Per riproducibile contare i numeri dei mRNAs in singoli ovociti, in situ di fluorescenza di singola molecola del RNA (RNA-pesce) l'ibridazione è stato ottimizzato per cellule non aderenti. Gli ovociti sono stati raccolti, ibridata con le sonde specifiche di trascrizione e quantificati tramite un software di quantificazione di immagine.
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Articolo metodologico
Uso di singola molecola fluorescente ibridazione In Situ (SM-pesce) per quantificare e Localize mRNAs in ovociti murini
In questo articolo
Sommario
Abstract
Attuali metodi abitualmente utilizzati per quantificare il mRNA di ovociti ed embrioni includono reazione a catena della polimerasi d'inversione-trascrizione digitale (dPCR), quantitativa, Real-Time RT-PCR (RT-qPCR) e sequenziamento di RNA. Quando queste tecniche vengono eseguite utilizzando un singolo oocita o embrione, basso-copia mRNA non vengono rilevati in modo affidabile. Per ovviare a questo problema, gli ovociti o embrioni possono essere riuniti insieme per analisi; Tuttavia, questo porta spesso a un'elevata variabilità tra i campioni. In questo protocollo, descriviamo l'uso di ibridazione fluorescente in situ (FISH) utilizzando la chimica del DNA ramificato. Questa tecnica identifica il pattern spazio dei mRNAs in singole celle. Quando la tecnica è accoppiata con ricerca di Spot e software di monitoraggio computer, l'abbondanza del mRNA nella cellula anche può essere quantificato. Utilizzando questa tecnica, c'è ridotta variabilità all'interno di un gruppo sperimentale e un minor numero di ovociti ed embrioni sono necessarie per rilevare differenze significative tra i gruppi sperimentali. Commercialmente disponibile DNA ramificato SM-Kit di pesce sono stati ottimizzati per rilevare mRNAs in sezionato tessuti o cellule aderenti sulle diapositive. Tuttavia, gli ovociti non aderiscono in modo efficace alle diapositive e alcuni reagenti contenuti nel kit erano troppo duri con conseguente lisi degli ovociti. Per evitare questo Lisi, diverse modifiche sono state fatte per il kit di pesce. In particolare, il buffer di permeabilizzazione e lavaggio di ovocita progettato per l'immunofluorescenza di ovociti ed embrioni sostituito i buffer proprietari. La permeabilizzazione, lavaggi e le incubazioni con sonde e amplificatore sono state eseguite in piastre da 6 pozzetti e ovociti sono stati collocati sulle diapositive alla fine del protocollo utilizzando mezzi di montaggio. Queste modifiche sono state in grado di superare le limitazioni del kit disponibili in commercio, in particolare, la lisi dell'ovocita. Per accurato e riproducibile contare il numero dei mRNAs in singoli ovociti, software per computer è stato utilizzato. Insieme, questo protocollo rappresenta un'alternativa alla PCR e sequenziamento per confrontare l'espressione di specifici trascritti in singole cellule.
Introduzione
Reazione a catena d'inversione-transcriptase della polimerasi (PCR) è stato il gold standard per la quantificazione di mRNA. Due saggi, digitale PCR (dPCR)1 e quantitativa in tempo reale PCR (qPCR)2 sono attualmente utilizzati. Le due tecniche di PCR, dPCR ha una maggiore sensibilità rispetto qPCR suggerendo che potrebbe essere utilizzato per misurare l'abbondanza del mRNA in singole cellule. Tuttavia, nelle nostre mani, dPCR analisi dei mRNAs abbondanza bassa nelle piscine di ovociti di 5 a 10 per ogni campione sperimentale ha prodotto dati con scarsa riproducibilità e variazione alta3. Ciò è pro....
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Protocollo
Procedure di animali sono stata esaminate e approvate dal comitato di impiego presso l'Università di Nebraska-Lincoln e istituzionali Animal Care e tutti i metodi sono stati effettuati conformemente alle norme e linee guida pertinenti. Per questo studio, CD-1 esogami topi ha avuto accesso ad libitum di chow roditore normale e acqua; sono stati mantenuti in un 12:12 scuri: ciclo di luce.
1. preparazione del supporto richiesto
- Per i supporti di base (OMM), aggiungere 100 mM NaCl, 5 mM KCl, 0,5 mM KH2PO4e 1,7 mM CaCl2-2 H2O a 100 mL di acqua sterile.
Nota: Medio OMM possa essere memorizz....
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Risultati
A completamento del protocollo, il risultato sarà singole immagini da confocale z-series (Figura 4A e Figura 5), immagini unite (Figura 4), e conta di mRNA (Figura 4B). Quando viene eseguita la multiplazione, ci sarà anche Unite immagini che mostrano l'etichetta per due differenti mRNA (Figur.......
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Discussione
Una serie di passaggi minore durante il protocollo garantirà successo fluorescenza e conteggi precisi dei mRNAs. In primo luogo, il protocollo deve essere eseguito immediatamente dopo la raccolta e la fissazione degli ovociti. Si noti che il PVP viene aggiunto nel buffer di fissazione del paraformaldeide al 4% per impedire che gli ovociti attaccare a vicenda. Abbiamo trovato che è necessario eseguire l'esperimento immediatamente dopo la raccolta e la fissazione degli ovociti. Qualsiasi ritardo si traduce in un segnale di.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da dichiarare
Ringraziamenti
Ringraziamo il Dr. Daniel R. Larson per il suo generoso aiuto con l'installazione e l'uso della ricerca di Spot e programma di controllo 13 ed il supporto tecnico di Università del Nebraska Lincoln microscopia Core per l'imaging di microscopia confocale. Questo studio rappresenta un contributo dell'Università di divisione di ricerca agricola di Nebraska, Lincoln, Nebraska ed è stato sostenuto da fondi di tratteggio UNL (NEB-26-206/adesione numero-232435 e NEB-26-231/adesione numero-1013511).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| (±)-&alfa;-Acido lipoico | Sigma-Aldrich | T1395 | Acido alfa lipoico |
| Albumina, siero bovino, basso contenuto di acidi grassi | MP Biomedicals, LLC | 199899 | FAF BSA |
| BD 10mL TB Siringa | Becton, Dickinson and Company | 309659 | 10 ml BD |
| PrecisionGlide Ago | Becton, Dickinson and Company | 305109 | 27 1/2 gauge Cloruro |
| calcio diidrato | Sigma-Aldrich | C7902 | CaCl2-2H2O |
| Acido citrico | Sigma-Aldrich | C2404 | Citrato |
| D-(+)-Glucosio | Sigma-Aldrich | G6152 | Glucosio |
| Fosfato | Na2HPO4 | ||
| Easy Grip Petri Dish | Falcon Corning | 351008 | piastra da 35 mm |
| Edetate Disodium | Avantor | 8994-01 | |
| Forbici Bonn extra fini | Strumenti di scienza fine | 14084-08 | Forbici diritte, affilate/affilate, non seghettate, taglienti da 13 mm Siero |
| bovino fetale | Atlanta biologicals | S10250 | FBS |
| Soluzione reagente per gentamicina | gibco | 15710-064 | Gentamicina |
| GlutaMAX-I (100X) | gibco | 35050-061 | Glutamax |
| Gold Seal Micro Vetrini | Gold Seal | 3039 | 25 x 75mm vetrini |
| Gonadotropina, da siero di cavalle gravide | Sigma | G4877 | eCG |
| hCG ricombinante | NHPP | AFP8456A | hCG |
| ialuronidasi, tipo IV-S: da testicoli bovini | Sigma-Aldrich | H3884 | ialuronidasi |
| gioielliere stile pinza | Integra | 17-305X | pinza 4-3/8", stile 5F, dritto, micro mascella fine |
| L-(+)-Acido lattico, acido libero | MP Biomedicals, LLC | 190228 | L-Lattato |
| Solfato di magnesio eptaidrato | Sigma-Aldrich | M2773 | MgSO4-7H2O |
| MEM Aminoacidi non essenziali | Corning | 25-025-Cl | Vetro |
| di copertura per microscopio | Fisher Scientific | 12-542-C | 25 x 25x 0,15 mm Vetrini coprioggetto |
| Mm-Nanog-O2-C2 Sonda RNAscope | Diagnostica cellulare avanzata | 501891-C2 | Sonda |
| Nanog Mm-Pou5f1-O1-C3 Sonda RNAscope | Diagnostica cellulare avanzata | 501611-C3 | Sonda Pou5f1 |
| MOPS | Sigma-Aldrich | M3183 | |
| Paraformaldeide | Sigma-Aldrich | P6148 | Paraformaldeide |
| PES 0,22 um Membrana -sterile | Millex-GP | SLGP033RS | 0,22 um |
| filtri Polivinilpirrolidone | Sigma-Aldrich | P0930 | PVP |
| Cloruro di potassio | Sigma-Aldrich | 60128 | KCl |
| Fosfato di potassio monobasico | Sigma-Aldrich | 60218 | KH2PO4 |
| Reagente antidissolvenza Prolong Gold | invitrogen | P36934 | Reagente antisbiadimento senza |
| RNAscope DAPI | Diagnostica cellulare avanzata | DAPI 320858 | RNAscope |
| DAPI FL AMP 1 | Diagnostica cellulare avanzata | 320852 | Amplificatore 1 |
| RNAscope FL AMP 2 | Diagnostica cellulare avanzata | 320853 | Amplificatore 2 |
| RNAscope FL AMP 3 | Advanced Diagnostica cellulare | 320854 | Amplificatore 3 |
| RNAscope FL AMP 4 ALT A | Diagnostica cellulare avanzata | 320855 | Amplificatore 4 ALT A |
| RNAscope FL AMP 4 ALT B | Diagnostica cellulare avanzata | 320856 | Amplificatore 4 ALT B |
| RNAscope FL AMP 4 ALT C | Diagnostica cellulare avanzata | 320857 | Amplificatore |
| 4 ALT C RNAscope Kit di reagenti per la rilevazione multiplex fluorescente | Kit di reagenti FISH per la diagnostica cellulare avanzata | 320851 | |
| Sonda RNAscope Sonda a controllo negativo a 3 plessi | Diagnostica cellulare avanzata 320871 | ||
| Sonda RNAscope a controllo negativo Diagnostica cellulare avanzata a controllo positivo a 3 plessi | Diagnostica cellulare avanzata | 320881 | |
| Sonda RNAscope a | Diagnostica cellulare avanzata | 300041 | Sonda Diluente |
| RNAscope Proteasi III | Diagnostica cellulare avanzata | 322337 | Proteasi III |
| RNAscopio Proteasi III & Kit di reagenti IV | Advanced Cell Diagnostics | 322340 | Kit di proteasi FISH |
| RNAscope Protease IV | Advanced Cell Diagnostics | 322336 | Protease IV |
| S/S Ago con Luer Hub 30G | Component Supply Co. | NE-301PL-50 | ago smussato calibro 30 |
| Bicarbonato di sodio | Sigma-Aldrich | S6297 | NaHCO3 |
| Cloruro di sodio | Sigma-Aldrich | S6191 | NaCl |
| Idrossido di sodio | Sigma-Aldrich | 306576 | NaOH |
| Piruvato di sodio, >= 99% | Sigma-Aldrich | P5280 | |
| Soluzione di piruvato 6 pozzetti Piatto | Agtechinc | D18 | Piastra a 6 pozzetti |
| Taurina | Sigma-Aldrich | T8691 | |
| Piastra per coltura tissutale | Taurina Falcon Corning | 353002 | Piastra da 60 mm |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | Triton X-100 |
Riferimenti
- Vogelstein, B., Kinzler, K. W. Digital PCR. Proceedings of the National Academy of Sciences. 96 (16), 9236-9241 (1999).
- MacK, E. M., Smith, J. E., Kurz, S. G., Wood, J. R. CAMP-dependent regulation of ovulatory resp....
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Ristampe e permessi
