Qui, presentiamo un metodo per registrare le contrazioni muscolari embrionali negli embrioni della Drosophila in modo non invasivo e orientato ai dettagli.
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Articolo metodologico
Live Imaging e analisi delle contrazioni muscolari nell'embrione di Drosophila
In questo articolo
Sommario
Abstract
Le contrazioni muscolari coordinate sono una forma di comportamento ritmico visto all'inizio durante lo sviluppo negli embrioni della Drosophila. I circuiti di feedback sensoriale neuronale sono necessari per controllare questo comportamento. La mancata produzione del modello ritmico delle contrazioni può essere indicativa di anomalie neurologiche. In precedenza abbiamo scoperto che i difetti nella proteina O-mannosilation, una modificazione delle proteine post-traduzionale, influenzano la morfologia degli assoni dei neuroni sensoriali e provocano contrazioni muscolari coordinate anormali negli embrioni. Qui, presentiamo un metodo relativamente semplice per registrare e analizzare il modello delle contrazioni muscolari peristalitiche mediante l'imaging dal vivo di embrioni in fase avanzata fino al punto di schiusa, che abbiamo usato per caratterizzare il fenotipo di contrazione muscolare delle proteine Mutanti O-mannosyltransferase. I dati ottenuti da queste registrazioni possono essere utilizzati per analizzare le onde di contrazione muscolare, tra cui la frequenza, la direzione di propagazione e l'ampiezza relativa delle contrazioni muscolari in diversi segmenti del corpo. Abbiamo anche esaminato la postura del corpo e sfruttato un marcatore fluorescente espresso specificamente nei muscoli per determinare con precisione la posizione della linea mediana dell'embrione. Un approccio simile può anche essere utilizzato per studiare vari altri comportamenti durante lo sviluppo, come il rotolamento degli embrioni e la schiusa.
Introduzione
La contrazione muscolare peristaltica è un comportamento motorio ritmico simile al camminare e nuotare negli esseri umani1,2,3. Le contrazioni muscolari embrionali osservate negli embrioni in fase avanzata della Drosophila rappresentano un esempio di tale comportamento. La Drosophila è un eccellente organismo modello per studiare vari processi di sviluppo perché lo sviluppo embrionale nella Drosophila è ben caratterizzato, relativamente breve e facile da monitorare. L'obiettivo generale del nostro metodo è quello di registrare e analizzare attentame....
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Protocollo
1. Preparazione
- Preparare una gabbia di mosca facendo circa 50 fori in un bicchiere di plastica tri-angolo di capacità 100 mL utilizzando un aghi caldo 25 G (vedi Tabella dei materiali).
- Preparare 60 mm x 15 mm piatti Petri con succo di mela-agar (3% agar e 30% succo di mela).
- Preparare la pasta di lievito fresco mescolando granuli di lievito secco e acqua. Stendere la pasta di lievito sui piatti di agar di mela per aumentare la deposizione delle uova.
- Anasthetizzare circa 50-60 mosche (usare approssimativamente lo stesso numero di maschi e femmine) su CO2 e metterli nella gabbia di mosca.
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Risultati
Le normali contrazioni muscolari peristaltiche sono mostrate in un embrione WT (wild-type, Canton-S) nel film 1. La frequenza media delle onde peristalitiche delle contrazioni muscolari nella nostra analisi era di 47 contrazioni all'ora e l'ampiezza media era del 60% superiore alla linea di base per gli embrioni WT. Il rotolamento dell'embrione è mostrato per un embrione WT nel film 2, con la freccia bianca che segna la posizione iniziale di una trachea e una freccia nera che r.......
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Discussione
Il nostro metodo fornisce un modo quantitativo per analizzare importanti comportamenti embrionali durante lo sviluppo, come le onde di contrazione muscolare peristale, tra cui la periodicità delle onde, l'ampiezza e il modello, nonché l'effetto delle onde sul rotolamento e sulla postura. Questo può essere utile nelle analisi di diversi mutanti per studiare il ruolo di geni specifici nella regolazione di questi e altri comportamenti durante lo sviluppo embrionale. Abbiamo utilizzato cambiamenti nell'intensità del marcator.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Il progetto è stato sostenuto in parte dai National Institutes of Health Grants RO1 NS099409, NS075534 e CONACYT 2012-037 (S) a VP.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Fotocamera digitale | Hamamatsu CMOS ORCA-Flash 4.0 | C13440-20CU | Con diversi filtri di emissione |
| Pinze | FST Dumont | 11254-20 | Dimensioni della punta 0,05 mm x 0,01 mm |
| LED | X-cite BDX (Excelitas) | XLED1 | |
| Microscopio | Carl Ziess Examiner D1 | 491405-0005-000 | Epifluorescenza con time lapse |
| Ago | BD | 305767 | 25 G x 1-1/2 pollici |
| Pennello | Artigianato | Qualsiasi pennello funzionerà | |
| Piastre di Petri | VWR | 25384-164 | 60 mm x 15 mm |
| Software | HCImage Live | ||
| Thread Zap Penna a cera | Thread Zap II (by BeadSmith)(Amazon) | TZ1300 | Bruciatore |
| Strumento Tricorner bicchiere in plastica | VWR | 25384-152 | 100 ml |
Riferimenti
- Pereanu, W., Spindler, S., Im, E., Buu, N., Hartenstein, V. The emergence of patterned movement during late embryogenesis of Drosophila. Developmental Neurobiology. 67, 1669-1685 (2007).
- Suster, M. L., Bate, M. Embryonic assembly of a central pattern generator wi....
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Ristampe e permessi
