Qui, presentiamo un protocollo per misurare kDM1A target engagement in una cellula umana o animale, tessuto o campioni di sangue trattati con inibitori KDM1A. Il protocollo utilizza l'etichettatura chemioprobe dell'enzima KDM1A gratuito e la quantificazione diretta dell'occupazione target utilizzando immunoasisti basati sulla chemiospa e può essere utilizzato in studi preclinici e clinici.
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Articolo metodologico
Misurazione diretta del coinvolgimento target KDM1A utilizzando Immunoassays basate su Chemoprobe
In questo articolo
Sommario
Abstract
La valutazione dell'impegno target, definita come l'interazione di un farmaco con la proteina per cui è stato progettato, è un requisito fondamentale per l'interpretazione dell'attività biologica di qualsiasi composto nello sviluppo di farmaci o nei progetti di ricerca di base. Nell'epigenetica, l'impegno target è più spesso valutato mediante l'analisi dei marcatori proxy invece di misurare l'unione del composto al bersaglio. Le letture biologiche a valle che sono state analizzate includono la modulazione del marchio dell'istorio o i cambiamenti dell'espressione genica. KDM1A è una lisila demetila si riparte da H3K4 mono e dimetilata, una modifica associata al silenziamento dell'espressione genica. La modulazione dei marcatori proxy dipende dal tipo di cellula e dalla funzione della composizione genetica delle cellule studiate, il che può rendere piuttosto difficile l'interpretazione e il confronto tra maiuscole e minuscole. Per aggirare questi problemi, viene presentato un protocollo versatile per valutare gli effetti della dose e la dinamica del coinvolgimento diretto del target KDM1A. L'analisi descritta fa uso di una chemoprobe KDM1A per catturare e quantificare l'enzima disinibito, può essere ampiamente applicato a cellule o campioni di tessuto senza necessità di modificazione genetica, ha un'eccellente finestra di rilevamento e può essere utilizzato sia per la ricerca di base e l'analisi di campioni clinici.
Introduzione
La lisina demetilasi specifica 1 (KDM1A)1 è un demetilare coinvolto nel controllo della trascrizione genica. Questa proteina è emersa come bersaglio farmacologico candidato2 in oncologia; tra cui acuta mieloide Leucemia3 (AML), Sindrome da Mielodisplasia (MDS)4, Mielofibrosi (MF)5,6, Cancro polmonare a piccole cellule (SCLC)7; nella malattia delle cellule falciformi (SCD)8,9, e nelle malattie del sistema nervoso centrale tra cui il mo....
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Protocollo
I campioni di sangue sono stati ottenuti dall'Instituto de Investigaciàn Biomédica Sant Pau Biobank secondo la legislazione spagnola (Real Decreto de Biobancos 1716/2011) e l'approvazione dei comitati etici locali. Gli studi con tessuti animali sono stati effettuati in conformità con gli orientamenti istituzionali per la cura e l'uso degli animali da laboratorio (direttiva del Consiglio delle Comunità europee 86/609/CEE) istituito dal Comitato etico per la sperimentazione animale PRAAL-PCB.
1. Preparazione di campioni biologici per il saggio.
AVVISO: Questo protocollo comporta la manipolazione di campioni ....
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Risultati
La linearità della determinazione Total e Free KDM1A.
Una serie Standard è stata preparata come descritto nel passaggio 5.3.2., utilizzando da 0 a 2500 pg dell'enzima KDM1A ricombinante umano a lunghezza intera. I valori RLU di Total e Free rKDM1A sono stati valutati per verificare la linearità (Figura 2A e 2B). I dati sono rappresentati come media da 3 esperimenti .......
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Discussione
Il protocollo qui presentato è stato sviluppato per misurare direttamente il coinvolgimento del target KDM1A utilizzando una nuova chemoprobe KDM1A che coglie la base ELISA. Il metodo è stato convalidato su linee cellulari umane coltivate e campioni di ex vivo da esseri umani, ratti e topi e babbuini (compresi PMC, polmone, cervello, pelle, tumori), ma può essere facilmente applicato ad altre specie in cui l'anticorpo KDM1A bersaglio epitopi e cataliti centro sono conservati. Poiché OG-881 è una chemioprobe basata sull'a.......
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Dichiarazioni
L'autrice Tamara Maes è direttore esecutivo e azionista, e gli autori Cristina Mascara e Raquel Ruiz Rodriguez sono dipendenti di Oryzon Genomics S.A. Oryzon Genomics S.A. sviluppa inibitori KDM1A e detiene brevetti che coprono composti e metodi utilizzati in questo articolo.
Ringraziamenti
Questo studio è stato finanziato da Oryzon Genomics. S.A., Hoffman-La Roche e parzialmente supportati dal programma di collaborazione CIIP-20152001 e RETOS RTC-2015-3332-1.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 0,05% Tripsina-EDTA (1X) | Thermo Scientific | #25300-062 | |
| 10 X Compresse Inibitore della Proteasi Roche | #11836153001 | ||
| 96 blocco di stoccaggio a pozzetti profondi | VWR | #734-1679 | |
| 96 pozzetti Piastre ELISA | Nunc | #436110 | |
| Adesivo nero | Perkin Elmer | #6050173 | |
| Adesivo pellicola trasparente | VWR | #60941-062 | |
| Sonda KDM1A biotinilata OG-881 | Oryzon Genomics S.A. | ||
| Albumina sierica bovina | Sigma | # 3117057001 | |
| Albumina sierica bovina standard | Thermo Scientific | #23208) | |
| Bradford Protein Assay | BioRad | #500-0001 | |
| Tampone di lisi cellulare 10X | Cell Signaling | #9803 | |
| Centrifuga per piastre a 96 pozzetti | Hettich | Rotina 420R | |
| Flask | Thermo Scientific | #156499 | |
| Motivo attivo | ricombinante umano LSD1 / KDM1A a figura intera, enzimaticamente attivo | #31426 | |
| Graphpad Prism 5 Project | GraphPad Software | NA | |
| Soluzione di luminol-enchinacer e perossido (substrato chemiluminescente) | Thermo Scientific | #37074 | |
| Micro centrifuga | Eppendorf | 5415 R | |
| Lettore di micropiastre Infinite 200-Tecan | Tecan | Infinite 200 | |
| Anticorpo di cattura monoclonale di topo Anti-KDM1A (epitopo N-terminale) | Abcam | #ab53269 | |
| Ago G18 gauge blunt | BD | #303129 | |
| ORY-1001 (iadademstat) | Oryzon Genomics S.A. | Provette | |
| separazione NA PBMC 10 ml | Greiner bio-one | #163288 | |
| Provette di separazione PBMC 50 ml | Greiner bio-one | #227288 | |
| PBS 1x | Sigma | #D8537 | |
| Agitatore per piastre | Heidolph Instruments | Rotamax 120 | |
| Polisorbato 20 | Sigma | #P7949 | |
| Anticorpo di rilevamento monoclonale di coniglio Anti-KDM1A (epitopo C-terminale) | Segnalazione cellulare | #672184BF-100 | |
| Anticorpo secondario coniugato con perossidasi Asino Anti-coniglio IgG Thermo | Scientific | #31458 | |
| Spettrofotometro cuvetta 1.5 | Deltalab | #302100 | |
| Spettrofotometro per cuvetta | GE Healthcare | GeneQuant 1300 | |
| Streptavidin | Promega | #Z704A | |
| Siringa | BD | #303172 | |
| Tipo 1 acqua ultrapura | Millipore | Milli-Q Advantage A10 | |
| Pulitore ad ultrasuoni | VWR | USC200T |
Riferimenti
- Shi, Y. Histone demethylation mediated by the nuclear amine oxidase homolog LSD1. Cell. 119 (7), 941-953 (2004).
- Maiques-Diaz, A., Somervaille, T. C. LSD1: biologic roles and therapeutic targeting. Epigenomics. 8 (8), 1103-1116 (2016).
- Maes, T.
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Ristampe e permessi
