Qui, forniamo un metodo per analizzare il comportamento degli assoni in crescita in matrici 3D, imitando il loro sviluppo naturale.
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Articolo metodologico
Generazione di idrogel 3D basati su collagene per analizzare la crescita e il comportamento assonali durante lo sviluppo del sistema nervoso
In questo articolo
Sommario
Abstract
Questo protocollo utilizza collagene di tipo naturale I per generare idrogel tridimensionale (3D) per il monitoraggio e l'analisi della crescita assonale. Il protocollo è incentrato sulla coltura di piccoli pezzi di cervelli embrionali o postnatali di roditori all'interno di un idrogel 3D formato dal tipo iderivato derivato dal tendine della coda di ratto con porosità specifica. I pezzi di tessuto sono coltivati all'interno dell'idrogel e confrontati con specifici frammenti cerebrali o aggregati cellulari geneticamente modificati per produrre e secernere molecole adatte per creare un gradiente all'interno della matrice porosa. I passaggi di questo protocollo sono semplici e riproducibili, ma includono passaggi critici da considerare attentamente durante il suo sviluppo. Inoltre, il comportamento degli assoni in crescita può essere monitorato e analizzato direttamente utilizzando un microscopio a contrasto di fase o un microscopio a fluorescenza mono/multifotonico dopo la fissazione mediante metodi immunocitochimici.
Introduzione
Gli assoni neuronali, che terminano con coni di crescita assonale, migrano lunghe distanze attraverso la matrice extracellulare (ECM) dell'embrione su percorsi specifici per raggiungere i loro obiettivi appropriati. Il cono di crescita è la porzione distale dell'assone ed è specializzato per percepire l'ambiente fisico e molecolare della cellula1,2. Da un punto di vista molecolare, i coni di crescita sono guidati da almeno quattro diversi meccanismi molecolari: attrazione del contatto, chemioattrazione, repulsione del contatto e chemorepulsione innescata da diversi segnali di guida assonali3<....
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Protocollo
Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati effettuati secondo le linee guida e i protocolli del Comitato Etico per la sperimentazione animale (CEEA) dell'Università di Barcellona, e il protocollo per l'uso dei roditori in questo studio è stato rivisto e approvato dalla CEEA del Università di Barcellona (approvazione CEEA #276/16 e 141/15).
1. Purificazione del collagene coda di ratto
- Raccogli le code di ratto Sprague-Dawley adulti (8-9 settimane) dopo aver sacrificato l'animale seguendo le linee guida etiche e risciacqualo nel 95% di etanolo. Mettere 2-4 code sul ghiaccio (4 gradi centigradi) e tenerle coperte di ghiaccio dura....
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Risultati
Qui, presentiamo una metodologia ampiamente accessibile per studiare la crescita assonale nelle colture di collagene idrogel 3D del sistema nervoso murino embrionale. A tal fine, abbiamo isolato il collagene dalle code di ratto adulto per generare matrici 3D in cui abbiamo coltivato aggregati cellulari geneticamente modificati che esprimevano Netrin-1 o Sema3E di fronte al tessuto neuronale embrionale (ad esempio, ca regione dell'ippocampo). Questi aggregati cellulari formavano un gradiente distribuito radialmente della .......
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Discussione
La crescita degli assoni in via di sviluppo è principalmente invasiva e comprende la degradazione e il rimodellamento dell'ECM. Utilizzando la procedura qui presentata, i ricercatori possono ottenere una matrice omogenea 3D formata dal collagene di tipo naturale I in cui gli assoni (o le cellule) possono rispondere a un gradiente chimico secreto da cellule geneticamente modificate come fanno in vivo. Diverse risposte assonali a gradienti di segnali attraenti o inibitori (proteine, lipidi, ecc.) possono essere facilmente .......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Gli autori ringraziano Tom Yohannan per la consulenza editoriale e M. Segura-Feliu per l'assistenza tecnica. Questo lavoro è stato finanziato dal programma CERCA e dalla Commissione per le Università e la Ricerca del Dipartimento di Innovazione, Università ed Impresa della Generalitat de Catalunya (SGR2017-648). Questo lavoro è stato finanziato dal Ministero spagnolo della ricerca, dell'innovazione e dell'Università (MEICO) attraverso BFU2015-67777-R e rti2018-099773-B-100, la rete prione spagnola (Prionet Spagna AGL2017-90665-REDT), e l'Istituto Carlos III, CIBERNED ( PRY-2018-2).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Materiale | |||
| 3,3′-Diaminobenzidina tetracloridrato 10 mg compresse (DAB) | Sigma | D5905 | |
| Adult Sprague-Dawley ratti (da 8 a 9 settimane) | Criffa-Credo, Lione, Francia | ||
| Complesso avidina-biotina-perossidasi (ABC) | Vector Labs | PK-4000 | |
| B27 integratore senza siero 50x | Invitrogen | 17504-044 | |
| Kit per il dosaggio delle proteine dell'acido bicinconninico (BCA) | Pierce | 23225 | |
| vettori di plasmidi cDNA Linee | |||
| cellulari COS1 | ATTC | CRL-1570 | |
| D-(+)-glucosio | Sigma | 16325 | |
| D-(+)-glucosio (soluzione al 45% in acqua) per il terreno neurobasale completo | Sigma | G8769 | |
| D-MEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium 1x ) per terreno di coltura COS1 | Invitrogen | 41966-029 | |
| Dulbecco' soluzione salina tamponata con fosfato 10x (senza Ca2+ e Mg2++) (D-PBS) per colture | Invitrogen | 14200 | |
| Etanolo | merck | 108543 | |
| Acido etilendiamminotetraacetico sale disodico diidrato (EDTA) | Sigma | E5134 | |
| Mezzi di montaggio a fluorescenza (ad esempio, Fluoromount-G o simili) | Scienze della microscopia elettronica (EMS) | 17984-25 | |
| Gelatina in polvere | Sigma | G1890 | |
| Acido acetico glaciale (Panreac, cat. n. 211008) | Panreac | 211008 | |
| Hank' s soluzione salina bilanciata | Invitrogen | 24020083 | |
| Siero bovino fetale inattivato termicamente | Invitrogen | 10108-165 | |
| Siero di cavallo inattivato a caldo | Invitrogen | 26050-088 | |
| Perossido di idrogeno (H2O2, dal 32 al 33% in acqua) | Sigma | 316989 | |
| Soluzione di L-glutammina 200 mM (100x) per un mezzo neurobasale completo e COS1 | Invitrogen | 25030-024 | |
| Lipofectamina 2000 Reagente | Invitrogen | 11668-019 | |
| Topi femmina incinta (giorno embrionale da 12,5 a 16,5; E12.5-16.5) | Criffa-Credo, Lione, Francia | ||
| Modified Minimum Essential Medium Eagle (MEM) | Invitrogen | 11012-044 | |
| Anticorpo monoclonale contro la classe III β-tubulina (clone TUJ-1) | Biolegend | 801201 | |
| N-2 integratore 100x | Invitrogen | 17502-048 | |
| Terreno neurobasale | Invitrogen | 21103049 | |
| Paraformaldeide | Merck | 1.040.051.000 | |
| Soluzione di penicillina/streptomicina 100x | Invitrogen | 15140-22 | |
| Soluzione salina tamponata con fosfato 10x (PBS) per immunocitochimica | Invitrogen | AM9624 | |
| Anticorpo secondario: anti-topo di cavallo biotinilato | Vector Labs | BA-2000 | |
| Terreno senza siero (Opti-MEM) | Invitrogen | 11058-021 | |
| Sodio azide | Panreac | 162712 | |
| Soluzione di bicarbonato di sodio 7,5% | Invitrogen | 25080-094 | |
| Coltura sterile grado H2O | Sigma | W3500 | |
| TritonTM X-100 | Base Sigma | X100 | |
| Trizma | Sigma | T1503 | |
| Tripsina-EDTA (Tripsina (0,05% (peso / vol) con EDTA (1x) | Invitrogen | 25300-054 < | |
| strong>Equipment< / strong> | |||
| 1 forbici curve grandi e 1 piccola per dissezione... | Strumenti di precisione Strumenti o simili | ||
| provette da centrifuga coniche da 1,5 mL | Eppendorf o simili | ||
| da 15 mL | Corning o simili | ||
| 2 emostatici | Strumenti di precisione Strumenti o simili | ||
| 2 piccole forbici da dissezione diritte | Strumenti di precisione Strumenti o simili | ||
| Provette da centrifuga da 200 ml per centrifugazione | Nalgene o simili | ||
| Palloni | |||
| vetro | |||
| Piastre di coltura a 4 e 6 pozzetti | Nunc | 176740 e 140675 | |
| Pompe per pipette automatiche e pipette in plastica sterili monouso da 10 mL e 25 mL contenenti filtro. | Gilson, Brand, Eppendorf o simili | ||
| Pipette automatiche, puntali con filtro sterile e puntali sterili attuali. | Gilson, Eppendorf o similare | ||
| Microcentrifuga da banco con rotore fisso ad angolo | Eppendorf, Beckman Coulter o simile | ||
| Centrifuga refrigerata da banco con rotore a secchiello oscillante (con adattatori per provette da 1,5, 15 e 50 mL) | Eppendorf, Beckman Coulter o simile | ||
| Incubatore per colture cellulari a 37 ° C, 5% CO2 e 95% aria | |||
| Membrana in cellulosa | Sigma | D9402 | |
| Chiusure per tubi per dialisi... | Sigma | Z37101-7 | |
| Pipette in vetro monouso Microscopio | |||
| da dissezione con ottica a campo scuro | Olympus SZ51 o simile | ||
| Centrifuga refrigerata ad alta velocità Beckman Coulter o similare con rotore | |||
| Cappa | |||
| Grande 100 mm, 60 mm e piccola 35 mm Ø piastre per colture cellulari | Nunc | 150679 , 150288 e 150318, rispettivamente | |
| Agitatore magnetico e barre di rotazione magnetiche | IKA o simile | ||
| Tritatessuti McIlwain | Mickle Laboratory Engineering | ||
| Un paio di pinze dritte fini e un paio di pinze curve | Strumenti fini Strumenti o simili | ||
| Lame di rasoio per il tritatessuti | |||
| Bisturi (numero 15 e 11) | |||
| Due paia di spatole sottili per trasferire pezzi di collagene e tessuto | Strumenti fini Strumenti o simili |
Riferimenti
- Ramón y Cajal, S. Les nouvelles idées sur la structure du système nerveux chez l'homme et chez les vertébrés. , (1894).
- Ramón y Cajal, S. Nuevo concepto de la histología de los centros nerviosos. , (1893).
- Marin, O., Valiente, M., Ge, X., Ts....
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Ristampe e permessi
