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Articolo metodologico

Modellazione-Triggered Ossidative Burst e Seedling Growth Assays in Arabidopsis thaliana

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⸱

DOI:

10.3791/59437

⸱

21 maggio 2019

 ,  ,  , 
1Department of Biology, Queen's University

In questo articolo

Sommario

Questo documento descrive due metodi per quantificare le risposte della difesa nell'Arabidopsis thaliana in seguito all'esposizione agli elicitori immunitari: il scoppio ossidativo transitorio e l'inibizione della crescita delle piantine.

Abstract

Le piante hanno sviluppato un robusto sistema immunitario per percepire gli agenti patogeni e proteggere dalle malattie. Questo documento descrive due saggi che possono essere utilizzati per misurare la forza dell'attivazione immunitaria in Arabidopsis thaliana dopo il trattamento con molecole di elicitor. Presentato per primo è un metodo per catturare la raffica ossidativa rapida e dinamica, che può essere monitorata utilizzando un saggio basato sul luminol. Il secondo è presentato come misurare l'inibizione indotta immunoindotta della crescita delle piantine. Questi protocolli sono veloci e affidabili, non richiedono formazione o attrezzature specializzate e sono ampiamente utilizzati per comprendere la base genetica dell'immunità delle piante.

Introduzione

Per percepire e difendersi dagli agenti patogeni, le piante hanno sviluppato recettori di riconoscimento dei modelli legati alla membrana (PRR) che rilevano molecole microbiche conservate al di fuori della cellula note come modelli molecolari associati ai microbi (MAMP)1. Il legame dei MAMP ai loro MR cognati avvia la segnalazione immunitaria mediata dalla chinasi proteica, con conseguente resistenza alle malattie ad ampio spettro2. Una delle prime risposte dopo l'attivazione del PRR è la fosforolalazione e l'attivazione delle proteine respiratorie RESPIRATORI OXIDASE HOMOLOG (RBOH) che catalizzano la produzione di specie extracellulari reattive dell'ossigeno (ROS)3 , 4. Il ROS svolge un ruolo importante nello stabilire la resistenza alle malattie, agendo sia come messaggeri secondari per propagare la segnalazione immunitaria sia come agenti antimicrobici diretti5. La prima osservazione di un'esplosione ossidativa immuno-elitata è stata descritta usando tuberi di patate di cv. Rishiri dopo Phytophthora infestans inoculazione6. La produzione di ROS è stata valutata in diverse specie vegetali utilizzando dischi foglia7, colture di sospensioni cellulari8e protoplasts6. Descritto qui è un metodo semplice per andire la produzione ROS innescata da pattern nei dischi foglia dell'Arabidopsis thaliana (Arabidopsis).

In risposta alla percezione del MAMP, le proteine RBOH attivate catalizzano la produzione di radicali di superossido (O2-), radicali idrossili (OH) e ossigeno singlet (1O2) che vengono convertiti in perossido di idrogeno (H2O 2) nello spazio extracellulare9. H2O2 può essere quantificato dalla chemiluminescenza a base di luminolo in presenza dell'agente ossidante perossidase (HRP)10. HRP ossida H2O2 generando uno ione idrossido (OH)e gas di ossigeno (O2) che reagiscono con il luminol per produrre un intermedio instabile che rilascia un fotone di luce10. L'emissione di fotoni può essere quantificata come unità di luce relativa (RLU) utilizzando un lettore di microplacino o un imager in grado di rilevare la luminescenza, che sono diventati pezzi standard di attrezzature nella maggior parte dei laboratori molecolari. Misurando la luce prodotta in un intervallo di 40-60 minuti, un'esplosione ossidativa transitoria può essere rilevata già 2-5 minuti dopo il trattamento dell'elicitor, raggiungendo il picco di 10-20 minuti e tornando a livelli basali dopo 60 minuti11. La luce cumulativa prodotta in questo ciclo temporale può essere utilizzata come misura della forza immunitaria corrispondente all'attivazione delle proteine RBOH12. Convenientemente, questo saggio non richiede attrezzature specializzate o preparazione ingombrante del campione.

Raggiungendo il picco poco dopo il rilevamento MAMP, il scoppio ossidativo è considerato una risposta immunitaria precoce, insieme all'attivazione MAPK e alla produzione di etilene5. Le successive risposte immunitarie includono la riprogrammazione trascrizionale, la chiusura stomatale e la deposizione callosa2,5. L'esposizione prolungata ai MAMP attiva continuamente la segnalazione immunitaria energeticamente costosa con conseguente inibizione della crescita delle piante, indicativa di un compromesso tra sviluppo e immunità13. L'inibizione della crescita delle piantine innescata a pattern (SGI) è ampiamente utilizzata per valutare la produzione immunitaria in Arabidopsis ed è stata parte integrante dell'identificazione di diversi componenti chiave della segnalazione immunitaria, tra cui i PRR14,15 ,16. Pertanto, questo documento presenta inoltre un saggio per la SGI innescata a motivi geometrici in Arabidopsis, in base al quale le piantine vengono coltivate in piastre multi-bene contenenti supporti standard o multimediali integrati con un elicitor immunitario per 8-12 giorni e poi pesati utilizzando una scala analitica.

Per dimostrare come i test ROS e SGI possono essere utilizzati per monitorare la segnalazione mediata da PRR, sono stati scelti tre genotipi che rappresentano output immunitarie variabili: (1) il tipo selvaggio Arabidopsis accession Columbia (Col-0), (2) il bak1-5 dominante-negativo in cui il co-recettore multifunzionale PRR BRASSINOSTEROID INSENSITIVE 1-ASSOCIATED KINASE 1 (BAK1) non è funzionale nella segnalazione immunitaria17,18e (3) il mutante cpk28-1 recessivo, che manca proteine regolatorie CALCIUM-dipendente PROTEIN A LIVELLO DI KINASE 28 (CPK28) e visualizza risposte potenziate19,20. I saggi ROS e SGI sono presentati in risposta a un epitopo peptide elf18 prodotto sinteticamente del fattore di allungamento batterico Tu (EF-Tu), riconosciuto in Arabidopsis dal PRR EF-Tu RECETTOR (EFR)15. Questi protocolli possono essere utilizzati con altri elicitori immunitari come la flagellina14 della proteina di motilità batterica o le proteine endogene dell'elicitora vegetale (AtPeps)16, tuttavia, va notato che la reattività delle piante differisce a seconda elicitor21. Insieme, i saggi ROS e SGI possono essere utilizzati per la valutazione rapida e quantitativa delle risposte mediate da PRR precoce e tardiva.

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Protocollo

1. Rilevamento di esplosione ROS nei dischi foglia di Arabidopsis dopo l'elicitazione immunitaria

  1. Crescita e manutenzione dell'impianto.
    1. Per sincronizzare la germinazione, stratificare i semi di Arabidopsis sospendendo circa 50 semi in 1 mL di sterile 0,1% agar [w/v] e conservare a 4 gradi (senza luce) per 3-4 giorni.
      NOTA: Stratificare un controllo dello sfondo di tipo selvaggio (ad esempio, Col-0) e genotipi con uscite immunitarie alte e basse (ad esempio, cpk28-1 e bak1-5, rispettivamente) per fungere da controlli interni.
    2. Semina i semi sul suolo e germinano in condizioni standard di breve giorno (22 gradi centigradi, 10 h luce, 150 mE/m2/ intensità di luce e 65-70% di umidità relativa).
    3. Dopo circa 7 giorni, utilizzare pinze per trapiantare singole piantine in nuovi vasi, separati da almeno 4 cm per consentire lo sviluppo completo della rosetta. Trapianto 6-12 piantine per genotipo e ritorno a condizioni standard di breve giorno. Regolarmente acqua e fertilizzare piante (1 g/L di 20-20-20 fertilizzante ogni 2 settimane).
  2. Raccogliere i dischi foglia in piastre 96-bene per il recupero notturno.
    1. A 4-5 settimane dopo la germinazione (Figura 1A), utilizzare un forte pugno di biopsia di 4 mm per rimuovere un disco foglia per pianta, evitando la vena intermedia e facendo attenzione a limitare la feria (Figura 1B). Posizionare i dischi foglia in una piastra luminosa di 96 pozzetto inutilizzata contenente 100 -L di ddH2O con il lato adassiale rivolto verso l'alto per evitare la disidratazione22 (Figura 1C). Se si valutano più elicitori, rimuovere 1 foglio dalla stessa foglia per ogni trattamento con elicitor.
      NOTA: foglie di esempio completamente espanse, dal terzo al quinto dalla parte superiore della rosetta e approssimativamente alla stessa dimensione ed età per limitare la variabilità. Se possibile, tagliare a metà i dischi foglia utilizzando una lama di rasoio prima del recupero notturno, in quanto ciò aumenta la superficie esposta alla soluzione di elicitor23.
    2. Recuperare durante la notte a temperatura ambiente per evitare l'interferenza di ROS prodotto dalla ferita durante la raccolta del disco foglia. Coprire le piastre con un coperchio per evitare l'evaporazione.
  3. Eseguire il trattamento con l'elicitor e misurare la produzione di ROS.
    1. Programmare il lettore di piastre prima di aggiungere la soluzione di reazione, in quanto ciò ridurrà il tempo che interverrà tra l'inizio della raffica di ROS e le prime misurazioni registrate. Utilizzare un software commerciale appropriato per il lettore di lastre. Nel nostro caso (vedere Sommario),fare clic su Impostazionie selezionare la cartuccia LUM96 e il tipo di lettura cinetica. Fare clic sulla categoria Area di lettura e trascinare per selezionare un sottoinsieme di pozze o l'intera piastra da leggere. Nella scheda PMT e ottica, impostare il tempo di integrazione su 1.000 ms. Nella scheda Intervallo, impostare il tempo di esecuzione totale su 40-60 min e l'intervallo su 2 min.
    2. Rimuovere l'acqua da ogni pozzo utilizzando una pipetta multicanale.
      NOTA: Non forare i dischi foglia, in quanto ciò potrebbe causare stress da ferita e provocare uscite ROS più variabili.
    3. Preparare una soluzione di reazione contenente 100 m luminol, 10 g/mL HRP, e la concentrazione desiderata di elicitor (ad esempio: elf18 a 1 nM, 10 nM, 100 nM o 1.000 nM) in sterile ddH2O utilizzando 10 mL di soluzione per una piastra da 96.
      NOTA: Sciogliere i peptidi lofilofili in sterili H2O in tubi a bassa legatura per fare uno stock di 10 mM, congelare flash nel liquido N2e conservare a -80 gradi centigradi. Quando è pronto per l'uso, diluire le scorte in sterile H2O per generare una scorta di lavoro di 100 M e conservare a -20 gradi centigradi.
    4. Utilizzare una pipetta multicanale per erogare 100 l di l della miscela di reazione ad ogni pozzo, aggiungendo la soluzione a tutti i dischi foglia dello stesso trattamento allo stesso tempo22. Includere una reazione di controllo (nessun elicitor) per ogni genotipo per valutare i livelli di ROS basale in assenza di elicitazione. Misurare immediatamente l'emissione di luce per tutte le lunghezze d'onda nello spettro visibile utilizzando un lettore di microplacino.
      NOTA: Preparare e applicare la soluzione di reazione in condizioni di scarsa illuminazione, poiché il luminolo e l'HRP sono reagenti sensibili alla luce. Mantenere i reagenti sul ghiaccio o a -20 gradi centigradi, a meno che non siano in uso.
    5. Misurare l'emissione di luce con un tempo di integrazione di 1.000 ms in intervalli di 2 minuti su un periodo di 40-60 min in un lettore di microplacino al fine di catturare l'esplosione ossidativa dinamica (Figura 1D).
      NOTA: Utilizzare un tempo di integrazione più lungo per migliorare la sensibilità di analisi11, garantendo al contempo che tutti i campioni in una piastra di 96 pozzetto possano essere misurati in un intervallo.
  4. Interpretazione dei dati.
    1. Per ogni genotipo, utilizzare un'applicazione foglio di calcolo per calcolare il numero medio di fotoni e l'errore standard in ogni punto temporale e visualizzare la produzione ROS in funzione del tempo utilizzando un grafico a dispersione.
      figure-protocol-1
      Dove t - ogni punto temporale
    2. In alternativa, sommare i conteggi dei fotoni per ogni disco foglia e presentare la media di questi valori per ogni genotipo utilizzando un grafico a barre con barre di errore standard o un grafico a scatola e baffi.
      figure-protocol-2

2. Inibizione della crescita delle piantine

  1. Sterilizzare semi e semimare su piastre Murashige e Skoog (MS).
    1. Preparare la metà della forza sterile (0,5x) media MS (2,16 g/L) contenente 0,8% agar [w/v]. Versare i supporti in piastre (90 x 15 mm) in un cappuccio a flusso laminare.
    2. Sterilizzare circa 100 semi in un tubo di microcentrifuga lavando con 1 mL del 70% di etanolo per 2 min e rimuovere per aspirazione. Aggiungere 1 mL di 40% di candeggina e abbellire delicatamente per 17 min a temperatura ambiente. Rimuovere la candeggina per aspirazione e lavare tre volte in 1 mL di acqua sterile per 5 min. Resuspend in 1 mL di sterile 0.1% agar.
      NOTA: In alternativa, utilizzare un protocollo di sterilizzazione del gas di cloro24.
    3. Semina circa 100 semi per genotipo su piastre MS agar utilizzando una pipetta e una guarnizione con nastro microporo in un cappuccio a flusso laminare.
      NOTA: Evitare di posizionare i semi in prossimità in quanto ciò renderà difficile il trapianto di piantine in seguito.
    4. Stratificate i semi mettendo le piastre a 4 gradi centigradi (senza luce) per 3-4 giorni per sincronizzare la germinazione (Figura 2A).
  2. Piantine trapianti in piastre di 48 pozzi contenenti peptidi elicitor i immunitari.
    1. Dopo la stratificazione, spostare le piastre alla luce in condizioni di giorno breve (22 gradi centigradi, 10 h luce, 150 mE/m2/ s intensità di luce e 65-70% umidità relativa) per 3-4 giorni per consentire la germinazione.
    2. In un cappuccio a flusso laminare, preparare le diluizioni dei peptidi di elicitor (0 nM, 1 nM, 10 nM, 100 nM e 1.000 nM) in supporti liquidi sterili 0,5x MS contenenti 1% di saccarosio [w/v], utilizzando 25 mL di MS per ogni piastra di 48 pozze. Preparare le piastre con la pipa 500 l di MS medio o MS medio contenente peptidi per pozzo. Se disponibile, utilizzare un pipettor di ripetizione per la preparazione della piastra per accelerare il processo.
      NOTA: Per ogni genotipo, coltivare piantine in MS senza elicitor per tenere conto di eventuali differenze intrinseche nella crescita delle piantine.
    3. Utilizzando pinze sterili trapiantare con attenzione una piantina ad ogni pozzo della stessa dimensione ed età, assicurando che non vi sia alcun danno alla piantina o rottura alla radice e che la radice sia immersa nei media. Per ogni genotipo, trapiantare un minimo di 6-8 piantine in ogni diluizione peptide (Figura 2B).
      NOTA: Le piantine trapianti a 4 giorni dopo la germinazione, poiché le radici corte sono più facili da manipolare e le piantine più vecchie possono produrre risultati meno ottimali.
    4. Piastre di sigillazione con nastro microporo e ritorno alla luce in condizioni standard di breve giorno (22 gradi centigradi, 10 h di luce, 150 mE/m2/ s intensità di luce e 65-70% di umidità relativa). Lasciare che le piantine crescano per 8-12 giorni.
  3. Determinare l'inibizione percentuale della crescita.
    1. Rimuovere con cura le piantine da piastre 48-well e asciugare tamponando su carta assorbente. Pesare le piantine su una scala analitica e registrare i valori. Se disponibile, utilizzare una bilancia analitica dotata di output USB per registrare i valori di peso nuovi su un foglio di calcolo. Prima di pesare piantine, scattare una foto per visualizzare visivamente l'inibizione della crescita (Figura 2C).
    2. Determinare l'inibizione percentuale della crescita delle piantine trattate con elicitori rispetto alle piantine coltivate solo in MS (Figura 2D) come segue:
      figure-protocol-3
    3. Tracciare i dati utilizzando un grafico a barre con barre di errore standard o utilizzando un grafico a scatola e baffi per visualizzare meglio la varianza intersperimentale.

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Risultati

Mutant cpk28-119,25 e bak1-517,18 piante sono state utilizzate per dimostrare i risultati attesi per i genotipi con risposte immunitarie alte e basse, rispettivamente, in burst ossidativo e SGI saggi relativi a un controllo di sfondo di tipo selvaggio (Col-0). Per valutare gli effetti dipendenti dalla dose, è stata utilizzata una serie di diluizione pepti...

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Discussione

Questo documento descrive due metodi per andire le risposte immunitarie innescate in modello in Arabidopsis, offrendo approcci quantitativi alla valutazione della produzione immunitaria senza l'uso di apparecchiature specializzate. In combinazione, ROS e SGI attivati in modello possono essere utilizzati per valutare le risposte tempestive e tardive alla percezione dei microbi, rispettivamente.

La principale limitazione del saggio ossidativo burst è la variabilità. Per motivi che non s...

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Ringraziamenti

Il lavoro nel nostro laboratorio è finanziato attraverso il Natural Resources and Engineering Research Council of Canada (NSERC) Discovery Program, la Canadian Foundation for Innovation John R. Evans Leader's Fund e la Queen's University. KS e IS sono supportati da borse di studio tandem Ontario Graduate e borse di studio NSERC Canada Graduate per studenti di master (CGS-M).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
20-20-20 FertilizzantePlant Prod10529Mescolare 1 g/L in acqua e applicare sulle piante ogni 2 settimane per una crescita ottimale.
Punzone per biopsia da 4 mmMedical Mart232-33-34-PÈ possibile utilizzare anche un set di trivella per sughero con una superficie di 0,125 cm^2.
Piastre sterili a 48 pozzetti con coperchioSigma-AldrichCLS3548
con bozza SheidVWRVWR-225ACQualsiasi bilancia analitica standard può essere utilizzata per i saggi di inibizione della crescita, tuttavia, un output diretto del computer è ottimale.
Pipetta multicanale BioHit mLine Mechanical 12 (30-300 uL)Sartorius725240È possibile utilizzare qualsiasi pipetta multicanale, così come un pipettatore singolo, se necessario.
elf18 (Ac-SKEKFERTKPHVNVGTIG)EZ Biolabcp7211Conservare 10 mM di peptide stock a -80C in provette a basso legame proteico. Una volta scongelato, conservare 100 uM di materiale lavorante a -20°C.
PinzeFisher Scientific22-327379
Perossidasi di rafanoSigma-AldrichP6782Sciogliere in acqua pura. Conservare a -20°C e al riparo dalla luce.
LuminolSigma-AldrichA8511si dissolve in DMSO. Conservare a -20°C e al riparo dalla luce.
Murisage e Skoog Basal SaltsCedarlane LabsMSP09-100LTNegozio a 4C.
SoilSunGrow HorticultureSunshine Mix #1Altri tipi di terreno possono essere utilizzati anche per coltivare l'Arabidopsis. Mescolare con acqua quando si riempiono le pentole.
Lettore di micropiastre multimodale SpectraMax Paradigm con modulo LUMI dispositivi molecolaridevono richiedere un preventivoPer questi saggi è possibile utilizzare qualsiasi lettore di piastre in grado di rilevare la luminescenza.
SaccarosioSigma-AldrichS0389-1KGConservare a temperatura ambiente.
Piastre in polistirene bianco a 96 pozzettiFisher Scientific07-200-589
Bilancia analitica

Riferimenti

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