È descritto un semplice e affidabile modello animale di roditore indotto dalla dieta per la steatoepatite non alcolica (NASH), ottenuto attraverso l'alloggiamento non SPF degli animali e la somministrazione di una dieta specifica ad alto contenuto di grassi. Descriviamo l'identificazione di sottoinsiemi di cellule immunitarie epatiche e adiposo per ricapitolare le condizioni immunologiche umane esponendo i topi ai germi ambientali.
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Articolo metodologico
Un modello avanzato di murine per la steatoepatite non alcolica in associazione con il diabete di tipo 2
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'obesità è associata a infiammazione cronica di basso grado e resistenza all'insulina, contribuendo ad una crescente prevalenza di malattie metaboliche croniche, come il diabete di tipo 2 e la steatoepatite non alcolica (NASH). Recenti ricerche hanno stabilito che le cellule immunitarie pro-infiammatorie infiltrano obesi tessuto adiposo ipertrofico e fegato. Data l'importanza emergente delle cellule immunitarie nel contesto dell'omeostasi metabolica, vi è la necessità critica di quantificare e caratterizzare la loro modificazione durante lo sviluppo del diabete di tipo 2 e NASH. Tuttavia, i modelli animali che inducono caratteristiche patofisiologiche tipiche della NASH umana sono scarsi.
In questo articolo, forniamo un protocollo dettagliato per identificare i sottogruppi di cellule immunitarie isolati dal fegato e dal tessuto adiposo in un modello di topo affidabile di NASH, stabilito da topi con dieta ad alto contenuto di grassi (HFD) in condizioni non specifiche prive di patogeno (SPF) senza barriera per almeno sette settimane. Dimostriamo la manipolazione dei topi in condizioni non-SPF, la digestione dei tessuti e l'identificazione dei macrofagi, delle cellule Natural Killer (NK), delle cellule dendritiche, dei sottogruppi di cellule B e T mediante citometria a flusso. Sono forniti diagrammi di citometria a flusso rappresentativo da topi HFD SPF e topi non SPF. Per ottenere dati affidabili e interpretabili, l'uso di anticorpi, metodi precisi e precisi per la digestione dei tessuti e la corretta gating negli esperimenti di citometria a flusso sono elementi critici.
L'intervento per ripristinare l'esposizione fisiologica di antigene nei topi che li ospita in condizioni non-SPF e l'esposizione non specifica agli antigeni microbici potrebbe fornire uno strumento pertinente per indagare il legame tra alterazioni immunologiche, l'obesità e le correlate complicazioni a lungo termine.
Introduzione
L'obesità è un disturbo multifattoriale e un importante fattore di rischio per lo sviluppo di malattie cardiache, ictus, steatoepatite non alcolica (NASH), diabete di tipo 2 (T2D) e alcuni tipi di cancro. La prevalenza dell'obesità è in rapida crescita a livello globale. Oggi, 2,1 miliardi persone — quasi il 30% della popolazione mondiale — sono obesi o sovrappeso1. La resistenza all'insulina associata all'obesità può portare a T2D, quando le cellule beta dell'isolotto pancreatica esaurite non riescono a compensare l'aumentata necessità di insulina per mantenere l'omeostasi del glucosio2.
Tessuto adiposo è composto da vari tipi di cellule tra cui adipociti, cellule endoteliali, fibroblasti e cellule immunitarie. Durante la progressione dell'obesità, i cambiamenti nel numero e nell'attività delle cellule immunitarie possono portare a un'infiammazione di basso grado del tessuto adiposo ipertrofico3,4. In particolare, è stato riscontrato che l'eccessiva assunzione di energia, accompagnata da livelli cronicamente elevati di glucosio nel sangue, trigliceridi e acidi grassi liberi, porta ad ipossia adipociti, stress del reticolo endoplasmatico, compromissione della funzione mitocondriale e secrezione di citochine potenziata, con conseguente attivazione di cellule immunitarie adiposo pro-infiammatorie5,6. La ricerca passata si è concentrata principalmente sull'immunità innata, ma più recentemente le cellule immunitarie adattative (cellule T e B) sono emerse come importanti regolatori dell'omeostasi del glucosio. Possiedono cellule infiammatorie (tra cui CD8+ t, Th1 e B) o principalmente funzioni regolatorie (comprese le cellule t (Treg) regolatorie, cellule Th2) e possono sia esacerbare che proteggere contro l'insulino-resistenza7,8 , 9. il
Inoltre, sono stati proposti diversi meccanismi per spiegare come l'obesità aumenti la steatoepatite, inclusa l'aumento della produzione di citochines da parte del tessuto adiposo10. NASH, la forma progressiva di malattia epatica grassa non alcolica e un importante onere sanitario nei paesi sviluppati, è istologicamente caratterizzata da epatociti con pallino, accumulo lipidico, fibrosi e infiammazione pericellulare e può progredire verso malattia epatica in stadio terminale o carcinoma epatocellulare. Diversi regimi (ad esempio la metionina e la dieta carente di colina11) sono noti per indurre la patologia epatica simile a Nash in modelli animali non umani, ma la maggior parte di questi approcci non ricapitolano le condizioni umane di Nash e il suo metabolismo metabolico conseguenze in quanto richiedono un gene knockout specifico, manipolazioni dietetiche non fisiologiche o mancanza di insulino-resistenza tipica della NASH umana. Inoltre, la nostra comprensione dei meccanismi di base delle malattie metaboliche è attualmente basata su esperimenti condotti con topi di laboratorio alloggiati in condizioni specifiche esenti da patogeno (SPF) standard. Tali strutture di barriera sono anormalmente igieniche e non considerano la diversità microbica che gli esseri umani devono incontrare, il che può tenere conto delle difficoltà nel processo di traduzione degli studi sugli animali agli approcci clinici12,13 , ( 14).
Per indagare i diversi sottogruppi di cellule immunitarie nel tessuto adiposo e nel fegato durante lo sviluppo di resistenza all'insulina e NASH in un modello di topo avanzato che riproduce le condizioni immunologiche umane, i topi sono stati alloggiati in singole gabbie in semi sterili condizioni senza barriere. I topi alloggiati in condizioni di antigene esposto hanno sviluppato una patologia epatica simile a NASH già dopo 15 settimane di alimentazione ad alto contenuto di grassi (HFD)13. Rispetto ai topi SPF abbinati all'età hanno sviluppato steatosi macrovesicolare, infiltrazione epatica e attivazione delle cellule immunitarie.
Questo manoscritto descrive una solida analisi della citometria a flusso per definire e contare i sottogruppi delle cellule immunitarie dal tessuto adiposo del topo e dal fegato in un modello di NASH. L'analisi della citometria a flusso consente il rilevamento simultaneo di più parametri di singole cellule in contrasto con gli approcci RT-PCR o immunoistochimica.
In sintesi, il nostro studio offre un modello di topo di HFD a breve termine per indagare lo sviluppo di insulino-resistenza e NASH e i meccanismi di base che mostra anche la fedeltà alla condizione umana.
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Protocollo
Questo studio è stato effettuato in conformità con la guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio degli istituti nazionali di sanità e della legge sul benessere degli animali sotto la supervisione del nostro Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali. I protocolli animali sono stati condotti secondo le linee guida etiche istituzionali della Charité Berlin, Germania, e sono stati approvati dal Landesamt für Gesundheit und Soziales e sono conformi alle linee guida di arrivo.
1. modello animale indotto dalla dieta di steatoepatite
- Trasferire i topi (topi C57BL/6J, maschio) in un alloggiamento non SPF all'età di 4 settimane e esporli continuamente a una vasta gamma di agenti patogeni/antigeni ambientali. Garantire l'esposizione con la manipolazione quotidiana degli animali da laboratorio in quanto gli antigeni sono distribuiti dal passaggio dell'aria in questo modo.
- Mantenere i topi (topi C57BL/6J, maschi, 12 settimane di età) in sistemi di ingabbiamento aperti con filtri convenzionali su un ciclo di luce/buio 12 h:12 h ad una temperatura di 22 ° c. Non irradiare o autoclave dieta sperimentale e biancheria da letto. Accesso struttura di alloggiamento degli animali senza maschera o hairnet. Aprire le porte tra le stanze degli animali. Non utilizzare un AirShower.
- Garantire la manipolazione quotidiana degli animali da laboratorio e cambiare le stanze regolarmente in modo che gli antigeni siano distribuiti dal passaggio dell'aria. Completano l'alloggiamento sporco con esposizione microbica giornaliera non specifica agli antigeni dalla lettiera di animali da laboratorio di mammiferi alloggiati nelle camere accanto ai topi di laboratorio.
- Misurare le proporzioni della memoria CD44-CD62L- Effettuatore cellule CD4+ e CD8+ T nel sangue e nella milza utilizzando la citometria a flusso (come descritto in refefence13).
Nota: A questo proposito abbiamo definito un aumento del 20% della memoria effettrice CD8+ cellule t da CD8+ cellule t come prova di sufficiente esposizione microbica. - Avviare HFD (60 kJ% dal grasso, 19 kJ% da proteine e 21 kJ% da carboidrati e ad libitum consumo di acqua con 6% di saccarosio contenuto con 5-settimana vecchio topi C57BL/6J topi maschi per 7-15 settimane. L'HFD deve contenere 60% kJ di grassi (come descritto sopra) al fine di indurre lo sviluppo di insulino-resistenza durante tutto il corso dell'esperimento.
Nota: La colorazione di ematossilina deve essere eseguita e le caratteristiche istologiche come il ballooning degli epatociti, i corpi di Mallory Denk, l'infiltrazione delle cellule immunitarie e la steatosi macrovesicolare devono essere trovati per dimostrare la patologia epatica simile a NASH (come mostrato in riferimento 13).
2. preparazione di reagenti e soluzioni
- Preparare 70% etanolo, soluzione salina tamponata con fosfato (PBS, senza calcio e magnesio) integrata con tampone di lisi 0,5% BSA e ACK (ammonio-cloruro-potassio).
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Tampone di colorazione
- Sciogliere 10 mL di siero di vitello fetale (FCS) in 500 mL di PBS per ottenere il 2% di PBS FCS. Posizionare il tampone di colorazione sul ghiaccio prima dell'uso.
- Conservare la soluzione in una bottiglia di plastica a 4 ° c.
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Soluzione di collagenasi per la digestione del tessuto adiposo
- Sciogliere 2,5 g di albumina sierica bovina (BSA) in 500 mL di PBS per ottenere un 0,5% di BSA/PBS.
- Sciogliere 74,5 g di CaCl2 in 10 mL di 0,5% BSA/PBS per ottenere una soluzione di CAcl2 da 10 mm.
- Aggiungere 1 mg di collagenasi di tipo II (vedere tabella dei materiali) ad ogni mL di 0,5% BSA con 10 mm di CAcl2 PBS.
- Preparare 3 mL di soluzione di digestione di collagenasi per g di campione di tessuto adiposo. Preparare una soluzione di collagenasi fresca per ogni isolamento.
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Soluzione di collagenasi per la digestione del tessuto epatico
- Sciogliere 2,5 g di BSA in 500 mL di soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS) per ottenere il 0,5% di HBSS BSA.
- Aggiungere 10 mL di FCS in 500 mL di 0,5% BSA/HBSS per ottenere il 2% di FCS 0,5% BSA/HBSS.
- Aggiungere 0,5 mg di collagenasi di tipo IV (vedere tabella dei materiali) ad ogni ml di 2% FCS 0,5% BSA/HBSS.
- Aggiungere 0,02 mg di DNasi per mL di soluzione di collagenasi 2% FCS 0,5% BSA/HBSS.
- Preparare 13 mL di soluzione digeribile di collagenasi per campione di tessuto epatico.
- Preparare una soluzione di collagenasi fresca per ogni isolamento.
3. generazione di sospensioni a cellula singola
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Digestione del tessuto adiposo
- Euthanize topi attraverso l'anestesia isoflurano seguita da dislocazione cervicale. Spruzzare il petto con 70% di etanolo. Fare con cautela un'incisione centrale di 5-6 cm attraverso l'tegumento e la parete addominale lungo l'intera lunghezza della gabbia toracica per esporre la cavità pleurica e il cuore.
Nota: Non danneggiare gli organi sottostanti e tenere le punte delle forbici. - Iniettare almeno 10 mL di soluzione salina al 0,9% nell'apice del ventricolo sinistro utilizzando un ago da 26 G.
Nota: Perfusione di successo è notato da scottatura del fegato. - Aprire la cavità peritoneale con le forbici e ritagliare i tamponi di grasso perigonadici su ogni lato con forbici curve sottili. Dissect tessuti gonadica con forbici curve sottili e pesare il tessuto adiposo.
- Eseguire la dissociazione meccanica usando le forbici e tagliare il tessuto adiposo in pezzi sottili in una capsula di Petri a 4 ° c. Trasferire il tessuto adiposo a 50 mL di provette centrifughe coniche e sciacquare la capsula di Petri con 1 mL di 0,5% di BSA/PBS.
- Aggiungere 3 mL di soluzione di digestione del tessuto adiposo (come preparato al punto 2,3) per grammo di tessuto adiposo. Incubare la soluzione di tessuto adiposo a 37 ° c per 20 minuti sotto agitazione delicata (200 rpm).
- Aggiungere 5 mL di 0,5% BSA/PBS per grammo di tessuto adiposo e posizionarlo sul ghiaccio. Triturati la soluzione numerose volte con una pipetta sierologica da 10 mL e passarla attraverso un filtro (100 μm) con l'ausilio di uno stantuffo.
- Centrifugare a 500 x g per 10 min a 4 ° c.
- Rimuovere la frazione di degli adipociti galleggiante mediante pipettaggio. Risospendere il pellet cellulare (frazione vascolare stromale) in 1 mL di tampone di lisi ACK (vedere tabella dei materiali). Aggiungere 10 mL di PBS 2% FCS.
- Centrifugare a 500 x g per 10 min a 4 ° c.
- Decant surnatante e risospendere il pellet cellulare in 250 μL di PBS 2% FCS.
- Conta il numero di cellule vitali su un emocitometro usando l'esclusione blu Trypan.
- Euthanize topi attraverso l'anestesia isoflurano seguita da dislocazione cervicale. Spruzzare il petto con 70% di etanolo. Fare con cautela un'incisione centrale di 5-6 cm attraverso l'tegumento e la parete addominale lungo l'intera lunghezza della gabbia toracica per esporre la cavità pleurica e il cuore.
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Digestione del tessuto epatico
- Conservare il fegato in un tubo di centrifuga conico riempito con PBS e trasportare sul ghiaccio.
- Eseguire la dissociazione meccanica con i timbri della siringa in una capsula di Petri a 4 ° c. Mettere il tessuto epatico dissezionato in una provetta da centrifuga conica da 50 mL contenente 10 mL di soluzione di digestione del fegato calda. Sciacquare la capsula di Petri con 3 mL di soluzione di digestione del fegato.
- Incubare la soluzione di tessuto epatico a 37 ° c per 20 minuti sotto agitazione delicata (200 rpm).
- Aggiungere 20 mL di HBSS. Triturati la soluzione numerose volte con una pipetta sierologica da 10 mL e passarla attraverso un filtro (100 μm) con l'ausilio di uno stantuffo.
- Centrifugare a 500 x g per 10 min a 4 ° c. Decant il surnatante e risospendi il pellet cellulare in 20 mL di HBSS.
- Centrifugare a 30 x g per 1 minuto a temperatura ambiente per rimuovere la matrice di epatociti. Scartare il pellet cellulare.
- Centrifugare il supernatante a 500 x g per 10 min a 4 ° c. Risospendere il pellet in 10 mL di 33% di soluzione media a bassa densità di viscosità (vedere tabella dei materiali) in HBSS seguita da centrifugazione (800 x g; 30 min; temperatura ambiente; senza freno).
- Risospendere il pellet in 1 mL di tampone di lisi ACK e incubare per 4 minuti a temperatura ambiente. Quindi aggiungere 10 mL di HBSS.
Nota: Per scartare il supernatante aspirare il supernatante con interfase (epatociti) con molta attenzione con una pipetta di trasferimento (il più possibile senza prendere il pellet con cellule immunitarie ed eritrociti). - Passare le celle attraverso un filtro da 30 μm in una provetta da centrifuga conica da 15 mL e centrifugare a 500 x g per 10 min a 4 ° c. Decant surnatante e risospendere il pellet cellulare in 250 μL di PBS 2% FCS.
- Conta il numero di cellule vitali su un emocitometro usando l'esclusione blu Trypan.
4. colorazione superficiale
- Preparare la miscela anticorpale per le cellule T-sottogruppi (pannello 1) e le cellule immunitarie innate (pannello 2) come descritto nella tabella 1 e nella tabella 2. I volumi sono ottimizzati per un campione (100 μL) per quanto riguarda le concentrazioni anticorpali.
Nota: I linfociti e le cellule immunitarie innate presentano differenze nell'autofluorescenza e devono essere analizzati separatamente. - Utilizzare fino a 3 x 106 cellule in 100 μl in un tubo di polistirene FACS per la colorazione superficiale. Per bloccare i recettori FC aggiungere 10 μL di anticorpo anti-CD16/CD32 (diluito 1:100) e incubare per 10 min sul ghiaccio. Utilizzare un campione di controllo negativo non macchiato per regolare la dispersione laterale (SSC) e la dispersione in avanti (FSC) per determinare la posizione della popolazione di celle negative.
- Vortex e aggiungere il volume appropriato di miscela di anticorpi per il pannello 1 e il pannello 2. Aggiungere 1 μL di colorante di vitalità a ciascun campione per consentire la discriminazione in tempo reale e a cellule morte. Incubare per 20 min a 4 ° c e protetto dalla luce.
- Lavare due volte con 2 mL di 2% FCS PBS e centrifugare a 300 x g per 5 min a 4 ° c.
- Risospendere il pellet cellulare in 300 μL di PBS del 2% e conservare a 4 ° c fino all'analisi FACS.
Nota: Prima di iniziare la misurazione passare le celle attraverso il filtro a cellule 30 μm in polistirolo FACS tubo e Vortex. La citometria a flusso è stata eseguita con cellule etichettate immagazzinate nel 2% FCS PBS a 4 ° c per 1-3 h. le cellule devono essere analizzate il prima possibile per risultati ottimizzati.
5. compensazione, acquisizione e gating della citometria a flusso
- Eseguire un campione di controllo negativo non macchiato per impostare FSC e SSC e regolare le tensioni del citometro di flusso per rilevare le popolazioni leucocitarie e distinguere tra detriti e cellule vitali. Escludere detriti e cellule morte.
Nota: La vitalità delle sospensioni cellulari dal fegato potrebbe essere inferiore alla vitalità dalle sospensioni cellulari dal tessuto adiposo perigonadica a causa di un ulteriore passaggio di separazione della densità. - Eseguire singoli campioni di controllo macchiato per la compensazione multi-colore.
Nota: Le perle di cattura degli anticorpi potrebbero anche essere utilizzate per adattarsi alla sovrapposizione spettrale se il numero di celle di una popolazione di cellule di interesse è troppo basso per compensare l'uso delle cellule. Per rilevare possibili segnali di autofluorescenza della fluorescenza delle cellule meno uno (FMO) controlli per ogni anticorpo sono raccomandati ma non sono stati applicati in questo protocollo. - Avviare la misurazione, raccogliere il numero appropriato di eventi (almeno 50.000 eventi) e registrare dati sperimentali.
- Esporta i file di dati FCS per l'analisi e imposta la strategia di gating. Cancello su CD45+ leucocititi per identificare le popolazioni cellulari successive.
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Risultati
Il protocollo descritto consente la caratterizzazione di marcatori superficiali di cellule immunitarie innate e adattative isolate dal tessuto adiposo perigonadica murina e dal fegato in un modello di NASH indotto dalla dieta. In questo modello, NASH è stato indotto dalla somministrazione di HFD più saccarosio (6%) in acqua potabile per 7 a 15 settimane in topi topi C57BL/6J, come precedentemente riportato13. È importante sottolineare che i topi sono stati alloggiati in condizioni semi sterili e, ...
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Discussione
La steatoepatite ha una forte associazione con anomalie metaboliche come l'obesità, l'insulino-resistenza e la dislipidemia15. Studi multipli indicano che l'infiammazione del tessuto adiposo può guidare la patogenesi del diabete di tipo 2, compresi i livelli alterati di cellule del sistema immunitario innato e adattivo4,5,16,17 . Inoltre, è stato trovato che l'obesità mo...
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Ringraziamo anke Giuch, Diana Woellner, Dr. Kathrin Witte e Cornelia Heckmann per l'assistenza con le procedure sperimentali e Benjamin Tiburzy di Biolegend per commenti utili sulla strategia di gating. La JS è stata sostenuta dall'Helmholtz Grant (ICEMED). Questo studio è stato sostenuto da sovvenzioni dall'unità di ricerca clinica del Berlin Institute of Health (BIH), il "BCRT-Grant" dal Ministero federale tedesco per l'istruzione e la ricerca e la Fondazione Einstein. K.S.-B. e H.-D.V. sono finanziati da FOR2165.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 100 µ filtri per cellule m | Falcon | 352340 | |
| siringa da 1 mL | BD | ||
| 26 G x 5/8 aghi | BD | ||
| Piastre di Petri da 35 mm | Falcon | 353001 | |
| 40 µ filtri per cellule m | Falcon | 352340 | |
| ACK tampone di lisi | GIBCO | A1049201 | |
| Alexa Fluor 700 anti-topo CD45 | Biolegend | 103127 | AB_493714 (BioLegend Cat. N. 103127) |
| Software di analisi | FlowJo 10.0.8 software | ||
| APC anti-topo CD11c Anticorpo | Biolegend | 117309 | AB_313778 (BioLegend Cat. No. 117309) |
| APC anti-topo KLRG1 (MAFA) Anticorpo | Biolegend | 138411 | AB_10645509 (BioLegend Cat. No. 138411) |
| BV421 anti-topo CD127 Antibody | Biolegend | 135023 | AB_10897948 (BioLegend Cat. No. 135023) |
| BV421 anti-topo F4/80 Anticorpo | Biolegend | 123131 | AB_10901171 (BioLegend Cat. No. 123131) |
| BV605 anti-topo CD279 (PD-1) Anticorpo | Biolegend | 135219 | AB_11125371 (BioLegend Cat. No. 135219) |
| BV605 anti-topo NK-1.1 Anticorpo | Biolegend | 108739 | AB_2562273 (BioLegend Cat. No. 108739) |
| BV650 anti-topo/umano CD11b Antibody | Biolegend | 101239 | AB_11125575 (BioLegend Cat. No. 101239) |
| BV711 anti-topo/umano B220 Antibody | Biolegend | 103255 | AB_2563491 (BioLegend Cat. No. 103255) |
| BV785 anti-topo CD8a Anticorpo | Biolegend | 100749 | AB_11218801 (BioLegend Cat. No. 100749) |
| C57Bl/6J topi, maschio, 5 settimane | Forschungseinrichtungen fü r experimentelle Medizin (FEM) | ||
| CaCl2 | Charité - Universitä tsmedizin Berlin | A119.1 | |
| Collagenasi NB 4G Grado Provato | SERVA | ||
| Collagenasi Typ I | Worthington | ||
| Provetta da centrifuga conica 15mL | Falcon | 352096 | |
| Provetta da centrifuga conica 50 mL | Falco | 352070 | |
| DNA | Sigma-Aldrich | ||
| Siero fetale bovino | Biochrom | S0115 | |
| Filtro 30µ m | Celltrics | ||
| FITC anti-topo CD3 Antibody | Biolegend | 100203 | AB_312660 (BioLegend Cat. No. 100203) |
| Citometria a flusso | BD-LSR Fortessa | ||
| Pinze | Sigma-Aldrich | F4142-1EA | |
| HBSS | Bioanalitico GmBH | 085021-0500 | |
| Dieta ricca di grassi | SSNIF | E15741– 34 | 60 kJ% da grasso, 19&magro kJ% da proteine e 21 kJ% da |
| forbici per micro dissezione dei carboidrati | Sigma-Aldrich | S3146 | utilizzato per scopi di dissezione |
| PE anti-topo CD25 Anticorpo | Biolegend | 101903 | AB_312846 (BioLegend Cat. No. 101903) |
| PE/Cy7 anti-topo CD62L Antibody | Biolegend | 104417 | AB_313102 (BioLegend Cat. No. 104417) |
| PE/Cy7 anti-topo I-A/I-E (MHCII) Anticorpo | Biolegend | 107629 | AB_2290801 (BioLegend Cat. No. 107629) |
| PE/Dazzle 594 anti-topo CD4 Antibody | Biolegend | 100565 | AB_2563684 (BioLegend Cat. No. 100565) |
| Soluzione Percoll | Biochrom | L6115 | |
| PerCP/Cy5.5 anti-topo CD44 Anticorpo | Biolegend | 103031 | AB_2076206 (BioLegend Cat. No. 103031) |
| PerCP/Cy5.5 anti-topo Gr-1 Antibody | Biolegend | 108427 | AB_893561 (BioLegend Cat. N. 108427) |
| Soluzione salina tamponata con fosfato | Tubi Gibco | 12559069 | |
| a fondo tondo con tappo del filtro cellulare | STEMCELL Technologies | 38030 | |
| TruStain fcX anti-topo CD16/32 | Biolegend | 101301 | AB_312800 (BioLegend Cat. No. 101301) |
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T6146 | |
| Kit di vitalità riparabile Zombie NIR | Biolegend | 423105 | macchia di viablità |
Riferimenti
- Guh, D. P., et al. The incidence of co-morbidities related to obesity and overweight: A systematic review and meta-analysis. BMC Public Health. 9, 88(2009).
- Prentki, M. Islet β cell failure in type. J Clin Invest. 116 (7), 1802-1812 (2006).
- Shoelson, S. E., Lee, J., Goldfine, A. B. Inflammation and insulin resistance. Journal of Clinical Investigation. 116 (7), 1793-1801 (2006).
- Kahn, S. E., Hull, R. L., Utzschneider, K. M. Mechanisms linking obesity to insulin resistance and type 2 diabetes. Nature. 444, 840(2006).
- Exley, M. A., Hand, L., O'Shea, D., Lynch, L. Interplay between the immune system and adipose tissue in obesity. Journal of Endocrinology. 223 (2), R41-R48 (2014).
- Ferrante, A. W. Macrophages, fat, and the emergence of immunometabolism. Journal of Clinical Investigation. 123 (12), 4992-4993 (2013).
- Winer, D. A., et al. B cells promote insulin resistance through modulation of T cells and production of pathogenic IgG antibodies. Nature Medicine. 17, 610(2011).
- Onodera, T., et al. Adipose tissue macrophages induce PPARγ-high FOXP3(+) regulatory T cells. Scientific Reports. 5, (2015).
- Lackey, D. E., Olefsky, J. M. Regulation of metabolism by the innate immune system. Nature Reviews Endocrinology. 12, 15(2015).
- Calle, E. E., Kaaks, R. Overweight, obesity and cancer: epidemiological evidence and proposed mechanisms. Nature Reviews Cancer. 4, 579(2004).
- Ibrahim, S. H., Hirsova, P., Malhi, H., Gores, G. J. Animal Models of Nonalcoholic Steatohepatitis: Eat, Delete, and Inflame. Digestive Diseases and Sciences. 61 (5), 1325-1336 (2016).
- Beura, L. K., et al. Recapitulating adult human immune traits in laboratory mice by normalizing environment. Nature. 532 (7600), 512-516 (2016).
- Sbierski-Kind, J., et al. Distinct Housing Conditions Reveal a Major Impact of Adaptive Immunity on the Course of Obesity-Induced Type 2 Diabetes. Frontiers in Immunology. 9 (1069), (2018).
- Japp, A. S., et al. Wild immunology assessed by multidimensional mass cytometry. Cytometry Part A. 91 (1), 85-95 (2017).
- Benedict, M., Zhang, X. Non-alcoholic fatty liver disease: An expanded review. World Journal of Hepatology. 9 (16), 715-732 (2017).
- McNelis, J. C., Olefsky, J. M. Macrophages, Immunity, and Metabolic Disease. Immunity. 41 (1), 36-48 (2014).
- Ferrante, A. W. The Immune Cells in Adipose Tissue. Diabetes, Obesity & Metabolism. 15, 34-38 (2013).
- Bertola, A., et al. Hepatic expression patterns of inflammatory and immune response genes associated with obesity and NASH in morbidly obese patients. PloS One. 5 (10), e13577(2010).
- Turnbaugh, P. J., Bäckhed, F., Fulton, L., Gordon, J. I. Diet-Induced Obesity Is Linked to Marked but Reversible Alterations in the Mouse Distal Gut Microbiome. Cell Host & Microbe. 3 (4), 213-223 (2008).
- Singh, R. K., et al. Influence of diet on the gut microbiome and implications for human health. Journal of Translational Medicine. 15 (1), 73(2017).
- Müller, V. M., et al. Gut barrier impairment by high-fat diet in mice depends on housing conditions. Molecular Nutrition & Food Research. 60 (4), 897-908 (2016).
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