Nuove tecniche di sgombero dei tessuti immunostaining come l'ultima imaging 3D di organi autorizzati dai solventi consentono la visualizzazione 3D dell'infezione cerebrale da virus del virus della rabbia e del suo complesso ambiente cellulare. Le fette spesse di tessuto cerebrale etichettate con anticorpi sono rese otticamente trasparenti per aumentare la profondità di imaging e consentire l'analisi 3D mediante microscopia a scansione laser confocale.
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Articolo metodologico
Imaging 3D ad alta risoluzione dell'infezione da virus della rabbia nel tessuto cerebrale con la rimozione del solvente
In questo articolo
Sommario
Abstract
La visualizzazione dei processi di infezione nei tessuti e negli organi mediante immunoetichettatura è un metodo chiave nella moderna biologia delle infezioni. La capacità di osservare e studiare la distribuzione, il tropismo e l'abbondanza di agenti patogeni all'interno dei tessuti degli organi fornisce dati cardine sullo sviluppo e la progressione della malattia. Utilizzando metodi di microscopia convenzionali, l'immunoetichettatura è per lo più limitata a sezioni sottili ottenute da campioni conbloccati o congelati con paraffina. Tuttavia, il piano di immagine 2D limitato di queste sezioni sottili può portare alla perdita di informazioni cruciali sulla struttura complessa di un organo infetto e sul contesto cellulare dell'infezione. Le moderne tecniche di compensazione dei tessuti multicolore e immunostaining ora forniscono un modo relativamente veloce ed economico per studiare pile di immagini 3D ad alto volume di tessuto di organi infettati da virus. Esponendo il tessuto a solventi organici, diventa otticamente trasparente. Corrisponde agli indici di rifrazione del campione e alla fine porta a una significativa riduzione della diffusione della luce. Pertanto, in combinazione con obiettivi di lunga distanza di lavoro liberi, grandi sezioni di tessuto fino a 1 mm di dimensioni possono essere immagini dalla microscopia a scansione laser confocale convenzionale (CLSM) ad alta risoluzione. Qui, descriviamo un protocollo per applicare l'imaging dei tessuti profondi dopo la compensazione dei tessuti per visualizzare la distribuzione del virus della rabbia nei cervelli infetti al fine di studiare argomenti come la patogenesi del virus, la diffusione, il tropismo e la neuroinvasione.
Introduzione
Le tecniche istologiche convenzionali si basano principalmente su sezioni sottili di tessuti di organi, che possono fornire intrinsecamente solo approfondimenti 2D in un ambiente 3D complesso. Anche se fattibile in linea di principio, la ricostruzione 3D da sezioni sottili seriali richiede tubazioni tecniche impegnative sia per il taglio che per il successivo allineamento in silico delle immagini acquisite1. Inoltre, la ricostruzione senza soluzione di continuità dei volumi z dopo il taglio dei microtomi è fondamentale in quanto gli artefatti meccanici e computazionali possono rimanere a causa della registrazione dell'immagine non ottimale caus....
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Protocollo
È stato utilizzato materiale cerebrale archiviato fissato in RABV, fissato pIS. I rispettivi studi sugli studi sugli animali sono stati valutati dal responsabile della cura degli animali, dell'uso e del comitato etico dell'Ufficio statale per l'agricoltura, la sicurezza alimentare e la pesca in Meclemburgo-Pomerania occidentale (LALFF M-V) e hanno ottenuto l'approvazione con autorizzazioni 7221.3-2.1-002/11 (topi) e 7221.3-1-068/16 (furetti). Le cure generali e i metodi utilizzati negli esperimenti sugli animali sono stati effettuati secondo le linee guida approvate.
AVVISO: Questo protocollo utilizza varie sostanze tossiche e/o nocive, tra....
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Risultati
La combinazione di iDISCO14 e uDISCO13 accoppiato con CLSM ad alta risoluzione fornisce una profonda conoscenza della risoluzione spatiotemporale e della plasticità dell'infezione rabV del tessuto cerebrale e del contesto cellulare circostante.
Utilizzando l'immunostainizzazione della fosfora RABV (P), gli strati complessi di cellule neuronali infette possono essere visualizzati in spesse sezioni di cervelli murini (Figura 3<.......
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Discussione
La rinascita e l'ulteriore sviluppo delle tecniche di sgombero dei tessuti negli ultimi anni2,3,4,5,6,7,8, 9 (in vie , 10 del sistema , 11 Del sistema di , 12.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Gli autori ringraziano Thomas C. Mettenleiter e Verena te Kamp per aver letto criticamente il manoscritto. Questo lavoro è stato sostenuto dalla Federal Excellence Initiative del Meclemburgo Western Pomerania e dal Fondo sociale europeo (FSE) Grant KoInfekt (ESF/14-BM-A55-0002/16) e da una sovvenzione di ricerca collaborativa inmurale sui Friedrich-Loeffler-Institute (Ri-0372).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Reagents | |||
| Benzyl alcohol | Alfa Aesar | 41218 | Reagente di chiarificazione |
| Benzyl benzoato | Sigma-Aldrich | BB6630-500ML | Reagente di chiarificazione |
| Dimethylsulfoxide | Carl Roth | 4720.2 | Vari tamponi |
| Etere di difenile | Sigma-Aldrich | 240834-100G | Reagente schiarente |
| DL-&alfa;-Tocoferolo | Alfa Aesar | A17039 | Antiossidante |
| Siero d'asino | Bio-Rad | C06SBZ | Reagente bloccante |
| Glicina | Carl Roth | 3908.2 | Riduzione dello sfondo |
| Siero di capra | Merck | S26-100ML | Reagente bloccante |
| Eparina sale sodico | Carl Roth | 7692.1 | Sfondo riduzione |
| Soluzione di perossido di idrogeno (30 %) | Carl Roth | 8070.2 | Sbiancamento dei campioni |
| Metanolo | Carl Roth | 4627.4 | Pretrattamento dei campioni |
| Paraformaldeide Carl | Roth | 0335.3 | Polvere cristallina per la produzione di soluzione fissativa |
| Azoturo di sodio | Carl Roth | K305.1 | Prevenzione della crescita microbica nelle soluzioni madre |
| terz-butanolo | Alfa Aesar | 33278 | Disidratazione del campione per la pulizia dei tessuti |
| TO-PRO-3 | Thermo Fisher | T3605 | Colorazione dell'acido nucleico |
| Triton X-100 | Carl Roth | 3051.2 | Detersivo |
| Tween 20 | AppliChem | A4974,0500 | Reazione detergente |
| Varie | |||
| ml tubi | Eppendorf | 0030119401 | Provette per campioni |
| Vetrino coprioggetti, circolare (diametro: 22 mm) | Marienfeld | 0111620 | Parte della camera di imaging |
| Vetrino coprioggetti, circolare (diametro: 30 mm) | Marienfeld | 0111700 | Parte della camera di imaging |
| Ago ipodermico (27 G x ¾ ” [0,40 mm x 20 mm]) | B. Braun | 4657705 | Riempimento della camera di imaging con soluzione di pulizia |
| RTV-1 gomma siliconica | Wacker | Elastosil E43 | Adesivo per l'assemblaggio della camera di imaging |
| Ultimaker CPE 2,85 mm trasparente | Ultimaker | 8718836374869 | Filamento di copoliestere per stampante 3D per stampare parti della camera di imaging |
| Attrezzature tecniche e software | |||
| Stampante 3D | Ultimaker | Ultimaker 2+ | Stampa della camera di imaging |
| Sistema automatizzato di immersione in acqua | Leica | 15640019 | Pompa dell'acqua controllata da software Agitatore |
| orbitale da banco | Elmi | DOS-20M | Incubazione del campione a temperatura ambiente (~ 150 giri/min) |
| Agitatore orbitale da banco, riscaldato | New Brunswick Scientific | G24 Agitatore ambientale | Incubazione del campione a 37 gradi C (~ 150 giri/min) |
| Microscopio a scansione laser confocale | Leica | DMI 6000 TCS SP5 | Microscopio confocale invertito per l'imaging di campioni |
| Fiji | NIH (ImageJ) | Software open source (v1.52h) | Pacchetto di elaborazione delle immagini basato su ImageJ |
| Obiettivo ad immersione in acqua a lunga distanza di lavoro | Leica | 15506360 | HC PL APO 40x/1.10 W motCORR CS2 |
| Vibratome | Leica | VT1200S | |
| Workstation | Dell | Precision 7920 | di esempio: Intel Xeon Gold 5118 GPU: Nvidia Quadro P5000 RAM: 128 GB 2666 MHz DDR4 SSD: 2 TB |
| Anticorpi primari | |||
| Goat anti-RABV N | Friedrich-Loeffler-Institut | Siero policlonale monospecifico di capra anti-RABV N, generato mediante immunizzazione di capra con nucleoproteina RABV N espressa da baculovirus e purificata con His-tag Diluizione: 1:400 | |
| di coniglio | Dako | Z0334 | (RRID:AB_10013382) Diluizione: 1:100 |
| coniglio anti-MAP2 | Abcam | ab32454 | (RRID:AB_776174) Diluizione: 1:250 |
| Anti-RABV di coniglio P 160-5 | Friedrich-Loeffler-Institut | Siero policlonale policlonale monospecifico di coniglio anti-RABV P, generato mediante immunizzazione di coniglio con fosfoproteina RABV espressa da baculovirus e His-tag-purificata P (vedi riferimento 23: Orbanz et al., 2010) Diluizione: 1:1.000 | |
| Anticorpi secondari | |||
| Asino anti-capra IgG | Thermo Fisher Scientific | a seconda del coniugato fluoroforo | Altamente assorbito Diluizione: 1:500 |
| IgG anti-topo d'asino | Thermo Fisher Scientific | a seconda del fluoroforo coniugato | Altamente assorbito Diluizione: 1:500 |
| IgG anti-coniglio d'asino | Thermo Fisher Scientific | a seconda del fluoroforo coniugato | Altamente assorbito Diluizione: 1:500 |
| IgG anti-topo di capra | Thermo Fisher Scientifico | a seconda del fluoroforo coniugato | Altamente assorbito Diluizione: 1:500 |
| IgG anti-coniglio di capra | Thermo Fisher Scientifico | a seconda del fluoroforo coniugato | Altamente assorbito Diluizione: 1:500 |
Riferimenti
- Pichat, J., Iglesias, J. E., Yousry, T., Ourselin, S., Modat, M. A Survey of Methods for 3D Histology Reconstruction. Medical Image Analysis. 46, 73-105 (2018).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497
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Ristampe e permessi
