Tecnologia CRISPR/Cas9 nel ripristino dell'espressione della distrofina nei progenitori muscolari derivati da iPSC

Sommario

Qui, presentiamo un protocollo di eliminazione exon23 basato su Cas9 per ripristinare l'espressione distrofina in iPSC da fibroblasti cutanei derivati da mouse^mdx Dmd e differenziare direttamente gli iPSC in cellule progenitrici miogenie (MPC) utilizzando il sistema di attivazione Tet-on MyoD.

Abstract

La distrofia muscolare di Duchenne (DMD) è una grave malattia muscolare progressiva causata da mutazioni nel gene della distrofina, che alla fine porta all'esaurimento delle cellule progenitrici muscolari. L'editing genico a breve area(CRISPR/Cas9) interspaziale regolarmente interspaziale ha il potenziale per ripristinare l'espressione del gene della distrofina. Le cellule progenitrici muscolari derivate da cellule staminali muscolari (MPC) autologhe indotte possono ricostituire il pool di cellule staminali/progenitrici, riparare i danni e prevenire ulteriori complicazioni nella DMD senza causare una risposta immunitaria. In questo studio, introduciamo una combinazione di CRISPR/Cas9 e tecnologie iPSC non integrate per ottenere progenitori muscolari con espressione proteica di distrofina recuperata. In breve, utilizziamo un vettore Sendai non integrato per stabilire una linea iPSC dai fibroblasti dermici dei topi^mdxi Dmd. Usiamo quindi la strategia di eliminazione CRISPR/Cas9 per ripristinare l'espressione della distrofina attraverso un'unione finale non omologa del gene della distrofina riformulato. Dopo la convalida PCR dell'esaurimento dell'eso23 in tre colonie da 94 colonie iPSC selezionate, differenziamo iPSC in MPC per espressione indotta da Dox (Dox) di MyoD, un fattore chiave di trascrizione che svolge un ruolo significativo nella regolazione della differenziazione muscolare. I nostri risultati mostrano la fattibilità dell'utilizzo della strategia di eliminazione CRISPR/Cas9 per ripristinare l'espressione della distrofina nell'MPC derivato da iPSC, che ha un potenziale significativo per lo sviluppo di future terapie per il trattamento della DMD.

Introduzione

La distrofia muscolare di Duchenne (DMD) è una delle distrofie muscolari più comuni ed è caratterizzata dall'assenza di distrofina, che colpisce 1 di circa 5.000 neonati in tutto il mondo¹. La perdita della funzione genica della distrofina si traduce in difetti muscolari strutturali che portano alla degenerazione progressiva delle miofibre^1,2. Il sistema di terapia genica mediata da un virus adeno ricombinante (rAAV) è stato testato per ripristinare l'espressione della distrofina e migliorare la funzione muscolare, come la sostituzione genica utilizzando micro-distrofine. Tuttavia, l'approccio rAAV richiede iniezioni ripetute per sostenere l'espressione della proteina funzionale^3,4. Pertanto, abbiamo bisogno di una strategia in grado di fornire in modo efficace e permanente l'espressione genica della distrofina nei pazienti con DMD. Il topo^mdx Dmd, un modello murino per la DMD, ha una mutazione puntiforme nell'esone 23 del gene della distrofina che introduce un codone di terminazione prematura e si traduce in una proteina troncata non funzionale alla mancanza del dominio di legame disproglycan del terminale C. Recenti studi hanno dimostrato l'uso della tecnologia CRISPR/Cas9 per ripristinare l'espressione genica della distrofina mediante una correzione genica accurata o la delezione di esoni mutanti in animali piccoli e grandi^5,6,7. Long et al.⁸ ha riportato il metodo per correggere la mutazione del gene distrofina nella germina murina^mdx Dmd mediante la riparazione diretta da omologia (HDR) basata sull'editing del genoma CRISPR/Cas9. El Refaey et al.⁹ ha riferito che rAAV potrebbe in modo efficiente eccitare l'esone mutante 23 in topi distrofici. In questi studi, i gRNA sono stati progettati negli introni 20 e 23 per causare rotture del DNA a doppio filamento, che hanno parzialmente ripristinato l'espressione della distrofina dopo la riparazione del DNA tramite l'unione finale non omologa (NHEJ). Ancora più eccitante, Amoasii et al.¹⁰ hanno recentemente riportato l'efficacia e la fattibilità dell'editing genico CRISPR mediato da rAAV nel ripristino dell'espressione della distrofina nei modelli canini, un passo essenziale nella futura applicazione clinica.

La DMD causa anche disturbi delle cellule staminali¹¹. Per danni muscolari, le cellule staminali muscolari residenziali riforniscono le cellule muscolari morenti dopo la differenziazione muscolare. Tuttavia, i cicli consecutivi di lesioni e riparazione portano ad accorciamento dei telomeri nelle cellule staminali muscolari¹², e l'esaurimento prematuro di piscine di cellule staminali^13,14. Pertanto, una combinazione di terapia autologa con l'editing del genoma per ripristinare l'espressione della distrofina può essere un approccio pratico per il trattamento della DMD. La tecnologia CRISPR/Cas9 offre la possibilità di generare cellule staminali pluripotenti indotte geneticamente corrette autologie (iPSC) per la rigenerazione muscolare funzionale e prevenire ulteriori complicazioni della DMD senza causare il rigetto immunitario. Tuttavia, gli iPSC hanno un rischio di formazione del tumore, che potrebbe essere alleviato dalla differenziazione dell'iPSC nelle cellule progenitrici miogeniche.

In questo protocollo, descriviamo l'uso del virus Sendai non integrato per riprogrammare i fibroblasti dermici di topi^mdxi Dmd in iPSC e quindi recuperiamo l'espressione della distrofina con la cancellazione del genoma CRISPR/Cas9. Dopo la convalida della delezione di Exon23 in iPSC mediante genotipizzazione, abbiamo differenziato l'iPSC corretto dal genoma in progenitori miogenici (MPC) tramite la differenziazione miogenica indotta da MyoD.

Protocollo

Tutte le procedure di movimentazione e chirurgia degli animali sono state eseguite da un protocollo approvato dall'Augusta University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). I topi sono stati alimentati dieta standard e acqua al libitum.

1. Isolamento dei fibroblasti di topi primari da topi^mdx adulti Dmd

1. Eutanasia adulto Dmd topi^mdxi (maschio, 2 mesi) da CO₂ asfissia e toracotomia secondo IACUC approvato dal Medical College of Georgia, Università di Augusta. Tagliare la coda con un bisturi sterile in una condizione sterile sotto il cofano laminare. Sciacquare la coda con il 70% di etanolo per 5 min, quindi lavare con sterile fosfato buffersina salina (PBS) in un piatto di 6 cm.
2. Sbucciare la pelle della coda da una forte incisione dalla base alla punta della coda lungo la pelle della coda, quindi staccare delicatamente la pelle della coda con una pinzetta. Tritare la pelle a 1 mm³ utilizzando un bisturi sterile e spostare il tessuto cutaneo macinato in un piatto di 6 cm nel mezzo essenziale minimo di Dulbecco/Ham's F12 (DMEM/F12) contenente lo 0,1% collagenase IV e 1 U/mL di dispase.
3. Digerire il tessuto cutaneo in un piatto di coltura per 2 h a 37 gradi centigradi in un'incubatrice di CO₂ del 5%.
4. Coprire una piastra a 6 pozzetti con fibronectina e 0,2% di gelatina (1 mL di fibronectina in 199 mL di gelatina dello 0,2%; Tabella dei materiali) e incubare a 37 gradi centigradi per 1 ora.
5. Dissociare il tessuto cutaneo digerito con una punta pipet da 1 mL e trasferire il tessuto e il supernatante in un tubo di centrifuga conico sterile da 15 mL. Centrifuga a 217 x g per 3 min a temperatura ambiente, scartare il super-atante e risospendere il pellet in 1,5 mL di fibroblasto medio (Tabella dei Materiali).
6. Cultura i pellet, compreso il tessuto cutaneo incompleto digerito dal punto 1,5 sulla piastra a 6 pozzetti rivestita con fibronectina e 0,2% di gelatina dal punto 1,4 in un'incubatrice di 37 gradi centigradi, 5% di CO_2. Sostituire il mezzo 24 h dopo la placcatura iniziale per rimuovere le celle non attaccate e modificare il mezzo ogni 48 h.

2. Riprogrammazione dei fibroblasti cutanei dei topi in iPSC

1. Due giorni prima della trasduzione, i fibroblasti dermici del topo digerito dal punto 1.6 con la soluzione di distacco cellulare (Tabella dei materiali) in un'incubatrice a 37 gradi centigradi con un'atmosfera umidizzata del 5% di CO₂ per 5 min.
2. Contare le cellule usando un emacytometro e centrifugare a 217 x g per 3 min.
3. Le cellule di semi ad una densità di 1x2 x 10⁵ cellule per pozzo su una piastra e coltura di 6 pozzetti con fibroblasto medio (Tabella dei materiali) in un'incubatrice a 37 gradi centigradi con un'atmosfera umidificata del 5% di CO₂.
4. Il giorno della trasduzione (giorno 0), stimare le cellule e calcolare il volume di ogni virus necessario per raggiungere la molteplicità bersaglio di infezione (MOI) di 5, 5 e 3 (ad es. KOS MOI - 5, hc-Myc MOI - 5, hKlf4 MOI - 3) secondo il manuale commerciale.

5. Scongelare tre tubi Sendai in un bagno d'acqua di 37 gradi centigradi per 5x10 s e aggiungere i volumi calcolati di ciascuno dei tre tubi Sendai a 1 mL di mezzo fibroblasto (Tabella dei Materiali).
6. Rimuovere il supporto fibroblasto dal passaggio 2.3 e aggiungere la miscela di virus di riprogrammazione ai pozze contenenti le cellule. Incubare le cellule durante la notte in un'incubatrice a 37 gradi centigradi con un'atmosfera umidizzata del 5% di CO₂.
7. Sostituire il mezzo con fibroblasto fresco medio 24 h dopo la trasduzione. Coltura le cellule per una settimana con scambio medio a giorni alterni.
8. Raccogliere i fibroblasti di topo infetti il giorno 7 dopo la trasduzione con 0.05% trypsin / EDTA e posizionare su piatti che sono precedentemente rivestiti con fibronectina e 0.2% gelatina.
9. Cultura i fibroblasti di topo infetti dal passo 2.6 con mezzo di crescita completo delle cellule staminali embrionali del topo (ES) (Tabella dei materiali) in un incubatore di 37 C con un'atmosfera umidificata del 5% di CO₂ e cambiare media quotidiana.
10. Dall'ottavo giorno, osservare la piastra al microscopio invertito ogni due giorni per identificare la comparsa di grumi cellulari con la morfologia del topo ES.

3. Utilizzo di fosfopfoplasmasi dal vivo macchia e citometria di flusso per quantificare l'efficienza di riprogrammazione

1. Rimuovere i supporti di coltura da ogni pozzo e risciacquare con DMEM/F-12 per 2/3 min.
2. Applicare 2 mL di 1x soluzione di lavoro con macchie alcaline (AP) (1:500 diluizione in DMEM/F-12) alle cellule aderenti e incubare in un'incubatrice a 37 gradi centigradi con un'atmosfera umidificata del 5% CO₂ per 30 min.
3. Aspirati la macchia live AP e lavate due volte con PBS per 5 min ciascuno.
4. Digerire le cellule con la soluzione di distacco cellulare (Tabella dei materiali) in un'incubatrice a 37 gradi centigradi con un'atmosfera umidificata del 5% di CO₂ per 5 min. Eseguire la citometria di flusso per determinare l'efficienza di riprogrammazione.

4. Selezione e raccolta di cellule simili a ES

1. Esaminare le colonie dal punto 2.8 al microscopio invertito.
2. Contrassegnare le colonie nella parte inferiore del piatto con un marcatore di oggetto auto-input.
3. Applicare anelli di clonazione ingrassati per coprire le colonie cellulari marcate. Aggiungete 100 l di 0,05% di trypsin/EDTA ad ogni anello di clonazione a 37 gradi centigradi per 5 minuti, quindi trasferite le celle digerite con 100 punte di pipetta a 48 vacille contenenti mezzo di crescita mES.
4. Incubare le cellule in lastre di coltura di 48 pozzi in un'incubatrice di 37 gradi centigradi con un'atmosfera umidizzata del 5% di CO₂. Passare le cellule a piatto 6 cm quando raggiungono 70% confluenza.
5. Ripetere i passaggi 4.3 e 4.4 per più volte fino a ottenere cloni uniformi a forma di dormitorio.

5. Congelamento degli iPSC per la crioconservazione

1. Dissociare gli iPSC selezionati dal passaggio 4.5 con trypsin, versene e plasma per pulcini (TVP; Tabella dei materiali) a 37 gradi centigradi in un'incubatrice di CO₂ del 5% per 30 min.
2. Raccogliere le cellule in un tubo conico sterile da 15 mL e centrifugare a 217 x g per 3 min a temperatura ambiente.
3. Aspirare il supernatante e sospendere nuovamente il pellet cellulare in 2 mL di mouse ES congelato medio (Tabella dei materiali) per ottenere 1 mL per crioviale.
4. Aggiungere le cellule ai criovial e congelare utilizzando un contenitore di congelatore che fornisca il tasso di raffreddamento critico e ripetuto -1/min necessario per la crioconservazione a -80 gradi durante la notte.
5. Trasferire le fiale congelate in un serbatoio di azoto liquido.

6. Colorazione dell'immunofluorescenza per marcatori di cellule staminali negli iPSC

1. IPSC di semi da passo 5.1 coltivato con mezzo mES in uno scivolo a 8 camere rivestito con poli-D-lysine/laminina (Tabella dei materiali) alla densità appropriata per raggiungere tra 1/2 x 10 4^cellule per bene e incubare in un incubatore di 37 umidificata del 5% di CO₂ per 48 h.
2. Immergere i vetrini nel 4% di formaldeide per 15 min a temperatura ambiente, quindi immergere i vetrini in PBS due volte per 5 min ogni volta.
3. Incubare sezioni con un reagente di blocco IgG del topo (Tabella dei materiali)e il siero di capra del 5% per 1 h a temperatura ambiente.
4. Diluire gli anticorpi primari nel diluente proteico (topo anti-SSEA1, 1:100, coniglio-anti-Nanog, 1:500; coniglio-anti-POU classe 5 omeobox 1 [OCT4], 1:500; coniglio-anti-SRY-box 2 [SOX2], 1:500; coniglio-anti-Lin-28 homolog A [Lin28A], 1:400) ( Tabella della tabella della tabella della tabelladella Materiali). Applicare anticorpi sulle cellule e incubare a 4 gradi centigradi durante la notte in una camera umidificata.
5. Eliminare la soluzione anticorpale primaria e lavare i vetrini 3x in PBS.
6. Applicare i secondi anticorpi (anticorpo di capra-anti-tono coniugato Alexa488 e capra coniugata ad Alexa555 a temperatura ambiente, 1:400 ciascuno) in diluente proteico M.O.M. sui vetrini e incubare per 45 min a temperatura ambiente.
7. Lavare i vetrini 3x in PBS e montare le sezioni con supporto di montaggio contenente 4'6-diamidino-2-fenylindole (DAPI).
8. Scattare foto con un microscopio confocale.

7. Indagare sulla pluripotenza degli iPSC in vivo

1. Dissociare gli iPSC dal passo 5.1 in singole cellule utilizzando la soluzione TVP in un incubatore a 37 gradi centigradi con un'atmosfera umidizzata del 5% di CO₂ per 30 min.
2. Contare le cellule usando un emacytometro e centrifugare a 217 x g per 3 min.
3. Aspirare il supernatante e risospendere il pellet con mezzo mES in un tubo di centrifugazione sterile da 1,5 ml ad una concentrazione di 5 x 10⁵ cellule/30 L per il trapianto di cellule.
4. Rimuovere i capelli da entrambi gli arti posteriori dei topi immunodeficienti utilizzando tagliacapelli.
5. Anestesizzare i topi con chetamina (100 mg/kg) e pulire il sito di iniezione con il 75% di alcol.
6. Iniettare 30 l di sospensione iPSC dal punto 7.3 intramuscolare nel gastrocnemii, utilizzando un ago da 31 G.
7. Due settimane dopo l'iniezione, raccogliere i gastrocnemii del topo e incorporare in composto di temperatura di taglio ottimale (OCT), scattare congelare e tagliare in 5-m sezioni^15,16.
8. Fissare le sezioni in formaldeide 4% per 15 min a temperatura ambiente, e poi lavare i vetrini due volte in PBS per 5 min ogni volta.
9. Bloccare le cellule con 5% diluente proteico del siero di capra per 1 h a temperatura ambiente.
10. Aggiungere anticorpo primario diluito (coniglio anti-AFP, 1:50; coniglio anti-SMA, 1:50; coniglio anti-TH, 1:50) agli scivoli e incubare a 4 gradi durante la notte in una camera umida.
11. Eliminare la soluzione anticorpale primaria, lavare le cellule 3x (5 min/wash) in PBS, aggiungere un anticorpo di 1:400 Alexa555-coniugato capra-anti-coniglio a vetrini, e incubare per 45 min a temperatura ambiente.
12. Lavare i vetrini 3x (5 min/lavaggio) in PBS e montare le sezioni con il supporto di montaggio contenente DAPI.

8. Costruzione di introni vettoriali lentivirali CRISPR/Cas9 che fiancheggiano la distrofina 23

1. Progetta due coppie di oligogno gRNA che prendono di mira la distrofina ditrontrophina fiancheggiata da introni 23 tramite http://crispor.tefor.net/crispor.py.
   NOTA: Le coppie progettate sono le seguenti:
   i22sense: 5'-CACCGTTAAGCTTAGGTAAATCAA- 3'
   i22anti-sense: 5'-AAACTTGATTTTACCTAGCTTAAC-3'
   i23sense: 5'-CACCGAGTAATGTGTCATACCTTCT- 3'
   i23anti-sense: 5'-AAACAGAAGGTATGACACATTACTC-3').
2. Digest e dephosphorylate 5 g di plasmide di CRISPR lentivirale (lenti-CRISPRv2-blast [un regalo di Mohan Babu] e lenti-Guide-Hygro-iRFP670 [un regalo di Kristen Brennand]) (Tabella dei materiali)con BsmB1/Esp3I per 30 min a 37 gradi centigradi. Per 5 g di plasmidi, aggiungere 3 -L l di BsmB1 limitare l'enzima, 3 -L di fosforo veloce, 6 -L di 10x buffer di digerimento dell'enzima e 0,6 di 100 mM DTT in reazione 60 .
3. Caricare le reazioni su un gel di agarose dello 0,8%. Eseguire il gel a 100-150 V per 30 min.
4. Purificare il plasmide digerito in gel utilizzando un kit di estrazione gel (Tabella dei materiali) ed eluire in 20 .L di H₂O.
5. Fosforolate e anneal ogni coppia di oligonucleotidi gRNA contenenti 1 L di ogni oligonucleotide a 100 m, 1 L di 10 x T4 tampone di ligazione, 0,5 L di T4 polynucleonucleotide kinase (PNK), 6,5 l di ddH₂O a 37 gradi centigradi per 30 min, e poi 95 Gradi C per 5 min e quindi rampa d.c. a 25 gradi centigradi a 5 gradi centigradi/min.
6. Ligate una diluizione 1:200 degli oligonucleotidi gRNA annessi nell'abbondanteCRISPR V2-Blast o plentiGuide-Hygro-iRFP670. Mescolare 50 ng di vettori digeriti BsmB1/Esp3I, con 1 L di oligo duplex diluito e 5 l una di tampone da 2x ligase più 1 L di ligase in un sistema di reazione a 11 gradi e incubare per 10 min a temperatura ambiente.
7. Eseguire la trasformazione con 3 -L di prodotto di ligazione in 50 celle competenti (Tabella dei materiali) secondo le istruzioni del produttore.
8. Stendere le celle competenti trasformate in una piastra di agar con 100 g/mL di carbenicillina e incubare a 31,5 gradi centigradi per 18 ore.
9. Raccogliere colonie con 10 punte sterili e coltura in 5 mL di brodo formidabile (Table of Materials) contenenti 100 carbenicillina s/mL a 31,5 gradi centigradi, 185 rpm in un'incubatrice di shaker per 21 h.
10. Purificare il DNA plasmide utilizzando i kit mini-prep e midi-prep (Tabella dei materiali).
11. Verificare i plasmidi mini-prep per digestione di restrizione. Per il sistema di reazione a 20 ,l, aggiungere 1 g di DNA plasmide, 2 ll di buffer di reazione del digest (Tabella dei materiali) e 1 l di miscela enzimatica di restrizione (0,5 L di KpnI-HF e 0,5L di AgeI-HF per implentiR - V2-Blast-i22; 0,5 . ablentiGuide-Hygro- iRFP670- i23). Incubare il sistema di reazione per 1 h a 37 .
12. Caricare le reazioni su un gel di agarose dello 0,8%. Eseguire il gel a 100-150 V per 30 min.
    NOTA: le bande corrette per l'ablentiCRISPR V2-Blast-i22 devono essere 622 bp e 12,2 kb e le bande corrette per plentiguide-Hygro- iRFP670- i23 devono essere 2,6 kb e 7,1 kb.

9. Imballaggio vettoriale Lentivirale

1. Coltura 7 x 10^{5 293FT} cellule in 5 mL di supporti DMEM contenenti 10% siero bovino fetale in un piatto di 6 cm durante la notte a 37 gradi Centigradi, 5% CO₂.
2. Preparare un cocktail (1 g di plasmide di confezionamento plentirCRISPR V2-Blast-i22 o lentiguida-Hygro-iRFP670-i23, 750 ng di plasmide di imballaggio psPAX2, 250 ng di pMD2.G invilupmida di busta di pMD2.G e 5 -L di reagente di trasfezione A [Tabella dei materiali] in 100 - L di supporto MEM ridotto del siero).
3. Preparare una miscela di 5 -L di reagente di trasfezione B (Tabella dei materiali) in 100 -L di supporto MEM ridotto.
4. Aggiungete 100 l di miscela di reagente di trasfezione B alla miscela di plasmide dal punto 9.2 e incubate per 5 min a temperatura ambiente.
5. Aggiungere il complesso DNA-lipidico (dal punto 9.4) dropwise alle cellule 293FT. Incubare pernottamento a 37 gradi centigradi con il 5% di CO₂.
6. Aggiungere potenziatore di produzione di virus (500x) (Tabella dei materiali) ad ogni piatto il giorno successivo e incubare per 24 h a 37 gradi centigradi, 5% CO₂.
7. Raccogliere il mezzo dalle cellule utilizzando pipette nei due giorni successivi e filtrare il mezzo attraverso un filtro 0,45 m per rimuovere le cellule.

10. Concentrazione e purificazione dei vettori lentivirali

1. Vettore lentivirale precipitare nel mezzo della fase 9,7 durante la notte a 4 gradi centigradi con 5x di polietilene glicole 4000 (PEG4000, 8,5% concentrazione finale) e 4 M NaCl (concentrazione finale 0,4 M).
2. Centrifugare il supporto virale contenente la soluzione PEG4000 a 2.095 x g e 4 gradi centigradi per 30 min, rimuovere e scartare il supernatante.
3. Risospendere i pellet con 500 l di siero ridotto MEM media (lentivirus titro: lenti-CRISPR V2-gRNAi22: 1.56 x 10⁸, lenti-iRFP670-gRNAi23: 1.3 x 10 8 , lenti-CRISPR V2-controllo: 3.13 x 10⁷, lenti-iRFP670-control: 5.3 x 10^x10.5 ). Conservare a -80 gradi centigradi fino all'uso.

11. Cancellazione di exon 23 in iPSC mouse con due RNA guida (gRNA) accoppiati con Cas9

1. Piattare gli iPSC del topo dal punto 4.5 in una piastra da 24 pozzetti rivestita con fibronectina e gelatina.
2. Dopo che le cellule raggiungono il 50% di confluenza, passare al mezzo di coltura fresco (mezzo di crescita delle cellule staminali embrionali del topo completo) contenente 8 polibreni/ml).
3. Aggiungere 100 l della soluzione di particella lentivirale dal punto 10.3 tra cui lenti-CRISPR V2-gRNAi22, lenti-iRFP670-gRNAi23 e il controllo (vettore vuoto: lenti-CRISPR V2, lenti-iRFP670) agli iPSCs del mouse. Incubare le cellule per 3 giorni a 37 gradi centigradi con il 5% di CO₂.
4. Selezionare le cellule infettate in modo stabile con supporti contenenti 2,5 g/mL di blasticidin e 100 sg/mL di igromycin B determinando la concentrazione minima di blasticidin e igromycinB necessaria per uccidere la cellula non infetta.
   NOTA: Le cellule non infettate sarebbero stati uccisi da blasticidin e igromycina B.
5. Digerire gli iPSC del mouse selezionati con 0,5 mL di soluzione TVP ogni pozzo (piastra 24-pozzetti) e incubare le cellule per 30 min a 37 s con 5% DI CO₂.
6. Dissociare gli iPSC in singole celle con il pipettaggio, contare le celle con una camera di conteggio delle celle e quindi diluire circa 150 cellule singole digerite con mezzo mES in piatto 10 cm per la coltura a 37 s C con 5% CO₂.
7. Dopo circa 10 giorni, scegli le singole colonie sotto un microscopio invertito usando 10 punte sterili pipette (è necessario raccogliere 96 colonie).
8. Trasferire le colonie raccolte in 50 .
9. Incubare in un'incubatrice di CO₂ a 37 s al 70% di confluente.

12. Identificazione delle colonie iPSC con delezione di exon23

1. Rimuovere il mezzo in 96-bene piastra quando le colonie cellulari raggiungono 70% confluenza.
2. Aggiungete a ciascun pozzo 25 lun di reagente di lisi (Tabella dei materiali) contenente la soluzione proteinaK (1 mL di proteinasi K in 100 mL di reagente di lisi) e trasferite il lisa toaritmo a una piastra PCR da 96 pozze.
3. Sigillare la piastra PCR e incubare le piastre a 55 gradi centigradi per 30 min, e poi a 95 gradi centigradi per 45 min per lasile delle cellule e denaturare la proteinasi K.
4. Eseguire la reazione PCR con 2 lunati dal punto 12.3. Per la reazione di 20 -L PCR, aggiungere 2 L di lisato, 10 l di 2x prediglie di polimerasi di DNA (Tabella dei materiali), 7 L di acqua senza DNase e 1 L di dMD eson 23 primer(tabella 1).
5. Utilizzare i seguenti parametri per la reazione PCR: 98 gradi centigradi per 1 min, 35 cicli di 98 gradi centigradi per 10 s, 60 gradi centigradi per 15 s, 72 gradi centigradi per 30 s e un'estensione finale a 72 gradi centigradi per 1 min.
6. Caricare la reazione PCR su un gel di agarose del 2%. Eseguire il gel a 100-150 V per 30 min.
7. Ispezionare il gel sotto la luce UV (l'efficienza del knockout è 3/94).

13. Utilizzo del sistema di attivazione Tet-on MyoD per differenziare direttamente iPSC in cellule progenitrici miogeni (MPC)

1. Confeziona il mouse LV-TRE-VP64-mouse MyoD-T2A-dsRedExpress2 e LV-TRE-VP16 MyoD-T2A-dsRedExpress2 (un regalo di Charles Gersbach) (Tabella dei materiali) come descritto in precedenza per i vettori lenti-CRISPRv2-blast e lenti-gRNA-iRFP670 nelle sezioni 9 e 10.
2. Infettare il topo iPSC con lentivirus-TRE-VP64-MyoD-T2A-dsRed-Express2 o lentivirus-TRE-VP16-MyoD-T2A-dsRedExpress2 come descritto in precedenza per i vettori lentiRv2-blast e lenti-gRNA-iRFP670 nei passaggi 11.
3. Selezionare le cellule con 1 g/mL puromycin dopo tre giorni di infezione per ottenere una popolazione di cellule trasdotte pure.
4. Aggiungere 3 doxycycline di g/mL nei supporti di coltura (10% FBS DMEM) alla differenziazione MPC. Sostituire il mezzo fresco integrato con doxycycline ogni due giorni.

14. Trascrizione quantitativa inversa PCR per la valutazione della differenziazione muscolare dinamica e l'espressione DMD exon 22-24

1. Estrarre l'RNA cellulare dopo 0, 3, 6 e 10 giorni dopo il trattamento della doxycycline utilizzando il reagente di isolamento dell'RNA, trascrivere in modo inverso l'RNA in cDNA utilizzando il primo kit di sintesi cDNA filamento (Tabella dei materiali).
2. Per il sistema di reazione a 20 gradi lqPCR, aggiungere 1 ll di cDNA, 10 L di buffer di reazione PCR (Tabella dei materiali), 8 L di DNA H₂O e 1 -L di miscela di primer avanti e indietro (dehydrogenase di gliceralde-3-fosfato [GAPDH], muscolo scheletrico [ACTA1], OCT4 e DMD exon22, DMD exon23 e DMD exon24, vedere tabella 1).
3. Utilizzare i seguenti parametri per la reazione PCR: 50 gradi centigradi per 2 min, 95 s per 2 min, 40 cicli di 95 s per 15 s, 60 gradi centigradi per 1 min, fondere la curva da 65,0 c a 95,0 gradi centigradi, incrementare 0,5 gradi centigradi.

15. Colorazione immunofluorescenza della minosina della catena pesante 2 (MYH2) e dell'espressione proteica della distrofina

1. Cellule modificate da una piastra doxycycline, indotta da lenti-TRE-MyoD, dal passo 13.4 su scivolamo di coltura a 8 vetrini.
2. Fissare le cellule in 4% formaldeide per 15 min a temperatura ambiente, e poi lavare i vetrini due volte in PBS per 5 min ogni volta.
3. Bloccare le cellule con 5% diluente proteico del siero di capra per 1 h a temperatura ambiente.
4. Aggiungere l'anticorpo coniglio-anti-distrofina (1:300) e l'anticorpo topo-anti-MYH2 (1:100) ai vetrini, incubare a 4 gradi durante la notte in una camera umida.
5. Eliminare la soluzione anticorpale primaria, lavare le cellule 3x (5 min/wash) in PBS, aggiungere 1:400 anticorpi risposati Alexa488 capra-anti-coniglio e anticorpo di capra-anti-tono coniugato Alexa555 e incubare per 45 min a temperatura ambiente.
6. Lavare i vetrini 3x (5 min/wash) in PBS e montare le sezioni con supporto di montaggio contenente DAPI.

Risultati

Istituzione di fibroblasti cutanei^mdx Dmd derivati iPSC. Abbiamo dimostrato l'efficienza della generazione di iPSC del mouse da topi^mdx Dmd che derivano dal fibroblasto cutaneo utilizzando i vettori di riprogrammazione senza integrazione. La figura 1A ha dimostrato che la comparsa di colonie simili a cellule staminali embrionali (ESC) a tre settimane dall'infezione. Valutiamo l'efficienza dell'induzione iPSC con macchie di fosfofosate alcalina...

Discussione

La distrofia muscolare di Duchenne (DMD) è una malattia ereditaria distruttiva e in definitiva fatale caratterizzata da una mancanza di distrofina, che porta ad un'atrofia muscolare progressiva^1,2. I nostri risultati dimostrano l'espressione genica distrofina ripristinata nelle cellule progenitrici miogenie derivate da Dmd^mdx iPSC dall'approccio della delezione di eon23 mediata da CRISPR/Cas9. Questo approccio presenta tre vantaggi.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Strumenti chirurgici
Ago calibro 31	Vari
Incisione affilata	Vari
Bisturi Sterili	Vari
Pinzette	Varie
Terreno per fibroblasti (per 100 mL di terreno completo)	Numero di catalogo dell'azienda		Volume
2-Mercaptoetanolo (55 mM)	Gibco	21-985-023	0,1 mL
Antibiotico Antimicotico Sluizione 100x	CORNING	MT30004CI	1 mL
Dulbecco's Modified Eagle's Medio - alto glucosio	SIGMA	D6429	87 mL
Fetale Siero bovino caratterizzato	HyClone	SH30396.03	10 mL
Soluzione di L-Glutammina	SIGMA	G7513	1 mL
MEM Soluzione di aminoacidi non essenziali (100x)	Gibco	11140076	1 mL
di soluzione TVP (per 500 mL di soluzione completa)	Azienda	Numero di catalogo	Volume
Siero di pollo	Gibco	16110-082	5 mL
EDTA	Sigma-Aldrich	E6758	186 mg
Soluzione salina			a 500 mL
di tripsina (2,5%)	Thermo	15090046	5 mL
Terreno di crescita mES (per 500 mL di soluzione completa)	Numero di catalogo dell'azienda		Volume
2-Mercaptoetanolo (55 mM)	Gibco	21-985-023	0,5 mL
Antibiotico Antimicotico Sluizione 100x	CORNING	MT30004CI	5 mL
Dulbecco's Modified Eagle's Medium - high glucosio	SIGMA	D6429	408,5 mL
Siero fetale bovino	HyClone	caratterizzato SH30396.03	75 mL
Soluzione di L-Glutammina	SIGMA	G7513	5 mL
Fattore inibitorio della leucemia ricombinante di topo (LIF), 0,5 x 106 U/mL	EMD Millipore Corp	CS210511	500 μ L
Integratore di inibitori MEK/GS3 EMD	Millipore Corp	CS210510-500UL	500 μ L
MEM Soluzione di Aminoacidi Non Essenziali (100x)	Gibco	11140076	5 mL
Il terreno cellulare ES non deve essere conservato per più di 4 settimane e con inibitori non più di 2 settimane.
mES terreno congelato (per 50 mL di soluzione completa)	Azienda	Numero catalogo	Volume
Dimetilsolfossido (DMSO)	SIGMA	D2650	5 mL
Dulbecco's Modified Eagle's Medio - alto glucosio	SIGMA	D6429	24,9 mL
Siero fetale bovino caratterizzato	HyClone	SH30396,03	25 mL
Fattore inibitorio della leucemia ricombinante di topo (LIF), 0,5 x 106 U/mL	EMD Millipore Corp	CS210511	50 μ L
Nome del materiale/ Attrezzatura Numero di	catalogo	dell'azienda	RRID
0,05% Tripsina/0,53 mM EDTA	CORNING	25-052-CI
4% Paraformaldeide	Thermo scientific	J19943-k2
Soluzione di accutasi	SIGMA	A6964	Soluzione di distacco cellulare
AgeI-HF	NEB	R3552L
Alexa488-coniugato capra-anti-topo	anticorpo Invitrogen	A32723	AB_2633275
Alexa488-coniugato capra-anti-coniglio	anticorpo Invitrogen	A32731	AB_2633280
Alexa555-coniugato capra-anti-coniglio anticorpo	Invitrogen	A32732	AB_2633281
anti-AFP	Thermo scientific	RB-365-A1	AB_59574
anti-α-Smooth Actina muscolare (D4K9N) XP	CST	19245S	AB_2734735
anti-distrofina	Thermo	PA5-32388	AB_2549858
anti-LIN28A (D1A1A) XP	CST	8641S	AB_10997528
anti-MYH2	DSHB	mAb2F7	AB_1157865
anti-Nanog-XP	CST	8822S	AB_11217637
anti-Oct-4A (D6C8T)	CST	83932S	AB_2721046
anti-Sox2	abcam	ab97959	AB_2341193
anti-SSEA1 (MC480)	CST	4744s	AB_1264258
anti-TH (H-196)	SANTA CRUZ	sc-14007	AB_671397
Fosfatasi alcalina Colorazione viva (500x)	Thermo	A14353
Blasticidina S	Sigma-Aldrich	203350
BsmBI / Esp3I	NEB	R0580L / R0734L
Carbenicillina	Millipore	205805-250MG
Collagenasi IV	Worthington Biochemical Corporation	LS004189
Cellule competenti	TakaRa	636763
CutSmart	NEB	B7204S
CytoTune-iPS 2.0 Sendai Kit di riprogrammazione	Thermo	A16517
Reagente di lisi DirectPCR (cellula)	VIAGEN BIOTECH	302-C
Dispasi (1 U/mL)	STEMCELL Technologies	7923
Doxiciclina cloridrato	Fisher BioReagents	BP26535
EcoRI-HF	NEB	R3101L
Fibronectina plasmatica bovina	SIGMA	F1141
Kit di estrazione su gel QIAEX II (500)	QIAGEN	20051
Gelatina da pelle suina, tipo A	SIGMA	G1890
HardSet Antifade Terreno di montaggio con vettore DAPI		H-1500
Igromicina B (50 mg/mL)	Invitrogen	10687010
Ketamina HCL per iniezione	HENRY SCHEIN ANIMAL HEALTH	45822
KpnI-HF	NEB	R3142L
lenti-CRISPRv2-blast	Addgene	83480
lenti-Guide-Hygro-iRFP670	Addgene	99377
Lipofectamin 3000 Kit di trasfezione	Invitrogen	L3000015
LV-TRE-VP64-mouse MyoD-T2A-dsRedExpress2	Addgene	60625
LV-TRE-VP16 mouse MyoD-T2A-dsRedExpress2	Addgene	60626
mouse su mouse (M.O.M.) Kit di base	Vector	BMK-2202
NotI-HF	NEB	R3189L
Opti-MEM I Siero ridotto Media	ThermoFisher	31985070
Polietilenglicole 4.000	Alfa Aesar	AAA161510B
Polybrene	SIGMA	TR1003
Corning  Vetrino di coltura BioCoat Poli-D-Lisina/Laminina	CORNING	CB354688
PowerUp SYBR Green Master Mix	ThermoFisher	A25742
PrimeSTAR Max Premix	TakaRa	R045
Proteinasi K	VIAGEN BIOTECH	507-PKP
Puromicina Dicloridrato	MP Biomedicals	ICN19453980
qPCR Lentivirus Kit di titolazione	abm	LV900
Kit di legatura rapida	NEB	M2200S
QIAprep Spin Miniprep Kit (250)	QIAGEN	27106
QIAGEN Plasmid Plus Midi Kit (100)	QIAGEN	12945
RevertAid RT Kit di trascrizione inversa	Thermo scientific	K1691
RNAzol RT	Molecular Research Center, INC	RN 190
T4 Tampone di reazione DNA ligasi	NEB	B0202S
T4 Polinucleotide chinasi	NEB	M0201S
Terrific Brodo modificato	Fisher BioReagenti	BP9729-600
Reagente ViralBoost (500x)	ALSTEM	VB100