo sui vetrini di copertura.
fosfato di potassio	Sigma Aldrich	795488	M2G ingrediente.
LED rosso	Thorlabs	M625L3	Illumina il campione per l'imaging a contrasto di fase. 625nm.
Fotocamera sCMOS	Hamamatsu	ORCA-Flash 4.0 V2	Fotocamera per imaging a fluorescenza.
filtro passa corto	Chroma	ET700SP-2P8	Percorso di emissione.
Lente del tubo	Thorlabs	AC508-180-A	f=180 mm, 2"
Yersinia enterocolitica dHOPEMTasd	N/A	N/A	Ceppo AD4442, eYFP-YscQ
piastra a quarto d'onda di ordine zero	Thorlabs	WPQ05M-514	Via di eccitazione.