Vi presentiamo i protocolli per esaminare lo sviluppo del cuore del mouse usando la microscopia intero Monte epifluorescente su embrioni di topo sezionati da ventricolare specifico MLC-2v-tdTomato reporter topi knock-in. Questo metodo permette di visualizzare direttamente ogni fase della formazione ventricolare durante lo sviluppo del cuore del mouse senza laboriosi metodi istochimici.
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Articolo metodologico
Analisi della camera cardiaca sviluppo durante l'embriogenesi del Mouse utilizzando l'intero Monte epifluorescenza
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'obiettivo del presente protocollo è di descrivere un metodo per la dissezione degli embrioni del mouse e visualizzazione delle camere ventricolari embrionali del mouse durante lo sviluppo del cuore usando topi knock-in reporter fluorescenti specifici ventricolare (MLC-2v-tdTomato topi). Sviluppo del cuore implica una formazione cuore lineare del tubo, il tubo di cuore looping e quattro camera settazione. Questi complessi processi sono altamente conservati in tutti i vertebrati. Il cuore di embrionali del topo è stato ampiamente usato per studi evolutivi di cuore. Tuttavia, a causa della loro dimensioni estremamente ridotte, cuori embrionali del topo di dissezione è tecnicamente impegnativo. Inoltre, visualizzazione di formazione camera cardiaca spesso ha bisogno di ibridazione in situ, beta-galattosidasi che macchia usando topi reporter LacZ, o immunostaining del cuore embrionale sezionato. Qui, descriviamo come sezionare cuori embrionali del mouse e visualizzare direttamente la formazione di camera ventricolare di MLC-2v-tdTomato topi usando la microscopia intero Monte epifluorescente. Con questo metodo, è possibile esaminare direttamente la formazione del tubo di cuore e loop e quattro formazione di camera senza ulteriore manipolazione sperimentale degli embrioni del mouse. Anche se la linea di topo knock-in reporter MLC-2v-tdTomato è utilizzata in questo protocollo come esempio, questo protocollo può essere applicato ad altre linee di topi transgenici reporter fluorescenti specifici del cuore.
Introduzione
Formazione di camera durante lo sviluppo del cuore è un processo complesso, passando attraverso diversi stadi embrionali morfologicamente distinti1,2. La forma a mezzaluna cardiaco della popolazione delle cellule del progenitore forma un tubo lineare cuore e poi subisce allungamento e looping per formare la forma a spirale del cuore in via di sviluppo. Dopo il suo processo di settazione, cuore in via di sviluppo si trasforma in cuore quattro-a temperatura ambiente. Interruzione di uno qualsiasi di questi processi si traduce in difetti inerenti allo sviluppo del cuore. Pertanto, è importante capire i meccanismi....
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Protocollo
Tutte le procedure degli animali sono state effettuate con l'approvazione del Comitato di uso e Vanderbilt University Medical Center istituzionale Animal Care.
1. mouse raccolta degli embrioni e dissezione
- Compagno di 8-10 settimane vecchio MLC-2v-tdTomato+ /- topi femmina con 8-10 settimane vecchio MLC-2v-tdTomato+ /- topo maschio per ottenere MLC-2v-tdTomato+ +, MLC-2v-tdTomato+ /- e MLC-2v-tdTomato- / - embrioni.
- Controllare le dighe per spine vaginale ogni mattina. Mezzogiorno del giorno di rilevamento plug vaginale è considerato come 0.5.
Nota: Esame vaginale....
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Risultati
Durante lo sviluppo del cuore, MLC-2v è considerato essere l'indicatore più in anticipo per camera ventricolare specifica:17. Come descritto in Figura 1, abbiamo dissecato fuori interi embrioni del mouse e hearts embrionali di topi knock-in reporter di MLC-2v-tdTomato ed esaminato MLC-2v-tdTomato reporter espressione durante lo sviluppo del cuore. In MLC-2v-tdTomato reporter topi knock-in, espressione costitutiva tdTomato nel cuore in .......
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Discussione
Il metodo descritto qui è relativamente semplice per esaminare lo sviluppo camera ventricolare, senza laboriosi esperimenti per etichettare ventricolare o cardiaci specifici geni strutturali o proteine. Quindi, questo metodo riduce al minimo tecnico variabilities che spesso sono stati trovati nelle sezioni immunostained cuore.
Ci sono due passaggi critici per l'esecuzione con successo questo metodo tra cui stima precisa dell'età embrionali di topi e dissezione del cuore embrionale. Stimiamo pr.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato da NIH R03 HL140264 (Y.-J. N) e programma di Gilead Sciences Research Scholar (Y.-J. N).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| microscopio da dissezione | Leica | MZ125 | |
| Scala per DNA (100 bp) | Promega | G2101 | |
| Microscopio da dissezione per epifluorescenza | Leica | M165 FC | |
| GoTaq Green master Mix | Promega | M712 | |
| Macchina per PCR (master cycler) | Eppendorf | 6336000023 |
Riferimenti
- Evans, S. M., Yelon, D., Conlon, F. L., Kirby, M. L. Myocardial lineage development. Circulation Research. 107 (12), 1428-1444 (2010).
- Paige, S. L., Plonowska, K., Xu, A., Wu, S. M. Molecular regulation of cardiomyocyte differentiation. Circulation Research. 116 (2), 341-353 (2015). ....
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Ristampe e permessi
