Questo documento descrive due metodi per quantificare le risposte della difesa nell'Arabidopsis thaliana in seguito all'esposizione agli elicitori immunitari: il scoppio ossidativo transitorio e l'inibizione della crescita delle piantine.
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Articolo metodologico
Modellazione-Triggered Ossidative Burst e Seedling Growth Assays in Arabidopsis thaliana
In questo articolo
Sommario
Abstract
Le piante hanno sviluppato un robusto sistema immunitario per percepire gli agenti patogeni e proteggere dalle malattie. Questo documento descrive due saggi che possono essere utilizzati per misurare la forza dell'attivazione immunitaria in Arabidopsis thaliana dopo il trattamento con molecole di elicitor. Presentato per primo è un metodo per catturare la raffica ossidativa rapida e dinamica, che può essere monitorata utilizzando un saggio basato sul luminol. Il secondo è presentato come misurare l'inibizione indotta immunoindotta della crescita delle piantine. Questi protocolli sono veloci e affidabili, non richiedono formazione o attrezzature specializzate e sono ampiamente utilizzati per comprendere la base genetica dell'immunità delle piante.
Introduzione
Per percepire e difendersi dagli agenti patogeni, le piante hanno sviluppato recettori di riconoscimento dei modelli legati alla membrana (PRR) che rilevano molecole microbiche conservate al di fuori della cellula note come modelli molecolari associati ai microbi (MAMP)1. Il legame dei MAMP ai loro MR cognati avvia la segnalazione immunitaria mediata dalla chinasi proteica, con conseguente resistenza alle malattie ad ampio spettro2. Una delle prime risposte dopo l'attivazione del PRR è la fosforolalazione e l'attivazione delle proteine respiratorie RESPIRATORI OXIDASE HOMOLOG (RBOH) che catalizzano la produzione di speci....
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Protocollo
1. Rilevamento di esplosione ROS nei dischi foglia di Arabidopsis dopo l'elicitazione immunitaria
- Crescita e manutenzione dell'impianto.
- Per sincronizzare la germinazione, stratificare i semi di Arabidopsis sospendendo circa 50 semi in 1 mL di sterile 0,1% agar [w/v] e conservare a 4 gradi (senza luce) per 3-4 giorni.
NOTA: Stratificare un controllo dello sfondo di tipo selvaggio (ad esempio, Col-0) e genotipi con uscite immunitarie alte e basse (ad esempio, cpk28-1 e bak1-5, rispettivamente) per fungere da controlli interni. - Semina i semi sul suolo e germinano in condizioni standard di breve giorno (....
- Per sincronizzare la germinazione, stratificare i semi di Arabidopsis sospendendo circa 50 semi in 1 mL di sterile 0,1% agar [w/v] e conservare a 4 gradi (senza luce) per 3-4 giorni.
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Risultati
Mutant cpk28-119,25 e bak1-517,18 piante sono state utilizzate per dimostrare i risultati attesi per i genotipi con risposte immunitarie alte e basse, rispettivamente, in burst ossidativo e SGI saggi relativi a un controllo di sfondo di tipo selvaggio (Col-0). Per valutare gli effetti dipendenti dalla dose, è stata utilizzata una serie di diluizione pepti.......
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Discussione
Questo documento descrive due metodi per andire le risposte immunitarie innescate in modello in Arabidopsis, offrendo approcci quantitativi alla valutazione della produzione immunitaria senza l'uso di apparecchiature specializzate. In combinazione, ROS e SGI attivati in modello possono essere utilizzati per valutare le risposte tempestive e tardive alla percezione dei microbi, rispettivamente.
La principale limitazione del saggio ossidativo burst è la variabilità. Per motivi che non s.......
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Ringraziamenti
Il lavoro nel nostro laboratorio è finanziato attraverso il Natural Resources and Engineering Research Council of Canada (NSERC) Discovery Program, la Canadian Foundation for Innovation John R. Evans Leader's Fund e la Queen's University. KS e IS sono supportati da borse di studio tandem Ontario Graduate e borse di studio NSERC Canada Graduate per studenti di master (CGS-M).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 20-20-20 Fertilizzante | Plant Prod | 10529 | Mescolare 1 g/L in acqua e applicare sulle piante ogni 2 settimane per una crescita ottimale. |
| Punzone per biopsia da 4 mm | Medical Mart | 232-33-34-P | È possibile utilizzare anche un set di trivella per sughero con una superficie di 0,125 cm^2. |
| Piastre sterili a 48 pozzetti con coperchio | Sigma-Aldrich | CLS3548 | |
| con bozza Sheid | VWR | VWR-225AC | Qualsiasi bilancia analitica standard può essere utilizzata per i saggi di inibizione della crescita, tuttavia, un output diretto del computer è ottimale. |
| Pipetta multicanale BioHit mLine Mechanical 12 (30-300 uL) | Sartorius | 725240 | È possibile utilizzare qualsiasi pipetta multicanale, così come un pipettatore singolo, se necessario. |
| elf18 (Ac-SKEKFERTKPHVNVGTIG) | EZ Biolab | cp7211 | Conservare 10 mM di peptide stock a -80C in provette a basso legame proteico. Una volta scongelato, conservare 100 uM di materiale lavorante a -20°C. |
| Pinze | Fisher Scientific | 22-327379 | |
| Perossidasi di rafano | Sigma-Aldrich | P6782 | Sciogliere in acqua pura. Conservare a -20°C e al riparo dalla luce. |
| Luminol | Sigma-Aldrich | A8511 | si dissolve in DMSO. Conservare a -20°C e al riparo dalla luce. |
| Murisage e Skoog Basal Salts | Cedarlane Labs | MSP09-100LT | Negozio a 4C. |
| Soil | SunGrow Horticulture | Sunshine Mix #1 | Altri tipi di terreno possono essere utilizzati anche per coltivare l'Arabidopsis. Mescolare con acqua quando si riempiono le pentole. |
| Lettore di micropiastre multimodale SpectraMax Paradigm con modulo LUM | I dispositivi molecolari | devono richiedere un preventivo | Per questi saggi è possibile utilizzare qualsiasi lettore di piastre in grado di rilevare la luminescenza. |
| Saccarosio | Sigma-Aldrich | S0389-1KG | Conservare a temperatura ambiente. |
| Piastre in polistirene bianco a 96 pozzetti | Fisher Scientific | 07-200-589 |
Riferimenti
- Couto, D. E., Zipfel, C. Regulation of pattern recognition receptor signalling in plants. Nature Reviews Immunology. 16, 537-552 (2016).
- Boller, T., Felix, G. A Renaissance of Elicitors: Per....
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Ristampe e permessi
