Il kit di diagnostica FL-DNA è un metodo che consente di risparmiare tempo e di utilizzare per determinare la probabilità affidabile della presenza di lesioni del cancro colorettale.
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Articolo metodologico
Valutazione del rischio di cancro colorettale e della prevalenza da parte del rilevamento dell'integrità del DNA delle feci
In questo articolo
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Sommario
Abstract
Al giorno d'oggi, il DNA delle feci può essere isolato e analizzato con diversi metodi. I lunghi frammenti di DNA nelle feci possono essere rilevati da un test qPCR, che fornisce una probabilità affidabile della presenza di lesioni colorettali pre-neoplastiche o neoplastiche. Questo metodo, chiamato DNA lungo a fluorescenza (FL-DNA), è una procedura veloce e non invasiva che è un miglioramento del sistema di prevenzione primario. Questo metodo si basa sulla valutazione dell'integrità del DNA fecale mediante amplificazione quantitativa di specifici obiettivi del DNA genomico. In particolare, la valutazione di frammenti di DNA più lunghi di 200 bp consente di rilevare pazienti con lesioni colorettali con specificità molto elevata. Tuttavia, questo sistema e tutti i test del DNA delle feci attualmente disponibili presentano alcuni problemi generali che devono essere affrontati (ad esempio, la frequenza con cui devono essere effettuati i test e il numero ottimale di campioni di feci raccolti in ogni momento per ogni individuo). Tuttavia, il principale vantaggio di FL-DNA è la possibilità di usarlo in associazione con un test attualmente utilizzato nel programma di screening CRC, noto come esame del sangue occulto fecale a base immunochimica (iFOBT). Infatti, entrambe le prove possono essere eseguite sullo stesso campione, riducendo i costi e ottenendo una migliore previsione dell'eventuale presenza di lesioni colorettali.
Introduzione
Il cancro colorettale (CRC) deriva da un processo a più fasi in cui l'epitelio sano si sviluppa lentamente in adenomi o polipi, che progrediscono in carcinomi maligni nel tempo1,2. Nonostante l'elevato tasso di incidenza del CRC, nell'ultimo decennio3è stata osservata una tendenza al ribasso della percentuale di decessi. Infatti, i primi strumenti diagnostici adottati nei programmi di screening hanno portato alla diagnosi precoce e alla rimozione di adenomas pre-neoplastici o polipi4. Tuttavia, a causa dei diversi limiti tecnici, nessuno di questi metodi è ottima....
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Protocollo
I pazienti sono stati assunti presso l'Istituto Roma Romagnolo per lo Studio e la Cura del Tumori (IRST) di Meldola (FC, Italia) tra il 2013 e il 2015. I pazienti arruolati erano nel protocollo IRSTB002, approvato dal Comitato Etico dell'IRST - IRCCS AVR (25/10/2012, ver. 1). Tutti i metodi sono stati eseguiti in conformità con le linee guida e i regolamenti pertinenti. Il consenso informato scritto è stato ottenuto da tutti i pazienti.
1. Estrazione del DNA dalle feci
- Utilizzare un kit per preparare esempi di feci (vedere Tabella dei materiali). Selezionare e trattare il materiale fecale eseguend....
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Risultati
Il flusso di lavoro di questo protocollo è illustrato nella Figura 1. Il flusso di lavoro fornisce due passaggi di controllo e azioni diverse in base a questi risultati. In primo luogo, se un campione presenta controlli inadatti, l'amplificazione deve essere ripetuta. In secondo luogo, se l'amplificazione è inibita, il campione deve essere rielaborato dall'inizio o classificato come non prezioso.
La figura 2 mostra le curve di fluorescenza prodotte da campioni.......
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Discussione
Studi precedenti hanno dimostrato che l'analisi dell'integrità del DNA delle feci estratte da approcci manuali e semiautomatici può rappresentare uno strumento alternativo per la diagnosi precoce delle lesioni colorettali7,8,9,,10,11,12. Nel corso degli anni sono stati sviluppati test molecolari di screening non invasivi per .......
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Dichiarazioni
Maura Menghi è dipendente a tempo pieno di Diatech Pharmacogenetics srl.
Ringraziamenti
Gli autori non hanno alcun riconoscimento.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Provette twist-lock in polipropilene da 1,5 mL e 2 mL (prive di inibitori di DNasi, RNasi, DNA, PCR) | Materiali di consumo necessari per l'estrazione del DNA e la PCR in tempo reale | ||
| Etanolo assoluto (qualità del grado analitico) | Reagente necessario per l'estrazione del DNA | ||
| Centrifuga da banco | Velocità massima di 20000 x g. Strumento necessario per l'estrazione del DNA | ||
| Software di analisi EasyPGX versione 2.0.0 | Diatech Pharmacogenetics | RT800-SW | Software di analisi |
| Centrifuga/vortice EasyPGX Strisce a 8 pozzetti | Diatech Pharmacogenetics | RT803 | Strumento consigliato per il saggio di PCR in tempo reale |
| Strumento EasyPGX qPCR 96 | Diatech Pharmacogenetics | RT800-96 | Strumento consigliato per il test Real Time PCR |
| EasyPGX ready FL-DNA Diatech | Pharmacogenetics | RT029 | Kit necessario per il test Real Time PCR |
| Micropipette (volumi da 1 a 1.000 & micro; L) | Materiali di consumo necessari per l'estrazione del DNA e la Real Time PCR | ||
| monouso senza polvere | Materiali di consumo necessari per l'estrazione del DNA e la Real Time PCR | ||
| QIAamp Fast DNA Sgabello | Qiagen | 51604 | Kit consigliato per l'estrazione e la purificazione del DNA dalle feci |
| Puntali con filtro sterili privi di DNasi, RNasi (volumi da 1 a 1.000 µ L) | Materiali di consumo necessari per l'estrazione del DNA e la PCR in tempo reale | ||
| Blocco termico, ad es. blocco secco EasyPGX | Diatech Pharmacogenetics | RT801 | Strumento necessario per l'estrazione del DNA |
| Vortex, ad es. centrifuga/vortice EasyPGX 1,5 ml | Diatech Pharmacogenetics | RT802 | Strumento necessario per l'estrazione del DNA |
Riferimenti
- Fearon, E. R. Molecular Genetics of Colorectal Cancer. Annual Review of Pathology. 6, 479-507 (2011).
- Sears, C. L., Garrett, W. S. Microbes, Microbiota, and Colon Cancer. Cell Host and Microbe. 15, 317-328 (2014).
- SEER Stat Fact Sheets: Colon and Rectum Cancer. National....
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Ristampe e permessi
Errata corrige
Formal Correction: Erratum: Evaluation of Colorectal Cancer Risk and Prevalence by Stool DNA Integrity Detection
Posted by JoVE Editors on 9/28/2020. Citeable Link.
An erratum was issued for: Evaluation of Colorectal Cancer Risk and Prevalence by Stool DNA Integrity Detection. An affiliation was updated.
The first affiliation was updated from:
Istituto Scientifico Romagnolo per lo Studio e la Cura dei Tumori (IRST)
to:
Istituto Scientifico Romagnolo per lo Studio e la Cura dei Tumori (IRST) IRCCS, Meldola, Italy
