Questo protocollo introduce una procedura operativa di laboratorio standard per il test diagnostico degli antigeni lyssavirus nei pipistrelli a Taiwan.
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Articolo metodologico
Procedura operativa standard per la sorveglianza lyssavirus della popolazione bat a Taiwan
In questo articolo
Sommario
Abstract
I virus all'interno del genere Lyssavirus sono patogeni zoonotici, e almeno sette specie di lyssavirus sono associati a casi umani. Poiché i pipistrelli sono serbatoi naturali della maggior parte dei lissavirus, un programma di sorveglianza del lyssavirus di pipistrelli è stato condotto a Taiwan dal 2008 per capire l'ecologia di questi virus nei pipistrelli. In questo programma, organizzazioni non governative di conservazione dei pipistrelli e centri locali di controllo delle malattie animali hanno collaborato per raccogliere pipistrelli morti o pipistrelli che muoiono di debolezza o malattia. I tessuti cerebrali dei pipistrelli sono stati ottenuti attraverso necroscopia e sottoposti a test anticorpali fluorescenti diretti (FAT) e reazione a catena di trascrizione inversa (RT-PCR) per il rilevamento di antigeni lissavirus e acidi nucleici. Per il FAT, si raccomandano almeno due diverse diagnosi di rabbia. Per la RT-PCR, due serie di primer (JW12/N165-146, N113F/N304R) vengono utilizzati per amplificare una sequenza parziale del gene della nucleovirusproteina della lissa. Questo programma di sorveglianza monitora i lyssavirus e altri agenti zoonotici nei pipistrelli. Il lissavirus pipistreavirus di Taiwan si trova in due casi di pipistrelle giapponese (Pipistrellus abramus) nel 2016-2017. Questi risultati dovrebbero informare il pubblico, gli operatori sanitari e gli scienziati sui potenziali rischi di contattare pipistrelli e altri animali selvatici.
Introduzione
I virus all'interno del genere Lyssavirus sono patogeni zoonotici. Ci sono almeno sette specie di lyssavirus associate a casi umani1. Oltre alle 16 specie di questo genere1,2,3, Taiwan pipistrello lyssavirus (TWBLV)4 e Kotalahti pipistrello lyssavirus5 sono stati recentemente identificati in pipistrelli, ma i loro stati tassonomici devono ancora essere determinato.
I pipistrelli sono i padroni naturali della maggior parte dei lissavirus, con l'eccezione di Mokola lyssa....
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Protocollo
1. Precauzioni di sicurezza durante la manipolazione dei lyssavirus
- Assicurarsi che tutti i lavoratori di laboratorio che gestiscono campioni di pipistrelli ricevano la profilassi di pre-esposizione sulla pilma17. Monitorare i livelli di anticorpi della rabbia dei lavoratori in anticipo e riesaminarli ogni 6 mesi17. La vaccinazione antirabbica di follow-up è necessaria per coloro i cui livelli di anticorpi sono inferiori a 0,5 IU/mL17.
- A seconda delle norme sulla biosicurezza del paese in cui si trova il laboratorio, assicurarsi che le seguenti procedure siano eseguite in labor....
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Risultati
Dal 2014 al maggio 2017 sono state raccolte 332 carcasse di pipistrelli di 13 specie per la sorveglianza. Due sono risultati positivi. Nel primo caso di pipistrello, l'impronta cerebrale è risultata negativa utilizzando ilFAT con uno degli anticorpi commerciali anti-rabies coniugati FITC (Figura 2), mentre gli RT-PCR che impiegano ciascuno dei due set di primer (JW12/N165-146, N113F/N304R) hanno risultati positivi (Figura 3). È stata ottenuta una sequenza di amp.......
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Discussione
Questa procedura operativa standard di laboratorio (SOP) fornisce un processo seriale per testare campioni di pipistrelli per la presenza di antigeni lyssavirus a Taiwan. I passaggi chiave includono l'impiego di FAT e RT-PCR. Anche la selezione di campioni adatti e l'isolamento di successo del virus sono importanti. Inoltre, alcuni problemi è stata condotta durante il monitoraggio dei lissavirus pipistrello. La differenza principale era l'animale bersaglio. Inizialmente (2008-2009), gli animali bersaglio della sorveglian.......
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Dichiarazioni
Non vengono dichiarati conflitti di interesse.
Ringraziamenti
Ringraziamo Tien-Cheng Li, Yi-Tang Lin, Chia-Jung Tsai e Ya-Lan Li per la loro assistenza durante questo studio. Questo studio è stato sostenuto dalla sovvenzione n. 107AS-8.7.1-BQ-B2 (1) del Bureau of Animal and Plant Health Inspection and Quarantine, Council of Agriculture, Executive Yuan, Taiwan.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 2,5% Tripsina (10x) | Gibco | 15090046 | Tripsina |
| 25 cm2 pallone | Greiner bio-one | 690160 | |
| Acetone | Honeywell | 32201-1L | |
| Agarosio I | VWR Life Science | 97062-250 | |
| Alcool | NIHON SHIYAKU REAGENTE | NS-32294 | |
| AMV Trascrittasi inversa | Promega | M5101 | |
| Antibiotico-Antimicotico (100X) | Gibco | 15240-062 | MEM-10 |
| Blade | Braun | BA215 | |
| Centrifuga | eppendorf | 5424R | |
| Sistema di chemiluminanza | TOP BIO CO. | MGIS-21-C2-1M Provetta | |
| di raccolta | Qiagen | 990381 | |
| Provetta di raccolta | SSI | 2341-SO | |
| Vetrino di copertura | Muto Pure chemical Co., LTD. | 24505 | |
| Analizzatore di DNA | Applied Biosystems | 3700XL | |
| Siero fetale bovino | Gibco | 10437028 | MEM-10 |
| FITC Anti-rabbia Globulina monoclonale | Fujirebio Diagnostic Inc. | 800-092 | Anticorpi antirabbici coniugati FITC: reagente B |
| Vetrino in vetro con rivestimento in teflon a quattro pozzetti | Thermo Fisher Scientific | 30-86H-WHITE | |
| Sistema di elettroforesi su gel | Major Science | MJ-105-R | |
| HBSS (1x) | Incubatore Gibco | 14175095 | tripsina |
| ASTEC | SCA-165DS | ||
| Microscopio invertito | Olympus | IX71 | |
| L-Glutammina 200 mM (100x) | Gibco | A2916801 | MEM-10 |
| LIGHT DIAGNOSTICS Reagente per la rabbia Reagente per grassi | EMD Millipore Corporation | 5100 | Anticorpi antirabbici coniugati FITC: reagente A |
| MagNA Pure Compact Instrument | Roche | 03731146001 | |
| MagNA Pure Compact NA Isolation Kit 1 | Roche 03730964001 | ||
| MEM (10x) | Gibco | 11430030 | MEM-10 |
| MEM NEAA (100x) | Gibco | 11140050 | MEM-10 |
| MEM soluzione vitaminica | Gibco | 11120052 | MEM-10 |
| NaHCO3 | Merck | 1.06329.0500 | MEM-10 |
| Ago | Terumo | NN*2332R9 | |
| PBS | Medicago | 09-8912-100 | |
| Sintesi del primer | Mission Biotech | ||
| Inibitore della RNasina ribonucleasi | Promega | N2111 | |
| Servizio di sequenziamento | Mission Biotech | ||
| Slide | Thermo Scientific | AA00008032E00MNT10 | |
| Piruvato di sodio (100 mM) | Gibco | 11360070 | MEM-10 |
| Perline in acciaio inossidabile | QIAGEN | 69989 | |
| Tampone assorbente sterile | 3M | 1604T-2 | |
| Filtro per siringa | Nalgene | 171-0045 | |
| Taq polimerasi | JMR Holdings | JMR-801 | |
| Termociclatore | Applied Biosystems | 2720 | |
| TissueLyser II | QIAGEN | 85300 | |
| Abbassalingua | HONJER CO., LTD. | ||
| Pinzetta | Tennyson strumento medico in via di sviluppo CO., LTD. | A0601 | |
| Tartrato di Tilosina | Sigma | T6271-10G | MEM-10 |
Riferimenti
- Kuzmin, I. V. Basic facts about lyssavirus. Current laboratory techniques in rabies diagnosis, research, and prevention, volume 1. Rupprecht, C. E., Nagarajan, T. , Elsevier. California. 3-21 (2014).
- Aréchiga Ceballos, N., et al. Novel lyssavirus in bat, Spain. Emerging Infectious Diseases....
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Ristampe e permessi
