Una strategia convergente per la generazione di una libreria cDNA virtualmente in sequenza da ostriche del Pacifico senza riferimenti

Yong  M. Lyu; Yu  Q. Li; Hui  B. Song; Juan Guo; Ting Wang; Li Liu; Gabriel Yedid; Josef Voglmeir

doi:10.3791/59462

Method Article

Una strategia convergente per la generazione di una libreria cDNA virtualmente in sequenza da ostriche del Pacifico senza riferimenti

DOI:

10.3791/59462

⸱

June 13th, 2019

Yong M. Lyu¹ , Yu Q. Li¹ , Hui B. Song¹ , Juan Guo¹ , Ting Wang¹ , Li Liu¹ , Gabriel Yedid² , Josef Voglmeir¹

¹Glycomics and Glycan Bioengineering Research Center (GGBRC), College of Food Science and Technology, Nanjing Agricultural University, ²College of Life Science, Nanjing Agricultural University

Summary

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Descriviamo una strategia su come usare campioni di RNA da campioni di ostriche del Pacifico senza riferimenti e valutiamo il materiale genetico confrontandosi con i dati del genoma pubblicamente disponibili per generare una libreria cDNA virtualmente sequenziata.

Abstract

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L'accesso al materiale biologico delle specie di riferimento, che sono stati utilizzati in precedenza in esperimenti chiave come lo sviluppo di nuove linee cellulari o progetti di sequenziamento del genoma, sono spesso difficili da fornire per ulteriori studi o terzi a causa della natura consumiva dei campioni. Anche se ora ampiamente distribuiti sulle coste del Pacifico in Asia, Australia e Nord America, i singoli esemplari di ostriche del Pacifico sono geneticamente molto diversi e quindi non sono direttamente adatti come materiale di partenza per le librerie genetiche. In questo articolo, dimostriamo l'uso di campioni di ostriche del Pacifico senza riferimenti ottenuti dai mercati ittici regionali per generare librerie di cDNA. Queste librerie sono state poi confrontate con il genoma delle ostriche pubblicamente disponibili, e la libreria correlata più vicina è stata selezionata utilizzando i geni di riferimento mitocondriali Cytochrome C Oxidase I (COX1) e NADH Dehydrogenase (ND). L'idoneità della libreria cDNA generata è dimostrata anche dalla clonazione e dall'espressione di due geni che codificano gli enzimi UDP-glucuronic acid dehydrogenase (UGD) e UDP-xylose synthase (UXS), che sono responsabili della biosintesi di UDP-xylose da UDP-glucosio.

Introduction

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L'acquisizione di materiale biologico di riferimento per la vita può essere difficile a causa dei lunghi tempi di consegna, del ragionamento imprenditoriale o delle norme doganali specifiche per paese. In alternativa, il materiale biologico richiesto può essere raccolto anche da campioni fenotipicamente identici. Tuttavia, questi campioni possono variare in modo significativo a livello del genotipo, e quindi i confronti con genomi di riferimento memorizzati digitalmente della stessa specie sono spesso resi difficili o addirittura inutili a causa dell'incompatibilità del materiale appena ricavato con metodi di amplificazione del DNA esistenti. Il sequenziamento dei gen....

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Protocol

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NOTA: nella Figura 1è illustrata una panoramica schematica.

1. Raccolta di campioni

Ottenere campioni di ostriche. Conservare le ostriche sul ghiaccio durante il periodo post-raccolta, il trasporto e prima dell'uso in laboratorio e il processo entro 4-7 giorni dall'acquisto.
NOTA: Per questo protocollo, le ostriche sono state acquistate dal mercato all'ingrosso di Nanchino (originario di Ningde, Fujian, Cina e Lianyungang, Jiangsu, Cina), Haijie Aquatic Product Company di Qingdao (originario di Qingdao, Shandong, Cina), Jucheng Aquatic Product Company a Yantai (originario di Yantai, Shandong, Cina)....

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Results

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La figura 1 mostra una panoramica schematica del metodo di preparazione descritto della libreria cDNA convergente derivata da individui di ostriche del Pacifico. La figura 2 mostra le sequenze dei geni COX1 e ND di un campione di ostriche distante correlato con elevata divergenza dalle sequenze geniche COX1 e ND del materiale di riferimento. La figura 3 mostra le sequenze dei geni COX1 e ND di un campione di ostrica strettamente cor.......

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Discussion

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Il protocollo presentato consente l'identificazione genetica di campioni di ostriche senza riferimenti con fenotipo simile provenienti dai mercati ittici regionali confrontando i geni COX1 e ND con un database del genoma del DNA delle ostriche disponibile al pubblico. Il significato di questo metodo sta nella sua semplicità, in quanto è necessaria una sola reazione PCR per la valutazione della libreria cDNA virtuale. I due geni coX1 e ND mitocondriali conservati sono stati amplificati da una libreria cDNA che è stata gen.......

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Disclosures

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgements

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Questo lavoro è stato sostenuto in parte dalla Natural Science Foundation of China (numeri di sovvenzione 31471703, A0201300537 e 31671854 a J.V. e L.L., numero di sovvenzione 31470435 a G.Y.), e il 100 Foreign Talents Plan (numero di sovvenzione JSB2014012 a J.V.).

....

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Materials

List of materials used in this article
Name	Company	Catalog Number	Comments
Prodotti chimici:
1% Triton X-100	Solarbio	9002-93-1	*Distributori alternativi possibili
Acido 2,5-diidrossibenzoico	Alfa Aesar	490-79-9	*Distributori alternativi possibili
Acetonitrile	Merck	75-05-8	*Distributori alternativi possibili
Agarosio per biologia molecolare	Biowest Chemicals	111860	*Distributori alternativi possibili
Ampicilin	Solarbio	69-52-3	*Distributori alternativi possibili
Cloroformio	Lingfeng, Shanghai	67-66-3	*Distributori alternativi possibili
DEPC acqua	Thermo Scientific	R0601
Etanolo	Jinhuada, Guangzhou	64-17-5	*Distributori alternativi possibili
Reagente guanidinio tiocianato-fenolo	Invitrogen	15596018	Reagente TRIzol
Imidazole	Energy Chemical	288-32-4	*Distributori alternativi possibili
Alcool isopropilico	Reagente chimico Nanjing	67-63-0	*Distributori alternativi possibili
Isopropyl β- D-tiogalattopiranoside	Solarbio	367-93-1	*Distributori alternativi possibili
Kanamicina	Solarbio	25389-94-0	*Distributori alternativi possibili
LB Agar	Thermo Fisher	22700025	*Distributori alternativi possibili
LB Brodo	Thermo Fisher	10855021	*Distributori alternativi possibili
Metanolo	Jinhuada, Guangzhou	67-56-1	*Distributori alternativi possibili
MgCl₂ esaidrato	Xilong Huagong	7791-18-6	*Distributori alternativi possibili
NaCl	Xilong Huagong	7647-14-5	*Distributori alternativi possibili
NAD⁺	Debitamente Biotech	53-84-9	*Distributori alternativi possibili
Fenil-metilsulfonilfluoruro	Macklin	329-98-6	*Distributori alternativi possibili
Tris	Solarbio	77-86-1	*Distributori alternativi possibili
UDP-glucosio	Wuhu Nuowei Chemicals	28053-08-9	*Distributori alternativi possibili
acido UDP-glucuronico	SIGMA	63700-19-6	*Distributori alternativi possibili
Strumenti/Strumenti:
MALDI-TOF spettrometro di massa	Bruker	Autoflex	*Distributori alternativi possibili
Riscaldatore a blocchi metallici	Long Yang Scientific Instruments	Thermoshaker HB20	*Distributori alternativi possibili
Termociclatore PCR	Hema	9600	*Distributori alternativi possibili
Enzima e kit:
10&volte; Tampone di legatura	Thermo Scientific	B69	*Distributori alternativi possibili
5&volte; PrimeSTAR tampone	Takara	9158A
Fosfatasi alcalina	ThermoFisher FastAP	EF0654	*Distributori alternativi possibili
COX primer diretto	Genscript	ATGTCAACAAATCATTTAGACATTG
COX reverse primer	Genscript	ACTTGACCAAAAAAACATACATG
Cutsmart Buffer	NEB	B7204S	*Alternativo distributori possibili
dNTP mix	Invitrogen	18427088
MgUGD primer diretto	Genscript	ACATATGACCCTGTCCAAGATCTGTTGT
MgUGD primer inverso		Genscript ACTCGAGACTCTGTGAGGCGGTGGAG
MgUXS primer diretto	Genscript	CCATATGGCAGAATCCTCACAATCAC
MgUXS primer inverso	Genscript	ACTCGAGCACATTTTTGAATTTGCAGACGT
ND primer diretto	Genscript	ATGAGATGGCAATTATTTTTTAAT
ND primer inverso	Genscript	ATGTATTTTGGAAAAATCTCCAC
PCR Cleanup Kit	AxyGen	AP-PCR-250	*Distributori alternativi possibili
pET-30a(+) vettore	Merck Millipore	69909

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Blaxter, M. L. The promise of a DNA taxonomy. Philosophical transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological. 359 (1444), 669-679 (2004).
Wen, J., et al. Species identification of drie....

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