Qui, presentiamo un protocollo di eliminazione exon23 basato su Cas9 per ripristinare l'espressione distrofina in iPSC da fibroblasti cutanei derivati da mousemdx Dmd e differenziare direttamente gli iPSC in cellule progenitrici miogenie (MPC) utilizzando il sistema di attivazione Tet-on MyoD.
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Articolo metodologico
Tecnologia CRISPR/Cas9 nel ripristino dell'espressione della distrofina nei progenitori muscolari derivati da iPSC
In questo articolo
Sommario
Abstract
La distrofia muscolare di Duchenne (DMD) è una grave malattia muscolare progressiva causata da mutazioni nel gene della distrofina, che alla fine porta all'esaurimento delle cellule progenitrici muscolari. L'editing genico a breve area(CRISPR/Cas9) interspaziale regolarmente interspaziale ha il potenziale per ripristinare l'espressione del gene della distrofina. Le cellule progenitrici muscolari derivate da cellule staminali muscolari (MPC) autologhe indotte possono ricostituire il pool di cellule staminali/progenitrici, riparare i danni e prevenire ulteriori complicazioni nella DMD senza causare una risposta immunitaria. In questo studio, introduciamo una combinazione di CRISPR/Cas9 e tecnologie iPSC non integrate per ottenere progenitori muscolari con espressione proteica di distrofina recuperata. In breve, utilizziamo un vettore Sendai non integrato per stabilire una linea iPSC dai fibroblasti dermici dei topimdxi Dmd. Usiamo quindi la strategia di eliminazione CRISPR/Cas9 per ripristinare l'espressione della distrofina attraverso un'unione finale non omologa del gene della distrofina riformulato. Dopo la convalida PCR dell'esaurimento dell'eso23 in tre colonie da 94 colonie iPSC selezionate, differenziamo iPSC in MPC per espressione indotta da Dox (Dox) di MyoD, un fattore chiave di trascrizione che svolge un ruolo significativo nella regolazione della differenziazione muscolare. I nostri risultati mostrano la fattibilità dell'utilizzo della strategia di eliminazione CRISPR/Cas9 per ripristinare l'espressione della distrofina nell'MPC derivato da iPSC, che ha un potenziale significativo per lo sviluppo di future terapie per il trattamento della DMD.
Introduzione
La distrofia muscolare di Duchenne (DMD) è una delle distrofie muscolari più comuni ed è caratterizzata dall'assenza di distrofina, che colpisce 1 di circa 5.000 neonati in tutto il mondo1. La perdita della funzione genica della distrofina si traduce in difetti muscolari strutturali che portano alla degenerazione progressiva delle miofibre1,2. Il sistema di terapia genica mediata da un virus adeno ricombinante (rAAV) è stato testato per ripristinare l'espressione della distrofina e migliorare la funzione muscolare, come la sostituzione genica utilizzando micro-distrofine. Tuttavia, l'ap....
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Protocollo
Tutte le procedure di movimentazione e chirurgia degli animali sono state eseguite da un protocollo approvato dall'Augusta University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). I topi sono stati alimentati dieta standard e acqua al libitum.
1. Isolamento dei fibroblasti di topi primari da topimdx adulti Dmd
- Eutanasia adulto Dmd topimdxi (maschio, 2 mesi) da CO2 asfissia e toracotomia secondo IACUC approvato dal Medical College of Georgia, Università di Augusta. Tagliare la coda con un bisturi sterile in una condizione sterile sotto il cofano laminare. Sciacquare la coda con il 70% di etan....
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Risultati
Istituzione di fibroblasti cutaneimdx Dmd derivati iPSC. Abbiamo dimostrato l'efficienza della generazione di iPSC del mouse da topimdx Dmd che derivano dal fibroblasto cutaneo utilizzando i vettori di riprogrammazione senza integrazione. La figura 1A ha dimostrato che la comparsa di colonie simili a cellule staminali embrionali (ESC) a tre settimane dall'infezione. Valutiamo l'efficienza dell'induzione iPSC con macchie di fosfofosate alcalina.......
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Discussione
La distrofia muscolare di Duchenne (DMD) è una malattia ereditaria distruttiva e in definitiva fatale caratterizzata da una mancanza di distrofina, che porta ad un'atrofia muscolare progressiva1,2. I nostri risultati dimostrano l'espressione genica distrofina ripristinata nelle cellule progenitrici miogenie derivate da Dmdmdx iPSC dall'approccio della delezione di eon23 mediata da CRISPR/Cas9. Questo approccio presenta tre vantaggi.
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Tang e Weintraub sono stati parzialmente supportati da NIH-AR070029, NIH-HL086555, NIH-HL134354.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Strumenti chirurgici | |||
| Ago calibro 31 | Vari | ||
| Incisione affilata | Vari | ||
| Bisturi Sterili | Vari | ||
| Pinzette | Varie | ||
| Terreno per fibroblasti (per 100 mL di terreno completo) | Numero di catalogo dell'azienda | Volume | |
| 2-Mercaptoetanolo (55 mM) | Gibco | 21-985-023 | 0,1 mL |
| Antibiotico Antimicotico Sluizione 100x | CORNING | MT30004CI | 1 mL |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medio - alto glucosio | SIGMA | D6429 | 87 mL |
| Fetale Siero bovino caratterizzato | HyClone | SH30396.03 | 10 mL |
| Soluzione di L-Glutammina | SIGMA | G7513 | 1 mL |
| MEM Soluzione di aminoacidi non essenziali (100x) | Gibco | 11140076 | 1 mL |
| di soluzione TVP (per 500 mL di soluzione completa) | Azienda | Numero di catalogo | Volume |
| Siero di pollo | Gibco | 16110-082 | 5 mL |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E6758 | 186 mg |
| Soluzione salina | a 500 mL | ||
| di tripsina (2,5%) | Thermo | 15090046 | 5 mL |
| Terreno di crescita mES (per 500 mL di soluzione completa) | Numero di catalogo dell'azienda | Volume | |
| 2-Mercaptoetanolo (55 mM) | Gibco | 21-985-023 | 0,5 mL |
| Antibiotico Antimicotico Sluizione 100x | CORNING | MT30004CI | 5 mL |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium - high glucosio | SIGMA | D6429 | 408,5 mL |
| Siero fetale bovino | HyClone | caratterizzato SH30396.03 | 75 mL |
| Soluzione di L-Glutammina | SIGMA | G7513 | 5 mL |
| Fattore inibitorio della leucemia ricombinante di topo (LIF), 0,5 x 106 U/mL | EMD Millipore Corp | CS210511 | 500 μ L |
| Integratore di inibitori MEK/GS3 EMD | Millipore Corp | CS210510-500UL | 500 μ L |
| MEM Soluzione di Aminoacidi Non Essenziali (100x) | Gibco | 11140076 | 5 mL |
| Il terreno cellulare ES non deve essere conservato per più di 4 settimane e con inibitori non più di 2 settimane. | |||
| mES terreno congelato (per 50 mL di soluzione completa) | Azienda | Numero catalogo | Volume |
| Dimetilsolfossido (DMSO) | SIGMA | D2650 | 5 mL |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medio - alto glucosio | SIGMA | D6429 | 24,9 mL |
| Siero fetale bovino caratterizzato | HyClone | SH30396,03 | 25 mL |
| Fattore inibitorio della leucemia ricombinante di topo (LIF), 0,5 x 106 U/mL | EMD Millipore Corp | CS210511 | 50 μ L |
| Nome del materiale/ Attrezzatura Numero di | catalogo | dell'azienda | RRID |
| 0,05% Tripsina/0,53 mM EDTA | CORNING | 25-052-CI | |
| 4% Paraformaldeide | Thermo scientific | J19943-k2 | |
| Soluzione di accutasi | SIGMA | A6964 | Soluzione di distacco cellulare |
| AgeI-HF | NEB | R3552L | |
| Alexa488-coniugato capra-anti-topo | anticorpo Invitrogen | A32723 | AB_2633275 |
| Alexa488-coniugato capra-anti-coniglio | anticorpo Invitrogen | A32731 | AB_2633280 |
| Alexa555-coniugato capra-anti-coniglio anticorpo | Invitrogen | A32732 | AB_2633281 |
| anti-AFP | Thermo scientific | RB-365-A1 | AB_59574 |
| anti-α-Smooth Actina muscolare (D4K9N) XP | CST | 19245S | AB_2734735 |
| anti-distrofina | Thermo | PA5-32388 | AB_2549858 |
| anti-LIN28A (D1A1A) XP | CST | 8641S | AB_10997528 |
| anti-MYH2 | DSHB | mAb2F7 | AB_1157865 |
| anti-Nanog-XP | CST | 8822S | AB_11217637 |
| anti-Oct-4A (D6C8T) | CST | 83932S | AB_2721046 |
| anti-Sox2 | abcam | ab97959 | AB_2341193 |
| anti-SSEA1 (MC480) | CST | 4744s | AB_1264258 |
| anti-TH (H-196) | SANTA CRUZ | sc-14007 | AB_671397 |
| Fosfatasi alcalina Colorazione viva (500x) | Thermo | A14353 | |
| Blasticidina S | Sigma-Aldrich | 203350 | |
| BsmBI / Esp3I | NEB | R0580L / R0734L | |
| Carbenicillina | Millipore | 205805-250MG | |
| Collagenasi IV | Worthington Biochemical Corporation | LS004189 | |
| Cellule competenti | TakaRa | 636763 | |
| CutSmart | NEB | B7204S | |
| CytoTune-iPS 2.0 Sendai Kit di riprogrammazione | Thermo | A16517 | |
| Reagente di lisi DirectPCR (cellula) | VIAGEN BIOTECH | 302-C | |
| Dispasi (1 U/mL) | STEMCELL Technologies | 7923 | |
| Doxiciclina cloridrato | Fisher BioReagents | BP26535 | |
| EcoRI-HF | NEB | R3101L | |
| Fibronectina plasmatica bovina | SIGMA | F1141 | |
| Kit di estrazione su gel QIAEX II (500) | QIAGEN | 20051 | |
| Gelatina da pelle suina, tipo A | SIGMA | G1890 | |
| HardSet Antifade Terreno di montaggio con vettore DAPI | H-1500 | ||
| Igromicina B (50 mg/mL) | Invitrogen | 10687010 | |
| Ketamina HCL per iniezione | HENRY SCHEIN ANIMAL HEALTH | 45822 | |
| KpnI-HF | NEB | R3142L | |
| lenti-CRISPRv2-blast | Addgene | 83480 | |
| lenti-Guide-Hygro-iRFP670 | Addgene | 99377 | |
| Lipofectamin 3000 Kit di trasfezione | Invitrogen | L3000015 | |
| LV-TRE-VP64-mouse MyoD-T2A-dsRedExpress2 | Addgene | 60625 | |
| LV-TRE-VP16 mouse MyoD-T2A-dsRedExpress2 | Addgene | 60626 | |
| mouse su mouse (M.O.M.) Kit di base | Vector | BMK-2202 | |
| NotI-HF | NEB | R3189L | |
| Opti-MEM I Siero ridotto Media | ThermoFisher | 31985070 | |
| Polietilenglicole 4.000 | Alfa Aesar | AAA161510B | |
| Polybrene | SIGMA | TR1003 | |
| Corning Vetrino di coltura BioCoat Poli-D-Lisina/Laminina | CORNING | CB354688 | |
| PowerUp SYBR Green Master Mix | ThermoFisher | A25742 | |
| PrimeSTAR Max Premix | TakaRa | R045 | |
| Proteinasi K | VIAGEN BIOTECH | 507-PKP | |
| Puromicina Dicloridrato | MP Biomedicals | ICN19453980 | |
| qPCR Lentivirus Kit di titolazione | abm | LV900 | |
| Kit di legatura rapida | NEB | M2200S | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit (250) | QIAGEN | 27106 | |
| QIAGEN Plasmid Plus Midi Kit (100) | QIAGEN | 12945 | |
| RevertAid RT Kit di trascrizione inversa | Thermo scientific | K1691 | |
| RNAzol RT | Molecular Research Center, INC | RN 190 | |
| T4 Tampone di reazione DNA ligasi | NEB | B0202S | |
| T4 Polinucleotide chinasi | NEB | M0201S | |
| Terrific Brodo modificato | Fisher BioReagenti | BP9729-600 | |
| Reagente ViralBoost (500x) | ALSTEM | VB100 |
Riferimenti
- Mendell, J. R., et al. Evidence-based path to newborn screening for Duchenne muscular dystrophy. Annals of Neurology. 71 (3), 304-313 (2012).
- Batchelor, C. L., Winder, S. J. Sparks, signals and shock absorbers: how dystrophin loss cause....
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