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Articolo metodologico

VirWaTest, un metodo point-of-use per il rilevamento di virus nei campioni d'acqua

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DOI:

10.3791/59463

⸱

11 maggio 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Viruses Contaminants of Water and Food (VIRCONT), Department of Genetics, Microbiology and Statistics, Section of Microbiology, Virology and Biotechnology, University of Barcelona, 2Grupo de Investigación Biodiversidad, Medio Ambiente y Salud (BIOMAS), Facultad de Ingenierías y Ciencias Agropecuarias (FICA), Ingeniería en Biotecnología, Universidad de las Américas, 3Municipal Laboratory - Waters of Mataró, 4GenIUL

In questo articolo

Sommario

Qui presentiamo VirWaTest, che è un metodo semplice, conveniente e portatile per la concentrazione e il rilevamento di virus da campioni d'acqua nel punto di utilizzo.

Abstract

I virus escreti da esseri umani e animali possono contaminare le fonti d'acqua e rappresentare un rischio per la salute umana quando quest'acqua viene utilizzata per bere, irrigazione alimentare, lavaggio, ecc. L'indicatore classico dei batteri fecali non sempre controlla la presenza di patogeni virali, quindi il rilevamento di patogeni virali e indicatori virali è rilevante per adottare misure di mitigazione del rischio, soprattutto in scenari umanitari e in aree dove i focolai virali trasmessi dall'acqua sono frequenti.

Attualmente, diversi test commerciali che consentono la quantificazione dei batteri dell'indicatore fecale (FIB) sono disponibili per i test presso il punto di utilizzo. Tuttavia, tali test commerciali non sono disponibili per il rilevamento di virus. La rilevazione di virus nei campioni di acqua ambientale richiede la concentrazione di diversi litri in volumi più piccoli. Inoltre, una volta concentrata, la rilevazione di virus si basa su metodi quali l'estrazione dell'acido nucleico e il rilevamento molecolare (ad esempio, la reazione a catena della polimerasi [PCR]) dei genomi virali.

Il metodo qui descritto consente la concentrazione di virus da campioni d'acqua da 10 L, nonché l'estrazione di acidi nucleici virali nel punto di utilizzo, con apparecchiature semplici e portatili. Ciò consente la sperimentazione di campioni d'acqua nel punto di utilizzo di diversi virus ed è utile in scenari umanitari, nonché in qualsiasi contesto in cui non è disponibile un laboratorio attrezzato. In alternativa, il metodo consente di concentrare i virus presenti nei campioni d'acqua e la spedizione del concentrato in un laboratorio a temperatura ambiente per ulteriori analisi.

Introduzione

Durante le prime fasi di qualsiasi emergenza umanitaria, l'accesso alle forniture di acqua pulita, i servizi igienico-sanitari e l'igiene sono fondamentali per la sopravvivenza delle persone colpite. Pertanto, il monitoraggio della qualità dell'acqua è una priorità per prevenire i focolai di origine idrica. È risaputo che l'acqua contaminata è spesso l'origine di malattie, ma è spesso difficile determinare le fonti di focolai virali come il virus dell'epatite E (HEV), anche con la disponibilità di metodi di laboratorio convenzionali. Il controllo della qualità dell'acqua si basa sulla quantificazione di FIB1,2,3,4. Tuttavia, è stato ampiamente documentato che non vi è alcuna correlazione tra l'assenza di FIB e la presenza di patogeni virali trasmessi dall'acqua come rotavirus (RoV), norovirus (NoV), o HEV5,6. Pertanto, l'utilizzo dei criteri di qualità dell'acqua basati sulla FIB potrebbe comportare una sottovalutazione dei rischi associati alla presenza di patogeni virali trasportati dall'acqua. La sorveglianza dei virus indicatori, come gli adenovirus umani (HAdV), o di specifici patogeni sarebbe utile per definire l'esposizione a patogeni virali e identificare la potenziale fonte di infezione umana7,8, 9,10 e nella convalida dell'efficacia delle misure igienico-sanitarie11.

Fino ad ora, il rilevamento di virus in questi scenari si basava su personale qualificato e logistica complessa. VirWaTest (virwatest.org) è finalizzato allo sviluppo di un metodo semplice, conveniente e portatile per la concentrazione e la successiva rilevazione di virus da campioni d'acqua nel punto di utilizzo.

La concentrazione di virus si basa sul principio di flocculazione organica di campioni di acqua 10 L, con cui i virus vengono recuperati in piccoli volumi12,13. I floc vengono raccolti e aggiunti a un buffer che liccia i virus e impedisce la degradazione degli acidi nucleici quando sono conservati a temperatura ambiente per non più di 2 settimane.

Il metodo di estrazione dell'acido nucleico si basa sull'uso di particelle magnetiche a cui gli acidi nucleici vengono adsorbiti. Possono essere trasferiti da un buffer di lavaggio all'altro e infine nel buffer di eluizione utilizzando una pipetta magnetica a cui le particelle si attaccano. Le sospensioni virali dell'acido nucleico ottenute possono essere spedite in un laboratorio di riferimento in cui il rilevamento può essere eseguito utilizzando metodi molecolari basati sulla PCR. Per ogni estrazione dell'acido nucleico, vengono testate due diverse quantità per escludere l'inibizione ezimatica originata dal campione. In alternativa, con una disponibilità minima delle apparecchiature, i test PCR possono essere eseguiti nel punto di utilizzo. L'intero processo è progettato per essere eseguito indipendentemente da un alimentatore (Figura 1).

Un saggio pcR quantitativo per rilevare l'HAdV, espulso dall'uomo e trovato in campioni di acque reflue in alte concentrazioni, è stato adattato per essere eseguito nel punto di utilizzo. HAdV sono utilizzati come indicatori virali fecali umani. Una PCR per la quantificazione del batteriofago MS2 è stata adattata anche poiché MS2 viene utilizzato in VirWaTest come controllo del processo. Il metodo può essere personalizzato per il rilevamento di qualsiasi virus di interesse.

Dopo lo sviluppo, il metodo VirWaTest è stato applicato dagli utenti in due diverse impostazioni nella Repubblica di Africa Centrale (RCA) e in Ecuador, fornendo feedback sull'applicazione del protocollo in situazioni reali.

Per quanto ne sappiamo, questa è la prima procedura che consente la concentrazione e il rilevamento di virus nel punto di utilizzo, indipendentemente da qualsiasi alimentazione, grandi apparecchiature e condizioni di congelamento/raffreddamento. Si raccomanda di raccogliere due repliche di ogni campione d'acqua al fine di ottenere risultati robusti.

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Protocollo

1. Preparazione e confezionamento

NOTA: i materiali/attrezzature da imballare sono elencati nella tabella 1. Utilizzare i guanti per gestire i reagenti necessari per il controllo del processo, i reagenti di concentrazione, i reagenti di estrazione dell'acido nucleico e i reagenti di rilevamento. Indossare occhiali protettivi per maneggiare i reagenti necessari per l'estrazione dell'acido nucleico.

  1. Controllo del processo
    1. Preparare la cultura dello stock MS2 (American Type Culture Collection [ATCC] 15597-B1) contenente 1 x 1010 PFU/mL in laboratorio seguendo la procedura ISO 10705-1:199514.
    2. Quindi, 10 l'aliquota della sospensione per tubo contenente 1 x 108 PFU in tubi da 10 mL e lasciare che l'acqua evapora a 37 gradi centigradi. Utilizzare un tubo per ogni campione d'acqua.
    3. Inoltre, preparare un tubo contenente 10 mL di acqua distillata sterile per ogni campione raccolto.
  2. Reagenti di concentrazione
    1. Per la soluzione di latte scremato prefloccato (PSM), utilizzare i seguenti importi per concentrare cinque campioni di acqua da 10 L.
      1. Preparare un tubo di plastica contenente 5 g di latte scremato.
      2. Preparare un sacchetto di plastica con cerniera contenente 16,66 g di sali marini.
      3. Preparare una bottiglia di plastica contenente 500 mL di acqua distillata.
    2. Preparare i reagenti necessari per la regolazione del pH. Utilizzare i seguenti importi per regolare il pH del PSM e di cinque campioni di acqua da 10 L.
      1. Aggiungere 5 g di acido citrico 1-idrato in un tubo di plastica da 10 ml.
        APRudenza: L'acido citrico causa gravi irritazioni quando entra in contatto con gli occhi. In questo caso, sciacquare l'occhio con cautela con acqua per alcuni minuti. Se l'irritazione persiste, consultare un medico.
      2. Mettere 2 g di idrossido di sodio in un tubo di plastica da 10 ml.
        AVVISO: l'idrossido di sodio può causare gravi ustioni cutanee e danni agli occhi. Se ingerito, sciacquare la bocca. Non indurre il vomito. Se viene a contatto con gli occhi, risciacquare con cautela con acqua per diversi minuti. Quindi, consultare un medico.
      3. Mettere 25 mL di acqua distillata sterile in un contenitore di plastica.
      4. Mettere 50 mL di acqua distillata sterile in un contenitore di plastica.
    3. Preparare la sacca di condizionamento del campione utilizzata per la flocculazione, la soluzione di conservazione utilizzata per conservare gli acidi nucleici e la sacca neutralizzante per neutralizzare l'acqua e i materiali scartati. Utilizzare le seguenti quantità per ogni campione d'acqua da 10 L da testare.
      1. Mettere 15 g di sali di mare e 8 g di acido citrico 1-idratare in un sacchetto di plastica cerniera per la borsa di condizionamento.
      2. Aggiungere 2 mL di tampone di lisi (Tabella dei materiali) e 0,3 mL di acido nucleico conservando l'agente ( Tabella deimateriali) a un tubo da 5 mL.
        AVVISO: il buffer di lisi contiene il fiideo di guanidina e il Triton X-100. Il contatto con l'acido libera gas tossici, ed è dannoso se ingerito, inalato, o entra in contatto con la pelle. Se ingerito, sciacquare la bocca. Non indurre il vomito. Se viene a contatto con la pelle, lavare con molta acqua. Quindi, consultare un medico. L'agente conservante dell'acido nucleico causa irritazione della pelle e degli occhi ed è dannoso se ingerito. Se viene a contatto con la pelle o gli occhi, risciacquare con abbondante acqua per diversi minuti. In ogni caso, soprattutto se ingerito e sentirsi male, consultare un medico.
      3. Mettere 40 g di polvere detergente in quattro sacchetti di plastica con cerniera.
        AMMONIenza: Il detersivo in polvere causa irritazione agli occhi. Se viene a contatto con gli occhi, risciacquare con abbondante acqua per diversi minuti. Se l'irritazione persiste o se ingerita, consultare un medico.
  3. Reagenti di estrazione dell'acido nucleico
    1. Mettete 50 -L di particelle magnetiche (Tabella dei Materiali) e 1 mL di etanolo 96% in un tubo da 5 mL che costituiscono il buffer di legame.
      AVVISO: Il buffer di particelle magnetiche contiene azide di sodio, che forma un gas tossico quando entra in contatto con acidi o ioni metallici pesanti ed è tossico se ingerito o quando viene a contatto con la pelle. Se ingerito o a contatto con la pelle, sciacquare la bocca o la pelle con abbondante acqua e consultare un medico. L'etanolo è un liquido e vapore altamente infiammabile e provoca gravi irritazioni agli occhi. Tenere lontano da calore, superfici calde, scintille, e qualsiasi altra fonte di accensione. Se viene a contatto con la pelle o gli occhi, risciacquare con abbondante acqua. In caso di ingestione di grandi quantità di acqua e/o se inalato, uscire all'aria aperta. In ogni caso, consultare un medico.
    2. Aggiungete rispettivamente 500 l, 600 l e 200 l di detersivi 1, 2 e 3 (Tabella dei materiali), a tre tubi da 2 mL.
      AVVISO: i tamponi di lavaggio contengono il tiocianato di guanidinium e il cloruro di guanidio, che sono dannosi se inalati o ingeriti e irritano la pelle e gli occhi. Il contatto con gli acidi rilascia gas molto tossico. Se entrano in contatto con la pelle o gli occhi, risciacquare con abbondante acqua. Se ingerito, sciacquare la bocca con abbondante acqua. Non indurre il vomito. Consultare sempre un medico.
    3. Aggiungere 120 l di tampone di eluizione (Tabella dei materiali) a un tubo da 0,5 mL.
  4. Reagenti di rilevamento HAdV e MS2
    NOTA: Due diverse reazioni di estrazione dell'acido nucleico possono essere analizzate simultaneamente in ogni test PCR se viene utilizzato un termociclo a 8 bengeti. Per tutti i saggi PCR, preparare l'acqua di biologia molecolare aliquota in tubi da 1,5 mL.
    1. Rilevamento HAdV
      1. Preparare una miscela contenente 10 -L di 22,5 M di primer in avanti AdF, 10 -L di 22,5 M AdRinversi e 5 -L di 11,25 M sonda AdP (tabella 2).
      2. Aggiungere 2,5 l'l del mix ai tubi da 1 a 8 di una striscia di tubi. Lasciare asciugare a temperatura ambiente, chiudere i tubi e tenerli protetti dalla luce.
      3. Tagliare la striscia dividendola in due strisce: tubi 1-5 e tubi 6-8.
      4. Preparare una diluizione seriale delle sospensioni del DNA contenente la sequenza nucleotida della regione HAdV amplificata. L'aria secco 1 L- di sospensioni contenenti 1 x 105, 1 x 107e 1 x 109 GC/mL in tubi 6-8.
        NOTA: Tenere i tubi contenenti i primer, la sonda e le sospensioni essiccate all'aria protette dalla luce.
    2. Rilevamento MS2
      1. Preparare una miscela contenente 10 -L di 25 s.l. per il pezzetto-2F, 10-L di 25 pecson-2R inversi e 2,5 litri di 25 M PecP-2 (tabella 2).
      2. Aggiungere 2,25 l del mix ai tubi da 1 a 8 di una striscia di tubi. Lasciare asciugare a temperatura ambiente, chiudere i tubi e tenerli protetti dalla luce.
      3. Tagliare la striscia dividendola in due strisce: tubi 1-5 e tubi 6-8.
      4. Procedere come nel passaggio 1.4.1.4, ma utilizzare una sospensione standard progettata per MS2.

2. Concentrazione virale

NOTA: utilizzare i guanti in qualsiasi momento durante le procedure di raccolta dei campioni, preparazione del reagente, flocculazione, raccolta di floc e smaltimento dei rifiuti. Indossare occhiali protettivi durante la procedura di preparazione del reagente.

  1. Raccolta di campioni
    1. Raccogliere un campione d'acqua da 10 L in un secchio piatto con coperchio. Raccogliere un minimo di due repliche per ogni campione.
      NOTA: È importante utilizzare secchi chiari per visualizzare il pellet. Se il campione d'acqua contiene materiale sospeso (ad esempio, sabbia, alghe), lasciarlo sedimentare e, quindi, raccogliere il supernatante d'acqua in un nuovo secchio.
    2. Registrare il volume raccolto, nonché la posizione e la data di ritiro, per ogni campione d'acqua.
    3. Mettere un agitatore magnetico collegato a una batteria sotto un supporto secchio e posizionare il secchio contenente il campione d'acqua sul suo supporto.
      NOTA: Cercare una superficie piana in un luogo fresco e mantenere i secchi contenenti i campioni d'acqua dalla luce solare diretta.
  2. Preparazione dei reagenti
    1. Reagenti di regolazione pH
      1. Versare la polvere acida citrica e i pellet di idrossido di sodio nelle pentole contenenti rispettivamente 25 e 50 mL di acqua distillata.
      2. Agitare delicatamente a mano fino a quando l'acido citrico e l'idrossido di sodio sono completamente disciolti.
        AVVISO: Non versare l'acqua sui pellet di idrossido di sodio. Versare invece i pellet di idrossido di sodio sull'acqua.
    2. Latte scremato prefloccolto
      1. Mettere un sacchetto in piedi su un agitatore magnetico e versarci 500 mL di acqua distillata. Far cadere un magnete di agitazione all'interno del sacchetto e accendere l'agitatore magnetico.
      2. Versare il contenuto di una folatà di sale marino e di un tubo di latte scremato nel sacchetto di stand-up e mescolare per 5 min a media velocità per scioglierli.
      3. Aggiungere 3 mL di acido citrico alla soluzione PSM utilizzando una pipetta Pasteur per assicurarsi che il pH sia compreso tra 3,4 e 3,6. Misurare il pH della soluzione PSM utilizzando strisce di indicatore pH. Aggiungere piccole quantità di acido citrico e idrossido di sodio man mano che il pH si avvicina a 3,5.
      4. Spegnere l'agitatore magnetico e assicurarsi che i floc siano visibili. Utilizzare una torcia elettrica per aiutare a visualizzare i floc.
  3. Flocculazione
    1. Far cadere un magnete di agitazione in acqua, impostare l'agitatore magnetico alla massima velocità e accenderlo. Assicurarsi che il magnete agitando inizi a girare.
    2. Aggiungere 10 mL di acqua distillata a un tubo di controllo di processo. Invertire il tubo un paio di volte per reidratare il brodo virale e versare la soluzione in acqua.
    3. Versare il contenuto di una sacca di condizionamento campione in acqua e mescolare per 5 min.
    4. Misurare il pH del campione d'acqua utilizzando strisce indicatore pH. Aggiungere alcune gocce di acido citrico o idrossido di sodio al campione d'acqua per assicurarsi che il pH si trovi tra 3,4 e 3,6. Aggiungere piccole quantità di acido citrico e idrossido di sodio man mano che il pH si avvicina a 3,5.
    5. Aggiungere 100 mL della soluzione PSM utilizzando un contenitore da 100 mL.
    6. Sigillare il secchio con il coperchio, impostare l'agitatore magnetico alla velocità minima e lasciare che l'acqua si agiti per 8 h.
    7. Spegnere l'agitatore magnetico e lasciare che l'acqua sia ferma per almeno 5 h per consentire ai floc di depositarsi.
  4. Collezione Floc
    1. Costruire un sistema di sifone composto da un controller pipetta, due pipette e un tubo di plastica, per aspirare il sovrettinte ad acqua per scaricare l'acqua sui floc.
      1. Attaccare una pipetta a nastro da 10 mL al controller della pipetta. Quindi, attaccare la punta della pipetta al tubo di plastica.
      2. Rimuovere il filtro di una pipetta a punta aperta da 10 mL utilizzando una pinzetta e attaccare la pipetta al tubo di plastica.
    2. Posizionare un secchio vuoto sul pavimento.
    3. Immergere la punta della pipetta a punta aperta nell'acqua. Assicurarsi di tenerlo vicino alla superficie dell'acqua per evitare di disturbare i floc. Aspirare il supernatante d'acqua fino a raggiungere la pipetta a nastro.
    4. Avvicinare il tubo di plastica all'estremità attaccata alla pipetta adesiva e staccarlo dalla pipetta.
    5. Collocare il tubo in un secchio vuoto. Rilasciare la pressione sul tubo per far scorrere l'acqua nel secchio vuoto.
    6. Pizzicare il tubo di plastica per fermare il flusso d'acqua quando il livello dell'acqua sta per raggiungere il magnete di agitazione e spostare la pipetta lontano dal secchio.
    7. Agitare il secchio per risospendere i floc e versarli in un sacchetto di plastica stand-up da 500 mL. Lasciare che i floc si accontentino di 1 h di più.
    8. Aspirare con attenzione il supernatante ad acqua usando una pipetta da 50 mL e un controller manuale pipetta, evitando di disturbare i floc.
    9. Aspirare i floc usando una pipetta da 100 mL e trasferirli in un tubo di centrifuga turalario da 50 mL. Annotare il volume finale del concentrato del campione e trasferirne 1 mL in un tubo da 5 mL contenente la soluzione conservante, utilizzando una pipetta Pasteur.
      NOTA: È importante che il tubo di centrifuga sia graduato in modo che il volume finale del campione concentrato possa essere misurato nel modo più accurato possibile e registrato.
    10. Eseguire l'estrazione dell'acido nucleico sul campo. In alternativa, conservare la soluzione conservante contenente i virus a 20-30 gradi centigradi per un massimo di 15 giorni o spedirli in un laboratorio di riferimento per ulteriori analisi.
  5. Smaltimento dei rifiuti e riutilizzo dei materiali
    1. Aggiungere il contenuto di una sacca agente neutralizzante al secchio contenente l'acqua scartata. Mescolare l'acqua, e poi, lasciare fermo per 30 min.
    2. Smaltire l'acqua trattata come rifiuti generali.
    3. Posizionare le pipette e il tubo di plastica all'interno del secchio. Riempire il secchio con acqua e versare il contenuto di una sacca agente neutralizzante.
    4. Lavarli per almeno 30 minuti per sterilizzarli e sciacquarli con abbondante acqua pulita per rimuovere qualsiasi agente neutralizzante rimanente.

3. Estrazione di acido nucleico

NOTA: Utilizzare guanti e indossare sempre occhiali protettivi durante la procedura di estrazione dell'acido nucleico.

  1. Funzionamento della pipetta magnetica
    1. Acquisire familiarità con il funzionamento della pipetta magnetica prima di eseguire l'estrazione.
  2. Estrazione di acido nucleico
    1. Disporre i tubi contenenti i reagenti necessari per l'estrazione in un rack, da sinistra a destra: tampone di rilegatura, buffer di lavaggio e buffer di elusione. Impostare il numero appropriato di tubi in base al numero di campioni o repliche in corso di analisi.
    2. Trasferire 1 mL di concentrato di campione al tubo contenente il tampone di rilegatura, utilizzando una pipetta Pasteur usa e getta. Invertire il tubo da 8x a 10x per omogeneizzare la soluzione.
    3. Incubare la soluzione a temperatura ambiente per 10 min mescolando continuamente, utilizzando un orbitale a energia solare o manualmente.
    4. Raccogliere le particelle magnetiche utilizzando la pipetta magnetica e una punta pulita, che può essere riutilizzata per i tre buffer di lavaggio.
    5. Rilasciare le particelle magnetiche nel tubo contenente 500 L di lavaggio buffer 1. Lavarli agitando delicatamente la soluzione con la punta per 30 s e raccoglierli.
    6. Trasferire le particelle magnetiche al tubo contenente 600 - L di lavaggio buffer 2. Lavarli agitando delicatamente la soluzione con la punta per 30 s e raccoglierli.
    7. Trasferire le particelle magnetiche al tubo contenente 200 . Lavarli agitando delicatamente la soluzione con la punta per 30 s e raccoglierli.
    8. Rilasciare le particelle magnetiche nel tubo contenente il tampone di eluizione e scartare la punta.
    9. Incubare la soluzione a temperatura ambiente per 5 min mescolando continuamente, utilizzando l'orbitale a energia solare.
      NOTA: La miscelazione delle particelle magnetiche nel tampone di eluizione è un passo cruciale. In caso di mancanza di un orbitale, mescolare continuamente a mano durante il tempo di incubazione.
    10. Sostituire la punta sulla pipetta magnetica con una nuova e raccogliere le particelle magnetiche dal buffer di eluizione. Assicurarsi di rimuovere completamente le particelle magnetiche dal buffer di eluizione poiché possono interferire con i metodi di rilevamento molecolare.
    11. Scartare la punta con le particelle ad essa attaccate. Procedere con l'analisi PCR, spedire il tampone di eluizione in un laboratorio di riferimento o conservare il tampone di eluizione a 4 gradi centigradi per un'ulteriore analisi.

4. Rilevamento virale con termociclo in tempo reale a otto tubi a batteria

NOTA: Utilizzare guanti e indossare sempre occhiali protettivi durante la procedura di rilevamento dell'acido nucleico. Sostituire i guanti per quelli nuovi quando si esegue un nuovo esperimento PCR per evitare la contaminazione incrociata.

  1. HAdV quantitativo PCR
    1. Aggiungete 14 l di acqua priva di nuclenono ai tubi 2, 4 e 5.
    2. Aggiungere 4 -L di miscela PCR ai tubi 1-5.
    3. Aggiungere 14 - L di estrazione dell'acido nucleico dal campione A al tubo 1 e 14 l dal campione B al tubo 3.
    4. Aggiungere 2 -L di acidi nucleici estratti dal campione A al tubo 2 e 2 -L dal campione B al tubo 4. Chiudere la striscia di cinque tubi.
    5. Aggiungete 14 l di acqua priva di nuclenonità ai tubi 6, 7 e 8.
    6. Aggiungete 4 gradi di questo mix ai tubi 6, 7 e 8 e chiudeteli.
    7. Inserire entrambe le strisce nel termociclore e selezionare la conduttura appropriata (Tabella 3).
    8. Scartare il tubo dell'acqua e mantenere l'acido nucleico estratto nel congelatore, se possibile, o, in caso contrario, in un luogo fresco protetto dalla luce nel caso in cui sia necessario eseguire una seconda prova.
    9. Pulire correttamente le micropipette, il rack, il materiale di lavoro e tutto il materiale con un detergente acido nucleico e scartare il sacchetto di plastica contenente la punta, i guanti e i tubi usati.
      AVVISO: L'assovia dell'acido nucleico è un liquido e vapore molto infiammabili. Non respirare la nebbia spray ed evitare qualsiasi contatto del liquido con gli occhi o la pelle. In caso contrario, risciacquare immediatamente con abbondante acqua e consultare un medico.
    10. Raccogliere i risultati e analizzare i dati ottenuti.
  2. BCR quantitativo MS2
    1. Aggiungete 14 l di acqua priva di nuclenono ai tubi 2, 4 e 5.
    2. Aggiungete 4 -L di miscela PCR e 0,5 l di enzima di trascrizione inversa ai tubi 1-5.
    3. Aggiungere 14 - L di estrazione dell'acido nucleico dal campione A al tubo 1 e 14 l dal campione B al tubo 3.
    4. Aggiungere 1 l l di acidi nucleici estratti dal campione A al tubo 2 e 1 l dal campione B al tubo 4. Chiudere la striscia di cinque tubi.
    5. Aggiungete 15,5 l di acqua priva di nuclenonazione ai tubi 5, 6, 7 e 8 e chiudeteli.
    6. Aggiungete 4 o L di miscela PCR e 0,5 l di enzima di trascrizione inversa ai tubi 6, 7 e 8.
    7. Inserire entrambe le strisce nel termociclore e selezionare la conduttura appropriata (Tabella 3).
    8. Procedere come descritto nei passaggi da 4.1.8 a 4.1.10.

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Risultati

Sviluppo del metodo

Questa procedura è stata sviluppata nel Laboratorio dei virus Contaminanti dell'Acqua e degli Alimenti con la collaborazione di GenIUL e Oxfam Intermàn. Si compone di tre fasi diverse. Il primo, la concentrazione di particelle virali, è un adattamento di un metodo di flocculazione del latte scremato descritto in precedenza12,17,<...

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Discussione

Il metodo VirWaTest consente la concentrazione di virus e l'estrazione di acido nucleico da campioni d'acqua nel punto di utilizzo da parte di utenti non esperti. Si tratta di un protocollo conveniente, rapido e semplice. La concentrazione si basa sul principio della flocculazione organica con latte scremato, con il quale il pH basso e le condizioni di alta conduttività rendono le proteine del latte scremato aggregate in floc gli adsorbienti dei virus. Quando il sedimento di floc, è facile raccoglierli, rendendo possibil...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

VirWaTest è stato un progetto di ricerca finanziato dal programma HIF (Humanitarian Innovation Funds) di ELHRA (Enhancing Learning & Research for Humanitarian Assistance). Gli autori riconoscono i team WASH che hanno collaborato gentilmente a questo studio. L'analisi dei campioni in Ecuador è stata finanziata da Oxfam Ecuador e Direcciàn de Investigaciones de la Universidad de las Americas (AMB. BRT.17.01). S. Bofill-Mas è un borsista Serra-Hunter presso l'Università di Barcellona.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
5x HOT FIREPol Probe qPCR Mix Plus (ROX)Solis BioDyne08-14-00001Include la sonda HOT FIREPol di Solis Biodyne qPCR Mix Plus (qPCR Mix), 50 strisce
di reazioni da 8 microprovette con tappidD Biolab840637basso profilo, pareti sottili, adattate per batterie PCR quantitative e qualitative
adattatori di alimentazione per agitatore magneticoGenIUL900011674Include alimentazione per auto a 12 V adattatore
Supporto per secchioGenIUL900011648Secchio di supporto in alluminio
, 10 LCater4You10LTRPolipropilene, a prova di manomissione, provetta da centrifuga di colore trasparente
, 50 mLLabBoxCTSP-E50-050Polipropilene, sterile, graduato, con gonna
Acido citrico 1-idrato, 500 gPanReac AppliChem1410181211 puro, grado farmaceutico, 1 chilogrammo
Flacone in PET trasparenteLabBoxFPET-500-088Colore trasparente, PET, tappo non incluso
Latte scremato Difco, 500 gBecton Dickinson232100
Scudo DNA/RNA disidratato, 250 mLZymo ResearchR1100-250Terreno di conservazione DNA/RNA, 250 mL
Pipette Controller Easy9LabBoxEAS9-001-0010,3 μ m filtro, Pipette da 0,1 a 100 mL, Portapipette in silicone autoclavabile
Eppendorf Tube, 0,5 mLEppendorf0030121023 Polipropilene, Safe-Lock
Eppendorf Tube, 2 mLEppendorf0030120094Polipropilene, Safe-Lock
Eppendorf Tube, 5 mLdD Biolab999542Polipropilene, sterile, etanolo graduato
96% V/V, 1 LPanreac AppliChem361085-1611da laboratorio UV, IR  e HPLC
LabBoxFORS-007-002Estremità sottile e curva, L= 120 mm
Agitatore magneticoGenIUL900017000Pennarello a batteria
dD Biolab929203nero, punta extra fine, resistente all'acqua, asciugatura rapida, per plastica e vetreria
Micro Rota-Rack per microprovettedD Biolab377824 moduli, L x P x A= 208 x 100 x 100 mm
Cycler per PCR in tempo reale Mini8Coyote Biosciences, CinaMini-8portatile, funziona con alimentatori da 12 V o batterie esterne, due canali, capacità per 8 provette
NucliSens Lysis BufferBiomerieux200292Reagenti per un massimo di 48 isolamenti, conservare a temperatura ambiente
Pipetta sierologica a punta aperta, 10 mLDeltalab900136NTappo a vite in PE sterile, confezionato singolarmente (carta/plastica)
PP28LabBoxTP28-004-020per bottiglie in PET
Striscia indicatrice di pHLabBoxWSPH-001-001Intervallo da pH 2,8 a pH 4,4, 50 strisce per confezione
Provetta in plasticaQuimikals300913include tappo
Pipetta Pasteur in polietileneLabBoxPIPP-003-500Graduato, volume complessivo 7 ml,
con tappo a vite, 150 mLDeltalab409726Tappo a vite, sterile, graduato fino a 100 mL
Pallone a vite in polipropilene con tappo a vite, 60 mLDeltalab409526GTappo a vite, sterile, graduato fino a 50 mL
Detersivo in polvere- Sapone in polvere normale per lavare i vestiti
Cavi di alimentazione per agitatore magneticoGenIUL900011692Collegamento tra batterie e agitatori magnetici
QuickPick Magnetic ToolBioNobile24001Strumento portatile per particelle magnetiche
QuickPick Tips in BoxBioNobile24296Senza RNasi, autoclavato, 96 unità
QuickPick XL gDNA Particelle magneticheBioNobileSN511003,2 mL
Sali mariniSigma-AldrichS9883-500GUna miscela di sali artificiali molto simile alla composizione dei sali disciolti dell'acqua dell'oceano
Tubi in siliconeLabBoxSILT-006-005Rotolo di 5 metri, interno   x esterno  ø= 6 x 10 mm
Pellet di idrossido di sodio, 98,5 - 100,5%VWR Chemicals28244295Pellet, 1 kg
Piattaforma solare rotanteSOL-EXPERT Gruppo70020Piastra in acrilico, 10 giri/min, supporta fino a 300 grammi
Kit di sonde SOLIScript 1-stepSolis BioDyne08-57-00250Include la miscela di sonde One-Step 5x (qPCR Mix) e 40x SOLIScript Mix One-Step (enzima trascrittasi inversa), 250 reazioni
Kit di estrazione del virus RNA SPEEDTOOLSBioTools21.141-4197Include il tampone BAW (tampone di lavaggio 1), il tampone BAV3 (tampone di lavaggio 2 e 3) e il tampone BRE (tampone di eluizione) di BioTools.
SpinBar Octhaedral Stirring MagnetdD Biolab045926Pivot Ring, L x   ø = 38 x 8 mm, Pipetta sierologica blu
con estremità a nastro, 10 mLDeltalabPN10E1sterile, confezionata singolarmente (carta/plastica)
Pipetta sierologica con estremità a nastro, 50 mLDeltalab900043sterile, confezionata singolarmente (carta/plastica)
Termi-DNA-Tor - Dispositivo di rimozionedell'acido nucleicoBioTools22001-4291Rimozione di acidi nucleici, batteri, funghi e micoplasmi da materiale e superfici, 450 mL
di reagente per biologia molecolare dell'acqua, 1LSigma-AldrichW4502-1Lsenza nucleasi e proteasi, 0,1 μ m
Sacca Whirl-Pak filtrata, 540 mLDeltalab200361Fondo stabile
Sacca con chiusura a zipLabBoxBZIP-080-100Polietilene, L x L= 120 x 80 mm
e Per pinzette Pallone a vite in polipropilene non sterile

Riferimenti

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