Articolo metodologico

Procedura operativa standard per la sorveglianza lyssavirus della popolazione bat a Taiwan

DOI:

10.3791/59421

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27 agosto 2019

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1Animal Health Research Institute, Council of Agriculture, Executive Yuan, 2Institute of Ecology and Evolutionary Biology, National Taiwan University, 3Bat Conservation Society of Taipei

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo protocollo introduce una procedura operativa di laboratorio standard per il test diagnostico degli antigeni lyssavirus nei pipistrelli a Taiwan.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

I virus all'interno del genere Lyssavirus sono patogeni zoonotici, e almeno sette specie di lyssavirus sono associati a casi umani. Poiché i pipistrelli sono serbatoi naturali della maggior parte dei lissavirus, un programma di sorveglianza del lyssavirus di pipistrelli è stato condotto a Taiwan dal 2008 per capire l'ecologia di questi virus nei pipistrelli. In questo programma, organizzazioni non governative di conservazione dei pipistrelli e centri locali di controllo delle malattie animali hanno collaborato per raccogliere pipistrelli morti o pipistrelli che muoiono di debolezza o malattia. I tessuti cerebrali dei pipistrelli sono stati ottenuti attraverso necroscopia e sottoposti a test anticorpali fluorescenti diretti (FAT) e reazione a catena di trascrizione inversa (RT-PCR) per il rilevamento di antigeni lissavirus e acidi nucleici. Per il FAT, si raccomandano almeno due diverse diagnosi di rabbia. Per la RT-PCR, due serie di primer (JW12/N165-146, N113F/N304R) vengono utilizzati per amplificare una sequenza parziale del gene della nucleovirusproteina della lissa. Questo programma di sorveglianza monitora i lyssavirus e altri agenti zoonotici nei pipistrelli. Il lissavirus pipistreavirus di Taiwan si trova in due casi di pipistrelle giapponese (Pipistrellus abramus) nel 2016-2017. Questi risultati dovrebbero informare il pubblico, gli operatori sanitari e gli scienziati sui potenziali rischi di contattare pipistrelli e altri animali selvatici.

Introduzione

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I virus all'interno del genere Lyssavirus sono patogeni zoonotici. Ci sono almeno sette specie di lyssavirus associate a casi umani1. Oltre alle 16 specie di questo genere1,2,3, Taiwan pipistrello lyssavirus (TWBLV)4 e Kotalahti pipistrello lyssavirus5 sono stati recentemente identificati in pipistrelli, ma i loro stati tassonomici devono ancora essere determinato.

I pipistrelli sono i padroni naturali della maggior parte dei lissavirus, con l'eccezione di Mokola lyssavirus e Ikoma lyssavirus, che non sono ancora stati identificati in alcun pipistrelli1,2,3,6. Le informazioni sui lyssavirus nei pipistrelli asiatici sono ancora limitate. Due lissavirus non caratterizzati in pipistrelli asiatici (uno in India e l'altro in Thailandia)7,8 sono stati segnalati. Un caso di rabbia umana associato a un morso di pipistrello in Cina è stato segnalato nel 2002, ma la diagnosi è stata fatta solo dall'osservazione clinica9. In Asia centrale, Aravan lyssavirus è stato identificato nel pipistrello dalle ere di topo minore (Myotis blythi) in Kirghizistan nel 1991, e Khujand lyssavirus è stato identificato nel pipistrello baffi (Myotis mystacinus) in Tagikistan nel 200110. In Asia meridionale, Gannoruwa pipistrello lyssavirus è stato identificato nella volpe volante indiana (Pteropus medius) in Sri Lanka nel 20153. Nel sud-est asiatico, diversi studi sierologici sui pipistrelli nelle Filippine, Thailandia, Bangladesh, Cambogia e Vietnam hanno mostrato una sieroprevalence variabile11,12,13,14, 15. Anche se Irkut lyssavirus è stato identificato nel pipistrello dal muso tubolare maggiore (Murina leucogaster) nella provincia di Jilin, Cina nel 201216, le specie e le posizioni esatte dei lissavirus nelle popolazioni di pipistrelli dell'Asia orientale rimangono sconosciute.

Per valutare la presenza di lyssavirus nelle popolazioni taiwanesi di pipistrelli, è stato avviato un programma di sorveglianza che impiega sia il FAT diretto che il RT-PCR. Il lissavirus pipistreavirus di Taiwan è stato identificato in due casi di pipistrelle giapponese (Pipistrellus abramus)4 nel 2016-2017. Nel presente articolo, viene introdotta una procedura operativa standard di laboratorio per la sorveglianza del virus lissavirus della popolazione di pipistrelli a Taiwan. Il diagramma di flusso della diagnosi di bat lyssavirus nel nostro laboratorio è presentato in Figura 1.

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Protocollo

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1. Precauzioni di sicurezza durante la manipolazione dei lyssavirus

  1. Assicurarsi che tutti i lavoratori di laboratorio che gestiscono campioni di pipistrelli ricevano la profilassi di pre-esposizione sulla pilma17. Monitorare i livelli di anticorpi della rabbia dei lavoratori in anticipo e riesaminarli ogni 6 mesi17. La vaccinazione antirabbica di follow-up è necessaria per coloro i cui livelli di anticorpi sono inferiori a 0,5 IU/mL17.
  2. A seconda delle norme sulla biosicurezza del paese in cui si trova il laboratorio, assicurarsi che le seguenti procedure siano eseguite in laboratori adeguati per il livello di biosicurezza (ad esempio, laboratori BSL-2 nei laboratori di Taiwan e BSL-3 in Australia) e che lavoratori sono attualmente qualificati e indossano adeguate attrezzature di protezione personale18.
    NOTA: La vaccinazione antirabbica fornisce poca o nessuna protezione dai lissavirus appartenenti ai filogruppi II e III18. I lavoratori devono essere informati che diversi patogeni zoonotici sono stati identificati nei pipistrelli19 e devono gestire campioni in condizioni di laboratorio adeguate a livello di biosicurezza con adeguate attrezzature di protezione personale.

2. Raccolta di campioni

  1. Uso trovato pipistrelli deboli o malati o carcasse.
    NOTA: i pipistrelli deboli o malati vengono consegnati alla Bat Conservation Society di Taipei per cure veterinarie o ricerche, mentre le carcasse vengono presentate direttamente all'Animal Health Research Institute. Nessun pipistrelli sani è stato eutanasia in questo programma di sorveglianza.
  2. Chiedi a un ecologista pipistrello di identificare le specie di pipistrelli attraverso le caratteristiche morfologiche20.
  3. Eseguire il codice a barre del DNA delle specie di pipistrelli quando viene diagnosticato il virus lyssavirus, utilizzando procedure precedentemente pubblicate21.
  4. Invia una scheda informativa di ogni carcassa di pipistrello (sito di raccolta, specie, segni clinici, ecc.).

3. Necropria di campioni di pipistrelli

  1. Preparare i materiali.
    1. Preparare una tavola di dissezione pulita e posizionare un cuscinetto assorbente sterile per la necropsia.
    2. Preparare i tubi di raccolta per la raccolta di organi di pipistrello.
    3. Preparare pinzette e bisturi usa e getta monouso per necropsia. Cambia gli strumenti tra la necropsia di ogni pipistrello. Preparare i batuffoli di cotone inumiditi con il 70% di etanolo per la pulizia di pinzette e bisturi durante il campionamento.
    4. Preparare due vetrini al microscopio per il FAT. Raccogliere campioni freschi e fissarli in forma per l'esame istopatologico.
  2. Esaminare tutti gli orifizi esterni prima della necropsia. Fotografa le caratteristiche esterne del pipistrello, in particolare la testa, le orecchie e le ali, per differenziare le specie.
  3. Raccogliere un campione di tampone orale. Posizionare il pipistrello in recumbency ventrale sulla scheda e fissare la testa del pipistrello con una pinzetta. Tagliare la pelle lungo la linea mediana della calvaria con un bisturi e tirare la pelle ai lati laterali. Tagliare il cranio lungo la linea mediana della calvaria con un bisturi e aprirlo con una pinzetta per esporre il tessuto cerebrale.
  4. Rimuovere il tessuto cerebrale dal cranio e posizionarlo su un depressore sterile della lingua, e fare macchie di impressione dal tessuto cerebrale (vedere passo 4.2). Raccogliere un piccolo pezzo di tessuto cerebrale fresco e fissarlo in formalina per l'esame istopatologico. Contengono il tessuto cerebrale rimanente in un tubo per l'estrazione dell'acido nucleico.
  5. Pulire le pinzette e il bisturi con le sfere di cotone inumidite con 70% di etanolo per rimuovere i tessuti conservati tra la raccolta dei campioni.
  6. Posizionare il pipistrello sulla tavola in recumbency dorsale e fissarlo sulla scheda con aghi su entrambi i lati dell'ascellazione e tallone coda.
  7. Incise la pelle lungo la linea mediana del corpo dalla mandibola all'ano. Sollevare e separare la pelle e i tessuti muscolari sottostanti con una pinzetta. Raccogliere le ghiandole salivari, che sono vicino all'osso mandibolare.
  8. Sollevare leggermente lo sterno con una pinzetta e tagliare lo sterno e la parete addominale lungo la linea mediana con un bisturi. Tagliare le clavidi con un bisturi. Fissare le gabbie toraciche sinistra e destra sulla tavola con aghi per aprire la cavità toracica.
  9. Registrare le lesioni lorde e il grado di cambiamento post-mortem.
  10. Rimuovere i tessuti viscerali (ad esempio, cuore, polmoni, fegato, reni, intestini) dalla carcassa utilizzando una pinzetta e un bisturi. Raccogliere gli esemplari viscerali come necessario per la ricerca futura.
    NOTA: si consiglia la raccolta di campioni duplicati. Uno dovrebbe essere raccolto per la diagnosi molecolare, e l'altro dovrebbe essere congelato a -80 gradi centigradi con o senza mezzo di trasporto virale per la coltura virale22.

4. Test anticorpale fluorescente diretto (FAT)

  1. Fare impressione strisci del tessuto cerebrale per il FAT. Eseguire il FAT come descritto in precedenza18,23 con le seguenti modifiche.
  2. Separare delicatamente il tessuto cerebrale dal tessuto nervoso collegato con una pinzetta e trasferire il tessuto cerebrale a un depressore sterile della lingua. Tagliare la sezione trasversale del cervello, compreso il tronco encefalico e il cervelletto18,23. Fai impressione di strisci del tessuto cerebrale toccando leggermente la superficie di taglio del tessuto cerebrale e premi la diapositiva sul tessuto della lente per rimuovere il tessuto in eccesso.
  3. Fissare i vetrini con acetone a -20 gradi centigradi per 30 min. Asciugare i vetrini testati e i controlli positivi e negativi prima di colorare con coniugato.
  4. L'utilizzo di ciascuno dei due anticorpi anti-rabsia concordati FITC disponibili in commercio per l'antigene lissavirus colorazione è altamente raccomandato23. Determinare la concentrazione di lavoro del coniugato commerciale prima della prima colorazione. Far cadere i coniugati diluiti attraverso un filtro di siringa 0,45 M sui vetrini e incubare i vetrini a 37 gradi centigradi per 30 min all'interno di una camera bagnata.
  5. Scolare il coniugato in eccesso dai vetrini e lavare i vetrini con salina con buffer fosfato (PBS) dopo l'incubazione.
  6. Lasciare cadere una piccola quantità di 10% glicerolo sui vetrini e coprire con vetrini di copertura.
  7. Esaminare i vetrini con un microscopio fluorescente.

5. Estrazione di acido nucleico

  1. Aggiungere il volume corretto di MEM-10 (mezzo minimo essenziale integrato con 10% siero bovino fetale) al tessuto cerebrale (10% w/v).
  2. Omogenea del tessuto cerebrale con una perla d'acciaio da 5 mm in uno strumento omogenizzante e centrifuga a 825 x g per 10 min.
  3. Estrarre l'acido nucleico, il cui volume finale è di 50 gradi centigradi, entro 200 gradi del super-natante utilizzando il kit di estrazione dell'acido nucleico totale disponibile in commercio con lo strumento.

6. Analisi RT-PCR e filogenetica

NOTA: Sono stati pubblicati diversi set di primer per rilevare tutti i lissavirus noti o specifici lissavirus. Il protocollo qui descritto è un esempio che il nostro laboratorio utilizza e potrebbe non soddisfare tutte le esigenze sperimentali. Selezionare i primer adatti in base alle esigenze di laboratorio.

  1. Preparare il reagente RT-PCR in un solo passaggio come segue: aggiungere 5 ld di acido nucleico estratto alla miscela di reazione contenente 2,5 l di 10x buffer di reazione, 0,5 l di primer in avanti e indietro (10 M ciascuno), 4 L di 1,25 m dNTP, 0,3 l dell'inibitore di RNase (40 U/L) , 0,3 l di trascrizione inversa (10 U/L), 0,4 l di polimerasi di DNA (5 U/L) e 11,5 l di acqua trattata con DEPC.
    NOTA: il set di primer utilizzato in questo protocollo è JW12 (5'-ATGTAACACCYCTACAATG-3') e N165-146 (5'-GCAGGAYTTTACTCATA-3')24. Modificare la preparazione dei reagenti e le condizioni di ciclismo in base ai set di primer utilizzati.
  2. Eseguire il ciclismo nelle seguenti condizioni: incubazione a 42 gradi centigradi per 40 min; denaturazione iniziale a 94 gradi centigradi per 10 min; 35 cicli di 94 gradi centigradi per 30 s, 55 gradi centigradi per 30 s e 72 gradi centigradi per 30 s; e, infine, un'ulteriore estensione a 72 gradi centigradi per 10 min.
  3. Utilizzare un altro o più set di primer per aumentare la sensibilità diagnostica.
    1. Utilizzare N113F (5'-GTAGGATGCTATATGGG-3') e N304R (5'TTGACGAGAAGATTGCTCAT-3')25,26 per preparare il reagente RT-PCR in un solo passaggio come segue: aggiungere 5 l di acido nucleico estratto a una miscela di reazione contenente 5 primer in avanti e in senso inverso (4 m di ciascuno), 5 luna di 1,25 m dNTP, 0,5 l di inibitore di RNase (40 U/L), 0,2 l di trascrizione inversa (10 U/L), 1 l of DNA polymerase (5 U/L) e 23,3 l di acqua trattata con DEPC.
    2. Eseguire il ciclismo nelle seguenti condizioni: incubazione a 42 gradi centigradi per 40 min; denaturazione iniziale a 95 gradi centigradi per 5 min; 35 cicli di 95 gradi centigradi per 1 min, 55 gradi centigradi per 1 min e 20 s, e 72 gradi centigradi per 1 min; e, infine, un'ulteriore estensione a 72 gradi centigradi per 10 min.
      NOTA: A seconda delle esigenze di laboratorio, scegliere i primer adatti per la diagnosi. N113F è stato originariamente progettato per l'amplificazione del virus della rabbia, ma potrebbe non funzionare bene per altri lissavirus. Il set di N113F e N304R funziona bene per il virus della rabbia (variante di tasso di furetto di Taiwan) e il lissavirus del pipistrello di Taiwan. Sarà più facile ottenere intere sequenze di nucleoproteine utilizzando l'insieme di primer JW12 e N304R se il lissavirus viene amplificato da entrambi i due set di primer di cui sopra.
  4. Analizzare il prodotto PCR sul 2% di elettroforesi gel agarose e visualizzare con illuminazione della luce UV.
  5. Sequenziare il prodotto PCR per servizio di sequenziamento commerciale.
  6. Immettere o caricare la sequenza nella pagina Web dello strumento di ricerca allineamento locale di base Nucleotide (BLAST). Selezionare il database "altri (nr ecc.)" ed entrare nell'organismo come Lyssavirus. Selezionare l'algoritmo MegaBlast ed eseguire il BLAST.

7. Isolamento dei virus

NOTA: Eseguire l'isolamento del virus quando 1) il FAT o 2) il RT-PCR indica positività.

  1. Omogeneizzare il campione cerebrale in una sospensione del 10% (w/v) in MEM-10. Centrifuga a 825 x g per 10 min.
  2. Inoculare 200 -L di supernatant con una sospensione di 3 x 106 MNA (neuroblastoma murino) in 1 mL di MEM-10 per 1 h a 37 gradi centigradi con 1% di CO2. Trasferire la sospensione cervello omogenate-cell a un pallone da 25 cm2 e aggiungere 6 mL di MEM-10.
  3. Coltivare 1 mL di sospensione cervello a cellule omogenee in un vetrino in vetro rivestito in Teflon 4 pozzo con 6 mm di diametro allo stesso tempo.
  4. Dopo 3-4 giorni di incubazione a 37gradi centigradi con 1% di CO 2, fissare le cellule sul 4 bene scivolare con 100% acetone (v/v).
  5. Macchiare i vetrini con due anticorpi anti-rabbia coniugati FITC dopo i passi 4.4–4.7. Le cellule vengono infettate quando vengono studiate le inclusioni intracitole. Registrare la percentuale di cellule infette.
  6. Eseguire la propsinizzazione e la sottocultura della coltura cellulare inoculata quando i vetrini sono macchiati come negativi:
    1. Rimuovere il mezzo e sciacquare il pallone con 5 mL di PBS.
    2. Aggiungere 1 mL di ciuffo alla fiaschetta e colpire saldamente il fondo del pallone.
    3. Aggiungere 6 mL di MEM-10 e sospendere nuovamente le celle.
    4. Mettere la sospensione cellulare in un nuovo fiaschetta di tessuto (6 mL) e su un 4 pozzetto (1 mL).
  7. Ripetere i passaggi da 7,4 a 7,6 fino a raggiungere l'infettività al 100%.
  8. Raccogliere il supernatante dopo 24 h di incubazione.

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Risultati

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Dal 2014 al maggio 2017 sono state raccolte 332 carcasse di pipistrelli di 13 specie per la sorveglianza. Due sono risultati positivi. Nel primo caso di pipistrello, l'impronta cerebrale è risultata negativa utilizzando ilFAT con uno degli anticorpi commerciali anti-rabies coniugati FITC (Figura 2), mentre gli RT-PCR che impiegano ciascuno dei due set di primer (JW12/N165-146, N113F/N304R) hanno risultati positivi (Figura 3). È stata ottenuta una sequenza di amp...

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Discussione

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Questa procedura operativa standard di laboratorio (SOP) fornisce un processo seriale per testare campioni di pipistrelli per la presenza di antigeni lyssavirus a Taiwan. I passaggi chiave includono l'impiego di FAT e RT-PCR. Anche la selezione di campioni adatti e l'isolamento di successo del virus sono importanti. Inoltre, alcuni problemi è stata condotta durante il monitoraggio dei lissavirus pipistrello. La differenza principale era l'animale bersaglio. Inizialmente (2008-2009), gli animali bersaglio della sorveglian...

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Dichiarazioni

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Non vengono dichiarati conflitti di interesse.

Ringraziamenti

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Ringraziamo Tien-Cheng Li, Yi-Tang Lin, Chia-Jung Tsai e Ya-Lan Li per la loro assistenza durante questo studio. Questo studio è stato sostenuto dalla sovvenzione n. 107AS-8.7.1-BQ-B2 (1) del Bureau of Animal and Plant Health Inspection and Quarantine, Council of Agriculture, Executive Yuan, Taiwan.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
2,5% Tripsina (10x)Gibco15090046Tripsina
25 cm2 palloneGreiner bio-one690160
AcetoneHoneywell32201-1L
Agarosio IVWR Life Science97062-250
AlcoolNIHON SHIYAKU REAGENTENS-32294
AMV Trascrittasi inversaPromegaM5101
Antibiotico-Antimicotico (100X) Gibco15240-062MEM-10
BladeBraunBA215
Centrifugaeppendorf5424R
Sistema di chemiluminanzaTOP BIO CO.MGIS-21-C2-1M Provetta
di raccoltaQiagen990381
Provetta di raccoltaSSI2341-SO
Vetrino di coperturaMuto Pure chemical Co., LTD.24505
Analizzatore di DNAApplied Biosystems3700XL
Siero fetale bovinoGibco10437028MEM-10
FITC Anti-rabbia Globulina monoclonaleFujirebio Diagnostic Inc.800-092Anticorpi antirabbici coniugati FITC: reagente B
Vetrino in vetro con rivestimento in teflon a quattro pozzettiThermo Fisher Scientific30-86H-WHITE
Sistema di elettroforesi su gelMajor ScienceMJ-105-R
HBSS (1x)Incubatore Gibco14175095tripsina
ASTECSCA-165DS
Microscopio invertitoOlympusIX71
L-Glutammina 200 mM (100x)GibcoA2916801MEM-10
LIGHT DIAGNOSTICS Reagente per la rabbia Reagente per grassiEMD Millipore Corporation5100Anticorpi antirabbici coniugati FITC: reagente A
MagNA Pure Compact InstrumentRoche03731146001
MagNA Pure Compact NA Isolation Kit 1Roche 03730964001
MEM (10x)Gibco11430030MEM-10
MEM NEAA (100x)Gibco11140050MEM-10
MEM soluzione vitaminicaGibco11120052MEM-10
NaHCO3Merck1.06329.0500MEM-10
AgoTerumoNN*2332R9
PBSMedicago09-8912-100
Sintesi del primerMission Biotech
Inibitore della RNasina ribonucleasiPromegaN2111
Servizio di sequenziamentoMission Biotech
SlideThermo ScientificAA00008032E00MNT10
Piruvato di sodio (100 mM)Gibco11360070MEM-10
Perline in acciaio inossidabileQIAGEN69989
Tampone assorbente sterile3M1604T-2
Filtro per siringaNalgene171-0045
Taq polimerasiJMR HoldingsJMR-801
TermociclatoreApplied Biosystems2720
TissueLyser IIQIAGEN85300
AbbassalinguaHONJER CO., LTD.
PinzettaTennyson strumento medico in via di sviluppo CO., LTD.A0601
Tartrato di TilosinaSigmaT6271-10GMEM-10
122246

Riferimenti

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