Method Article

Valutazione di molteplicità sinaptica utilizzando cellule intere Patch-clamp Elettrofisiologia

DOI:

10.3791/59461

⸱

April 23rd, 2019

 , 
1Neuroscience Program, Schulich School of Medicine and Dentistry, University of Western Ontario, 2Robarts Research Institute, Schulich School of Medicine and Dentistry, University of Western Ontario, 3Department of Physiology and Pharmacology, Schulich School of Medicine and Dentistry, University of Western Ontario

In This Article

Summary

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Qui, presentiamo un protocollo per la valutazione funzionale molteplicità sinaptica utilizzando cellule intere patch ed elettrofisiologia di morsetto in fettine di cervello acuto.

Abstract

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Nel sistema nervoso centrale, un paio di neuroni formano spesso più contatti sinaptici e/o siti di rilascio di neurotrasmettitore funzionale (molteplicità sinaptica). Molteplicità di sinaptica è di plastica e cambiamenti nel corso dello sviluppo e in differenti condizioni fisiologiche, essendo un fattore determinante per l'efficacia della trasmissione sinaptica. Qui, descriviamo gli esperimenti per stimare il grado di molteplicità di sinapsi che chiude su un dato neurone postsinaptico usando cellule intere patch ed elettrofisiologia di morsetto in fettine di cervello acuto. In particolare, registrazione di tensione-morsetto viene utilizzato per confrontare la differenza tra l'ampiezza delle correnti postsinaptiche eccitatori spontanee (sEPSC) e in miniatura eccitatori postsinaptici correnti (mIPSCs). La teoria dietro questo metodo è che input afferente che esibiscono molteplicità mostrerà sEPSC grande, potenziale d'azione-dipendente a causa del rilascio sincrono che si verifica a ogni contatto sinaptico. Al contrario, rilascio potenziale di azione indipendente (che è asincrona) genererà più piccola ampiezza mIPSCs. Questo articolo definisce una serie di esperimenti e analisi per caratterizzare l'esistenza di molteplicità sinaptica e vengono illustrati i requisiti e le limitazioni della tecnica. Questa tecnica può essere applicata per studiare come i diversi interventi comportamentali, farmacologici o ambientali in vivo influenzano l'organizzazione dei contatti sinaptici in aree differenti del cervello.

Introduction

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Trasmissione sinaptica è un meccanismo fondamentale per la comunicazione tra neuroni e quindi, funzione cerebrale. Trasmissione sinaptica anche è labile e può cambiare la sua efficacia in maniera dipendente di attività anche come in risposta a segnali modulatoria1. Così, esaminando funzione sinaptica è stato dei principali obiettivi di ricerca in neuroscienza. Elettrofisiologia di cellule intere patch clamp è una tecnica versatile che permette di comprendere, di elaborare disegni sperimentali e analisi dei dati, approfondite meccanismi biofisici e molecolari della trasmissione sinaptica. Un approccio comunemente utilizzato, forse a causa della ....

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Protocol

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Tutti gli esperimenti sugli animali sono approvati dal comitato di cura di animale della University of Western Ontario in conformità con il canadese Consiglio sugli orientamenti di cura degli animali (AUP n. 2014-031).

1. soluzioni

  1. Soluzione per affettare
    1. Fare riferimento alla tabella 1 per la composizione della soluzione per affettare.
    2. Preparare una soluzione stock 20x in anticipo e conservare a 4 ° C per 1 mese.
    3. Per soluzione 1x per affettare, sciogliere NaHCO3, glucosio e saccarosio in ddH2O e aggiungere il brodo di 20x. Garantire che l'osm....

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Results

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Il protocollo di cui sopra descrive un metodo per l'utilizzo di elettrofisiologia morsetto della intero-cellula patch per esaminare il grado di molteplicità sinaptica, usando neuroni ipotalamici del mouse come un esempio. Questa tecnica di preparazione di fetta dovrebbe produrre sane cellule vitali che non hanno una membrana gonfie o nucleo (Figura 1). Ogni passaggio nel protocollo è importante per la salute del tessuto e la qualità delle registrazioni.

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Discussion

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Un importante requisito per un esperimento di successo patch clamp Elettrofisiologia è ottenere fette/cellule sane. Il nostro protocollo descritto è ottimizzato per fette ipotalamici che contengono neuroni PVN. Altre aree potrebbero richiedere di cervello per volta soluzioni e affettare metodi21,22,23,24. Per la registrazione, è fondamentale per accettare solo registrazioni stabile monitorando .......

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Disclosures

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Gli autori non hanno nulla a rivelare

Acknowledgements

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J.S. ricevuto Ontario Graduate Scholarship. W.I. ha ricevuto un nuovo investigatore Fellowship dal Canada di ricerca sulla salute mentale. Questo lavoro è supportato da sovvenzioni di funzionamento a w. i da scienze naturali e ingegneria Research Council of Canada (06106-2015 RGPIN) e il Canadian Institute for Health Research (PJT 148707).

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Siringa da 1 mLBD309659
10 lameFisher Scientific/altri35698
22 lameVWR/altri21909-626
22 μ Filtri per siringhe MMilipore09-719-000
Adson forecepsHarvard Instruments72-8547
Forbici affilate angolateHarvard Instruments72-8437
ClampexMolecular DevicespClamp 10
Lama a doppio taglioVWR74-0002
Carta da filtroSigma/altri1001090
Pennello fineFisher / vari15-183-35 / vari
Tubo di dispersione di gasVWRLG-8680-120
IsofluranoFresenius Kabi / altriM60303
Krazy collavari
vari Mini analisiSynaptosoftMiniAnalysis 6
OsmomoterWescor IncModello 5600
ParafilmSigmaPM-996
Pipetta PasteurVWR14672-200
ph meterMettler ToledoFE20-ATC
Bulbo in gommaVWR82024-550
Manico per bisturi n. 3Harvard Instruments72-8350
Manico per bisturi n. 4Harvard Instruments72-8356
Lama a filo singoloVWR55411-050
Affettatrice a vibratomoSistema
MilliporeMilli-Q Academic A10
Coperchio della piastra a pozzettiFisher/vari07-201-590/various
Chemicals/reagents
4-APSigma275875
BAPTAsonde molecolariB1204
CaCl2*2H2OSigmaC7902
CdCl2sigma202908
DNQXTocris189
EGTASigmaE3889
glucosioSigmaG5767
HEPESSigmaH3375
K2-ATPSigmaA8937
KClSigmaP9333
K-gluconatoSigmaG4500
MgCl2*6H2OSigmaM2670
Grado di biologia molecolare acquaSigmaW4502-1L
Na3GTPSigmaG8877
NaClBioshopSOD001.1
Na-gluconatoSigmaS2054
NaH2PO4Sigma71504
NaHCO3SigmaS6014
PicrotossinaSigmaP1675
SrClSigma255521
saccarosioBioshopSUC507.1
TTXAlamone LabsT-550
yDGGTocris6729-55-1
di purificazione dell'acqua Leica VT1200S

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Abbott, L. F., Nelson, S. B. Synaptic plasticity: taming the beast. Nature Neuroscience. 3 (Supp), 1178-1183 (2000).
  2. Hsia, A. Y., Malenka, R. C., Nicoll, R. A. Development of Excitatory Circuitry in the Hippocampus. Journal of Neurophysiology. 79 (4), 2013-2024 (1998).

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Synaptic MultiplicityWhole cell Patch clampSpontaneous EPSCsMiniature EPSCsAction Potential dependent ReleaseTTX Cadmium BlockadeStrontium ACSF ApplicationGamma DGG Antagonist TestAfferent Stimulation ProtocolAccess Resistance Monitoring

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