Questo test di uccisione anticorpli viene utilizzato per confrontare la capacità delle cellule fagocitiche immuni di rispondere e uccidere i batteri basati su diversi trattamenti e/o condizioni. Classicamente, questo test serve come il gold standard per valutare le funzioni effettrici degli anticorpi alzati contro un batterio come opsonina.
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Articolo metodologico
Anticorpli uccisione test per valutare le risposte immunologiche contro batteri patogeni
In questo articolo
Sommario
Abstract
Un aspetto chiave della risposta immunitaria a colonizzazione batterica dell'host è la fagocitosi. Un'analisi di uccisione di anticorpli (OPKA) è una procedura sperimentale in cui le cellule fagocitiche sono co-coltivate con unità batterica. Le cellule immunitarie verranno fagocitare e uccidere le colture batteriche in modo complemento-dipendente. L'efficienza dell'uccisione delle cellule immuno-mediata è dipendente da una serie di fattori e può essere utilizzato per determinare batterica come le diverse culture confrontare per quanto riguarda la resistenza alla morte cellulare. In questo modo, può essere valutata l'efficacia di potenziali terapie basate su immunitario contro ceppi batterici specifici e/o sierotipi. In questo protocollo, descriviamo un OPKA semplificata che utilizza condizioni di cultura di base e delle cellule di conteggio per determinare la vitalità cellulare batterica dopo co-coltura con condizioni di trattamento e le cellule immunitarie di HL-60. Questo metodo è stato utilizzato con successo con un numero di diversi sierotipi pneumococcici, capsulari e ceppi di acapsular e altre specie batteriche. I vantaggi di questo protocollo OPKA sono la sua semplicità, versatilità (come questo test non è limitato ai trattamenti di anticorpo come opsonine) e la minimizzazione del tempo e reagenti per valutare gruppi sperimentali di base.
Introduzione
L'anticorpli uccidendo assay (OPKA) sono uno strumento critico per il collegamento di alterazioni nella struttura batterica o funzione alle successive modifiche nella risposta immunitaria e la funzione. Come tale, esso è frequente come analisi complementare per determinare il sistema immunitario l'efficacia di trattamenti anticorpali, vaccini candidati, ottimizzazione degli enzimi, ecc. Saggi in vivo sono necessari per determinare l'effettiva liquidazione o protezione in un modello di infezione batterica, il OPKA può essere utilizzato per valutare il contributo immune alla morte delle cellule batteriche componenti di base al massimo: batteri, cellule immunitarie e spe....
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Protocollo
1. la cultura, la differenziazione e la convalida delle cellule HL-60
- Preparare terreni di coltura delle cellule HL-60 composto da 500 mL RPMI con L-Glutammina e 50ml inattivati siero bovino fetale. Non aggiungere antibiotici come questo può influenzare la differenziazione delle cellule HL-60.
- Per propagazione/manutenzione delle cellule HL-60, 5 x 106 cellule in 10 mL di terreni di coltura delle cellule HL-60 75 cm2 sfiato matracci a 37 ° C e 5% CO2. Passaggio cellule ogni 3 − 4 giorni per mantenere le concentrazioni di cellulare ottimale.
Nota: Concentrazione delle cellule non deve super....
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Risultati
Convalida di differenziazione di HL-60 deve essere eseguita prima di iniziare la OPKA. Questa operazione può essere eseguita mediante citometria a flusso per determinare l'espressione extracellulare di CD11b, CD35, CD71 e Annessina V (Figura 1). Ioduro di propidio può essere utilizzato anche come un indicatore di redditività. Dopo essere stati trattati con DMF per 3 giorni, dovrebbe essere aumentata espressione di CD35 (≥ 55% di tutte le cellule) e deve essere diminuita espressione di CD71 (.......
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Discussione
OPKAs servire ruoli essenziali nella valutazione risposte immunitarie anticorpo mediata indotte dalla vaccinazione6,8. Il significato principale di questo OPKA semplificata è l'adattabilità nelle condizioni per essere testati (cioè, anticorpi, enzimi trattamenti, ecc.). In questo senso, mentre questo test può essere utilizzato per verificare il contributo di opsonine (cioè anticorpi) nella fagocitosi, può anche essere utilizzato per valutare il modo di superare i.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Ringraziamo il dottor Moon Nahm (University of Alabama Birmingham) per la sua preziosa assistenza nella creazione di saggi OPKA nel nostro laboratorio. Questo lavoro è stato supportato da istituti nazionali di salute Grant 1R01AI123383-01A1 a FYA.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Annessina V (coniugata con APC) | BioLegend | 640919 | |
| anti-CD35, umana (coniugata con PE) | BioLegend | 333405 | |
| anti-CD71, umana (coniugata con PE) | BioLegend | 334105 | |
| ceppo batterico da utilizzare (ad es. Streptococcus pneumoniae, WU2) | Laboratorio di riferimento respiratorio batterico (Dr. Moon Nahm) | ||
| piastre di agar per sangue | Hardy Diagnostic | A10 | |
| Siero clone fetale | HyClone | SH30080.03 | |
| glicerolo | Sigma | G9012-1L | |
| HL-60 cellule | ATCC | CCL-240 | |
| Controllo dell'isotipo IgG (PE coniugato) | BioLegend | 400907 | |
| N,N-dimetilformammide (DMF) | Fisher Chimico | UN2265 | |
| ioduro di propidio | Sigma | P4864 | |
| RPMI media con L-glutammina | Corning | 10-040-CV |
Riferimenti
- Romero-Steiner, S., et al. Standardization of an opsonophagocytic assay for the measurement of functional antibody activity against Streptococcus pneumoniae using differentiated HL-60 cells. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 4 (4), 415-422 (1997).
- Nanra, J. S., et al.
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Ristampe e permessi
