È descritto un semplice e affidabile modello animale di roditore indotto dalla dieta per la steatoepatite non alcolica (NASH), ottenuto attraverso l'alloggiamento non SPF degli animali e la somministrazione di una dieta specifica ad alto contenuto di grassi. Descriviamo l'identificazione di sottoinsiemi di cellule immunitarie epatiche e adiposo per ricapitolare le condizioni immunologiche umane esponendo i topi ai germi ambientali.
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Articolo metodologico
Un modello avanzato di murine per la steatoepatite non alcolica in associazione con il diabete di tipo 2
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'obesità è associata a infiammazione cronica di basso grado e resistenza all'insulina, contribuendo ad una crescente prevalenza di malattie metaboliche croniche, come il diabete di tipo 2 e la steatoepatite non alcolica (NASH). Recenti ricerche hanno stabilito che le cellule immunitarie pro-infiammatorie infiltrano obesi tessuto adiposo ipertrofico e fegato. Data l'importanza emergente delle cellule immunitarie nel contesto dell'omeostasi metabolica, vi è la necessità critica di quantificare e caratterizzare la loro modificazione durante lo sviluppo del diabete di tipo 2 e NASH. Tuttavia, i modelli animali che inducono caratteristiche patofisiologiche tipiche della NASH umana sono scarsi.
In questo articolo, forniamo un protocollo dettagliato per identificare i sottogruppi di cellule immunitarie isolati dal fegato e dal tessuto adiposo in un modello di topo affidabile di NASH, stabilito da topi con dieta ad alto contenuto di grassi (HFD) in condizioni non specifiche prive di patogeno (SPF) senza barriera per almeno sette settimane. Dimostriamo la manipolazione dei topi in condizioni non-SPF, la digestione dei tessuti e l'identificazione dei macrofagi, delle cellule Natural Killer (NK), delle cellule dendritiche, dei sottogruppi di cellule B e T mediante citometria a flusso. Sono forniti diagrammi di citometria a flusso rappresentativo da topi HFD SPF e topi non SPF. Per ottenere dati affidabili e interpretabili, l'uso di anticorpi, metodi precisi e precisi per la digestione dei tessuti e la corretta gating negli esperimenti di citometria a flusso sono elementi critici.
L'intervento per ripristinare l'esposizione fisiologica di antigene nei topi che li ospita in condizioni non-SPF e l'esposizione non specifica agli antigeni microbici potrebbe fornire uno strumento pertinente per indagare il legame tra alterazioni immunologiche, l'obesità e le correlate complicazioni a lungo termine.
Introduzione
L'obesità è un disturbo multifattoriale e un importante fattore di rischio per lo sviluppo di malattie cardiache, ictus, steatoepatite non alcolica (NASH), diabete di tipo 2 (T2D) e alcuni tipi di cancro. La prevalenza dell'obesità è in rapida crescita a livello globale. Oggi, 2,1 miliardi persone — quasi il 30% della popolazione mondiale — sono obesi o sovrappeso1. La resistenza all'insulina associata all'obesità può portare a T2D, quando le cellule beta dell'isolotto pancreatica esaurite non riescono a compensare l'aumentata necessità di insulina per mantenere l'omeostasi del glucosio2.
Tess....
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Protocollo
Questo studio è stato effettuato in conformità con la guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio degli istituti nazionali di sanità e della legge sul benessere degli animali sotto la supervisione del nostro Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali. I protocolli animali sono stati condotti secondo le linee guida etiche istituzionali della Charité Berlin, Germania, e sono stati approvati dal Landesamt für Gesundheit und Soziales e sono conformi alle linee guida di arrivo.
1. modello animale indotto dalla dieta di steatoepatite
- Trasferire i topi (topi C57BL/6J, maschio) in un alloggiamento non SPF all'età ....
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Risultati
Il protocollo descritto consente la caratterizzazione di marcatori superficiali di cellule immunitarie innate e adattative isolate dal tessuto adiposo perigonadica murina e dal fegato in un modello di NASH indotto dalla dieta. In questo modello, NASH è stato indotto dalla somministrazione di HFD più saccarosio (6%) in acqua potabile per 7 a 15 settimane in topi topi C57BL/6J, come precedentemente riportato13. È importante sottolineare che i topi sono stati alloggiati in condizioni semi sterili e, .......
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Discussione
La steatoepatite ha una forte associazione con anomalie metaboliche come l'obesità, l'insulino-resistenza e la dislipidemia15. Studi multipli indicano che l'infiammazione del tessuto adiposo può guidare la patogenesi del diabete di tipo 2, compresi i livelli alterati di cellule del sistema immunitario innato e adattivo4,5,16,17 . Inoltre, è stato trovato che l'obesità mo.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Ringraziamo anke Giuch, Diana Woellner, Dr. Kathrin Witte e Cornelia Heckmann per l'assistenza con le procedure sperimentali e Benjamin Tiburzy di Biolegend per commenti utili sulla strategia di gating. La JS è stata sostenuta dall'Helmholtz Grant (ICEMED). Questo studio è stato sostenuto da sovvenzioni dall'unità di ricerca clinica del Berlin Institute of Health (BIH), il "BCRT-Grant" dal Ministero federale tedesco per l'istruzione e la ricerca e la Fondazione Einstein. K.S.-B. e H.-D.V. sono finanziati da FOR2165.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 100 µ filtri per cellule m | Falcon | 352340 | |
| siringa da 1 mL | BD | ||
| 26 G x 5/8 aghi | BD | ||
| Piastre di Petri da 35 mm | Falcon | 353001 | |
| 40 µ filtri per cellule m | Falcon | 352340 | |
| ACK tampone di lisi | GIBCO | A1049201 | |
| Alexa Fluor 700 anti-topo CD45 | Biolegend | 103127 | AB_493714 (BioLegend Cat. N. 103127) |
| Software di analisi | FlowJo 10.0.8 software | ||
| APC anti-topo CD11c Anticorpo | Biolegend | 117309 | AB_313778 (BioLegend Cat. No. 117309) |
| APC anti-topo KLRG1 (MAFA) Anticorpo | Biolegend | 138411 | AB_10645509 (BioLegend Cat. No. 138411) |
| BV421 anti-topo CD127 Antibody | Biolegend | 135023 | AB_10897948 (BioLegend Cat. No. 135023) |
| BV421 anti-topo F4/80 Anticorpo | Biolegend | 123131 | AB_10901171 (BioLegend Cat. No. 123131) |
| BV605 anti-topo CD279 (PD-1) Anticorpo | Biolegend | 135219 | AB_11125371 (BioLegend Cat. No. 135219) |
| BV605 anti-topo NK-1.1 Anticorpo | Biolegend | 108739 | AB_2562273 (BioLegend Cat. No. 108739) |
| BV650 anti-topo/umano CD11b Antibody | Biolegend | 101239 | AB_11125575 (BioLegend Cat. No. 101239) |
| BV711 anti-topo/umano B220 Antibody | Biolegend | 103255 | AB_2563491 (BioLegend Cat. No. 103255) |
| BV785 anti-topo CD8a Anticorpo | Biolegend | 100749 | AB_11218801 (BioLegend Cat. No. 100749) |
| C57Bl/6J topi, maschio, 5 settimane | Forschungseinrichtungen fü r experimentelle Medizin (FEM) | ||
| CaCl2 | Charité - Universitä tsmedizin Berlin | A119.1 | |
| Collagenasi NB 4G Grado Provato | SERVA | ||
| Collagenasi Typ I | Worthington | ||
| Provetta da centrifuga conica 15mL | Falcon | 352096 | |
| Provetta da centrifuga conica 50 mL | Falco | 352070 | |
| DNA | Sigma-Aldrich | ||
| Siero fetale bovino | Biochrom | S0115 | |
| Filtro 30µ m | Celltrics | ||
| FITC anti-topo CD3 Antibody | Biolegend | 100203 | AB_312660 (BioLegend Cat. No. 100203) |
| Citometria a flusso | BD-LSR Fortessa | ||
| Pinze | Sigma-Aldrich | F4142-1EA | |
| HBSS | Bioanalitico GmBH | 085021-0500 | |
| Dieta ricca di grassi | SSNIF | E15741– 34 | 60 kJ% da grasso, 19&magro kJ% da proteine e 21 kJ% da |
| forbici per micro dissezione dei carboidrati | Sigma-Aldrich | S3146 | utilizzato per scopi di dissezione |
| PE anti-topo CD25 Anticorpo | Biolegend | 101903 | AB_312846 (BioLegend Cat. No. 101903) |
| PE/Cy7 anti-topo CD62L Antibody | Biolegend | 104417 | AB_313102 (BioLegend Cat. No. 104417) |
| PE/Cy7 anti-topo I-A/I-E (MHCII) Anticorpo | Biolegend | 107629 | AB_2290801 (BioLegend Cat. No. 107629) |
| PE/Dazzle 594 anti-topo CD4 Antibody | Biolegend | 100565 | AB_2563684 (BioLegend Cat. No. 100565) |
| Soluzione Percoll | Biochrom | L6115 | |
| PerCP/Cy5.5 anti-topo CD44 Anticorpo | Biolegend | 103031 | AB_2076206 (BioLegend Cat. No. 103031) |
| PerCP/Cy5.5 anti-topo Gr-1 Antibody | Biolegend | 108427 | AB_893561 (BioLegend Cat. N. 108427) |
| Soluzione salina tamponata con fosfato | Tubi Gibco | 12559069 | |
| a fondo tondo con tappo del filtro cellulare | STEMCELL Technologies | 38030 | |
| TruStain fcX anti-topo CD16/32 | Biolegend | 101301 | AB_312800 (BioLegend Cat. No. 101301) |
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T6146 | |
| Kit di vitalità riparabile Zombie NIR | Biolegend | 423105 | macchia di viablità |
Riferimenti
- Guh, D. P., et al. The incidence of co-morbidities related to obesity and overweight: A systematic review and meta-analysis. BMC Public Health. 9, 88(2009).
- Prentki, M. Islet β cell failure in type. J Clin Invest. 116 (7), 1802-1812 ....
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Ristampe e permessi
