Dimostriamo la sintesi di nanoparticelle di silicio poroso fusogena per la consegna effettiva del oligonucleotide in vitro e in vivo. Silicio poroso nanoparticelle vengono caricate con siRNA per formare il nucleo, che è rivestito dai lipidi fusogena attraverso estrusione per formare il guscio. I servizi e le dotazioni comprendono targeting frazione funzionalizzazione e caratterizzazione delle particelle.
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Articolo metodologico
Sintesi, funzionalizzazione e caratterizzazione di nanoparticelle di silicio poroso fusogena per la consegna del Oligonucleotide
In questo articolo
Sommario
Abstract
Con l'avvento della terapia genica, lo sviluppo di un sistema di consegna efficaci in vivo del nucleotide-payload è diventata di importazione parallela. Fusogena silicio poroso nanoparticelle (F-pSiNPs) hanno recentemente dimostrato alto genico in vivo di efficacia a causa sua oligonucleotide ad alto capacità di carico e via di assorbimento cellulare unico che evita endocitosi. La sintesi di F-pSiNPs è un processo a più fasi che include: (1) di carico e la sigillatura di payload del oligonucleotide nei pori di silicio; (2) rivestimento simultanea e dimensionamento dei lipidi fusogena intorno i nuclei di silicio poroso; e (3) coniugazione di peptidi di targeting e lavaggio per rimuovere l'eccesso del oligonucleotide, detriti di silicio e il peptide. Uniformità di dimensione della particella è caratterizzata da diffusione dinamica della luce, e la sua struttura core-shell può essere verificata da microscopia elettronica di trasmissione. L'assorbimento di fusogena viene convalidato caricando un lipofilico tingere, 1, 1'-Diottadecilbis-3,3, 3', 3'-tetramethylindocarbocyanine perclorato (DiI), in bilayer del lipido fusogena e trattandolo alle cellule in vitro per osservare per membrana plasmatica colorazione contro localizzazioni endocitosi. I efficacies di silenziamento gene targeting e in vivo in precedenza sono stati quantificati in un modello murino di polmonite Staphylococcus aureus , in cui è previsto il peptide targeting per aiutare il F-pSiNPs a casa per il sito di infezione. Oltre la sua applicazione nell'infezione di S. aureus , il sistema di F-pSiNP può essere usato per fornire qualsiasi oligonucleotide per la terapia genica di una vasta gamma di malattie, compreso le infezioni virali, cancro e malattie autoimmuni.
Introduzione
Terapia genica modula l'espressione genica specifici per ottenere un risultato terapeutico. Numerosi strumenti per la modulazione del gene sono stati scoperti e studiati, compreso acido ribonucleico interferenza (RNAi) utilizzando oligonucleotidi (ad es., breve interfering RNA (siRNA)1,2, microRNA (miRNA)3,4 ), DNA plasmidi5,6, nucleasi (ad es., dito di zinco, TALENS)7,8e CRISPR/Cas9 sistemi9,
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Protocollo
1. sintesi di nanoparticelle di silicio poroso (pSINPs)
Attenzione: Usare sempre cautela quando si lavora con acido fluoridrico (HF). Seguire tutte le guide di sicurezza secondo la sua scheda di dati di sicurezza (SDS), maneggiare sostanze chimiche contenenti HF in una cappa aspirante e indossare adeguati dispositivi di protezione personale (PPE; doppie guanti con guanti di butyl all'esterno, grembiule di butile con camice sotto, viso scudo con occhiali di sicurezza sotto). Tutte le università e i laboratori R & D richiedono una formazione specifica sulla sicurezza HF prima dell'uso. Non tentare di lavorare con HF senza pre-approvazione del C....
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Risultati
Una riuscita sintesi di fusogena pSiNPs dovrebbe produrre una soluzione omogenea, leggermente opaca (Figura 3a). Il mancato rispetto di ottimizzare il rapporto e la concentrazione di pSiNPs: siRNA: CaCl2 può condurre all'aggregazione al caricamento (Figura 3b). Come le particelle vengono estruse attraverso membrane di 200 nm, il diametro medio di idrodinamico della pSiNPs fusogena misurata da liste di distribuzione dev.......
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Discussione
Sintesi di nanoparticelle di silicio poroso sono illustrato nella Figura 5. Il passaggio fondamentale nella sintesi di fusogena pSiNPs è in fase di caricamento (passaggio 3). Se le nanoparticelle fusogena aggregano post-sintesi (Figura 3), il motivo potrebbe essere a causa di quanto segue: (1) stock di cloruro di calcio non era preparato omogeneamente, così passo 3.1.2 dovrà essere attentamente seguito o raffinato; o (2) il rapporto di pSiNP: siRNA: CaCl2
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Dichiarazioni
MJS è un fondatore scientifico di Spinnaker Biosciences, Inc. e ha una partecipazione azionaria nella società. Anche se questa concessione è stata identificata per la gestione del conflitto di interessi basata sulla portata complessiva del progetto e suo potenziale beneficio per Spinnaker Biosciences, Inc., i risultati di ricerca inclusi nella presente pubblicazione particolare potrebbero non necessariamente riguardano gli interessi di Spinnaker Biosciences, Inc. I termini di questo accordo sono stati esaminati e approvati dal Università di California, San Diego secondo le proprie politiche di conflitto di interessi. Altri autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è sostenuto dal National Institutes of Health attraverso contratto n # R01 AI132413-01.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DMPC) | Avanti Polar Lipids | 850345P | Polvere |
| 1,2-dioleoil-3-trimetilammonio-propano (sale di cloruro) (DOTAP) | Avanti Polar Lipids | 890890P | Polvere |
| 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolammina-N-[maleimmide(polietilenglicole)-2000] (sale di ammonio) (DSPE-PEG(2000) Maleimide) | Avanti Polar Lipids | 880126P | Polvere |
| Foglio di alluminio | VWR International, LLC | 12175-001 | |
| Cloruro di calcio (CaCl2) | Spettro | C1977 | Anidro, Pellet |
| Cloroformio | Fisher Scientific | C6061 | |
| Computer | Dell | Dimension 9200 | Qualsiasi computer con slot per schede PCI è accettabile |
| Dil Stain (1,1'-Diottadecil-3,3,3',3'-Tetrametilindocarbocianina perclorato ('DiI'; DiIC18(3))) | Life Technologies | D3911 | |
| Etanolo (EtOH) | UCSD Store | 111 | 200 Proof |
| Acido idroflurico (HF) | VWR International, LLC | MK264008 | Purezza: 48% |
| Keithley 2651a Sourcemeter | Keithley | 2651A | |
| LabVIEW | National Instruments | Programma di esempio disponibile all'indirizzo: http://sailorgroup.ucsd.edu/sofware/ | |
| LysoTracker Green DND-26 | Thermo Fisher Scientific | L7526 | |
| Set di estrusione di liposomi con blocco riscaldante | Avanti Polar Lipids | 610000 | |
| Microcon-30kDa Centrifugal Unità filtro | EMD Millipore | MRCF0R030 | |
| O-ring | ChemGlass | CG-305-220 | |
| Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010-049 | |
| Bobina di platino | VWR International, LLC | AA10285-BU | |
| Idrossido di potassio (KOH) | Fisher Scientific | P250-3 | |
| Wafer | di silicioSiltronix | Ordine | |
| siRNA | Dharmacon | Ordine personalizzato | IRF5, senso 5'-dTdT-CUG CAG AGA AUA ACC CUG A-dTdT-3' e antisenso 5'-dTdT UCA GGG UUA UUC UCU GCA G dTdT-3' |
| Sonicatore | VWR International, LLC | 97043-960 | |
| Peptide di puntamento (CRV) | CPC Scientific Sequenza | d'ordine personalizzata | CRVLRSGSC; reso ciclico da un legame disolfuro tra le catene laterali dei due residui di cisteina Cella di |
| incisione in teflon | Interface Performance Materials, Inc. | Ordine | |
| Acqua distillata UltraPure DNase/RNase-Free | Thermo Fisher Scientific | 10977015 |
Riferimenti
- Ryther, R. C. C., Flynt, A. S., Phillips Iii, J. A., Patton, J. G. siRNA therapeutics: big potential from small RNAs. Gene Therapy. 12, 5(2004).
- Scherman, D., Rousseau, A., Bigey, P., Escriou, V. Genetic pharmacology: progresses in siRNA delivery and therapeutic applications. ....
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Ristampe e permessi
