Registrazione dell'elettroretinogramma in Zebrafish larvale con elettrodo di spugna-punta conica A romanzo

Sommario

Qui, presentiamo un protocollo che semplifica la misurazione della luce dell'elettroretinogramma evocato le risposte dallo zebrafish larvale. Un elettrodo di romanzo spugna a forma di cono-Punta può contribuire a rendere lo studio di sviluppo visivo in zebrafish larvale utilizzando l'elettroretinogramma ERG più facile raggiungere con risultati attendibili e costi inferiori.

Abstract

Il danio zebrato (Danio rerio) è comunemente usato come un modello di vertebrati in studi evolutivi ed è particolarmente adatto per le neuroscienze visual. Per misure funzionali di prestazioni visive, l'elettroretinografia (ERG) è un metodo non invasivo ideale, che è stato affermato in specie di vertebrati superiori. Questo approccio è sempre più utilizzato per l'esame della funzione visiva in zebrafish, inclusi durante le prime fasi dello sviluppo larvale. Tuttavia, l'elettrodo di registrazione più comunemente usati per zebrafish larvale ERG fino ad oggi è l'elettrodo di una micropipetta di vetro, che richiede attrezzature specializzate per la sua fabbricazione, che presenta una sfida per i laboratori con risorse limitate. Qui, presentiamo un protocollo ERG larvale zebrafish utilizzando un elettrodo di spugna-punta a forma di cono. Il romanzo dell'elettrodo è più facile fabbricazione e maniglia, più economico e meno probabilità di danneggiare l'occhio larvale rispetto la micropipetta di vetro. Come metodi ERG precedentemente pubblicati, l'attuale protocollo è in grado di valutare la funzione retinica esterna attraverso dei fotorecettori e risposte delle cellule bipolari, l'a - e b-onda, rispettivamente. Il protocollo può illustrare chiaramente la raffinatezza della funzione visiva in tutto lo sviluppo iniziale delle larve di zebrafish, sostenendo l'utilità, la sensibilità e l'affidabilità dell'elettrodo romanzo. L'elettrodo semplificata è particolarmente utile quando organismo di modello che istituisce un nuovo sistema ERG o modifica esistente apparato ERG di piccoli animali per la misura di zebrafish, aiutando i ricercatori nelle neuroscienze visual utilizzare zebrafish.

Introduzione

Il danio zebrato (Danio rerio) è diventato un ampiamente usato modello genetico di vertebrati, compreso gli studi di neuroscienze visual. La crescente popolarità di questa specie può essere attribuita ai vantaggi tra cui la facilità di manipolazione genetica, il sistema visual vertebrati altamente conservato (tipi di neurone, morfologia anatomica e organizzazione e genetica sottostante), alta fecondità e ridurre il costo di allevamento rispetto a modelli mammiferi¹. Non invasivo elettroretinogramma (ERG) lungo è stato utilizzato clinicamente per valutare la funzione visiva umana e in ambito di laboratorio per quantificare la visione in una gamma di specie piccole e grandi, tra cui roditori e larvale zebrafish^{2,3 , 4 , 5}. i componenti ERG più comunemente analizzati sono la a onda e b-fluttua, proveniente dalla luce-sensing fotorecettori e bipolare interneuroni, rispettivamente. In zebrafish larvale, strati distinti nella retina sono stabiliti dalla post-fecondazione 3 giorni (dpf) e la morfologia del cono fotorecettore terminale sinapsi maturo prima 4 dpf^6,7. Funzione esterna della retina di zebrafish larvale è così stabilita prima 4 dpf, significato che l'ERG è misurabile da questa tenera età in poi. A causa del breve ciclo sperimentale e le proprietà di alto-rendimento del modello, l'ERG è stato applicato a larvale zebrafish per valutazione funzionale dei modelli di malattia, analizzando lo sviluppo di colore, visione e retinico, studiando i ritmi circadiani visual e test farmaci^8,9,10,11,12.

Tuttavia, approcci attuali per zebrafish larvale ERG ha alcune complessità che possono rendere più difficile ad adottare. Zebrafish larvale pubblicate ERG protocolli comunemente utilizzano una micropipetta di vetro riempita con liquido conduttivo come la registrazione dell'elettrodo^3,4,5,13, che richiede una micropipetta di alta qualità Suggerimento³. Attrezzature specializzate, come ad esempio un estrattore micropipetta e in alcuni casi una microforge, sono necessari per la loro fabbricazione. Questo può essere una sfida per i laboratori con risorse limitate e conduce a un costo aggiuntivo anche quando adattamento disponibili sistemi per ERG piccoli animali per la misurazione della funzione visiva zebrafish larvale. Anche quando levigata, la punta della micropipetta taglienti possa danneggiare la superficie dell'occhio larvale. Inoltre, i titolari delle imprese micropipetta per elettrofisiologia sono costruiti con un filo d'argento fisso. Questi fissi fili diventano passivati dopo uso ripetitivo, che richiede l'acquisto di nuovi supporti di costi di manutenzione maggiore.

Qui descriviamo un metodo ERG utilizzando un elettrodo di registrazione di spugna-punta a forma di cono, che è particolarmente utile per l'adeguamento stabilito piccoli animali ERG configurazioni per le misurazioni di ERG di zebrafish larvale. L'elettrodo è fatta facilmente utilizzando comune spugna di acetato di polivinile (PVA) e filo di argento fine senza qualsiasi altre attrezzature specializzate. I nostri dati indicano che questo romanzo elettrodo è sensibile e affidabile abbastanza per dimostrare lo sviluppo funzionale dei circuiti neurali retinici in zebrafish larvale tra 4 e 7 dpf. Questo elettrodo economico e pratico spugna-suggerimento può essere utile ai ricercatori che istituisce nuovi sistemi di ERG o la modifica di sistemi esistenti di piccoli animali, per gli studi di zebrafish.

Protocollo

Tutte le procedure di elettroretinogramma (ERG) sono state eseguite secondo le disposizioni del codice Australian National Health and Medical Research Council di pratica per la cura e l'uso di animali e sono state approvate dal comitato di etica animale istituzionale presso il Università di Melbourne.

1. preparazione buffer

1. Preparare il tampone pesce rosso Ringer 10x (1,25 M di NaCl, KCl di 26 mM, 25 mm CaCl₂, 10mm MgCl₂, glucosio di 100 mM, 100 mM HEPES) utilizzando acqua ad osmosi inversa (RO). Regolare il tampone a pH 7,8 e sterilizzare il buffer utilizzando il filtro di 0,22 μm. Memorizzare il buffer 10x a 4 ° C come la soluzione stock³.
   Nota: Il tampone Ringer 10x deve essere utilizzato entro 3 mesi.
2. Il giorno dell'esperimento, fanno di goldfish Ringer 1x diluendo il 10x buffer di goldfish Ringer utilizzando acqua ad osmosi inversa.
   Nota: 1x buffer di goldfish Ringer è utilizzato per saturare la spugna PVA, tra cui la spugna usata per il posizionamento di zebrafish larvale e la spugna sulla punta dell'elettrodo di registrazione.

2. elettrodo preparazione

1. Preparare l'elettrodo di registrazione di spugna a forma di cono.
   1. Tagliare l'estremità maschio dall'estensione di piombo per l'elettrodo di platino e rimuovere dall'estremità 10 mm del rivestimento di isolamento esterno politetrafluoroetilene usando un bisturi. Fare attenzione a non per danneggiare il filo interno del cavo dell'elettrodo.
   2. Tagli una lunghezza di 40 mm di filo d'argento (0,3 mm di diametro) e questo fissare saldamente al cavo elettrodo di intrecciando il filo d'argento con il filo interno esposto. Racchiudere il giunto con nastro isolante, lasciando una lunghezza di ~ 15 mm di filo d'argento esposto (Figura 1A).
   3. Placcare il filo d'argento esposto con cloruro utilizzando un'origine V DC 9 per 60 s per migliorare la conduzione del segnale. Immergere la punta d'argento esposta in salino normale e collegare l'altra estremità al terminale positivo della batteria. Collegare un altro cavo al terminale negativo della batteria e immergere l'altra estremità del filo nei Salina².
      Nota: In alternativa, cloro il filo d'argento ad immersione per 1 ora in una soluzione di candeggina (ipoclorito di sodio di ingrediente attivo 42 g/L).
   4. Tagliare un quadrato di PVA ~ 20 x 20 mm spugna usando le forbici per fare un cono (Figura 1A). Saturare la spugna utilizzando 1x buffer di Ringer. Sotto un microscopio con una barra di scala sull'oculare, è necessario utilizzare un bisturi per modellare l'apice del cono a ~ 40 µm di diametro. Asciugare all'aria la spugna a forma di cono sul tessuto di carta assorbente fino a quando non è solido.
      Nota: La spugna PVA si espande in modo significativo quando satura, quindi è importante che la spugna prima è saturo con soluzione fisiologica prima modellatura all'apice del cono.
   5. Dopo chloriding, asciugare all'aria il filo d'argento su un panno assorbente per 5 min, Inserisci il filo d'argento in spugna di PVA secco, solida, a forma di cono attraverso la base del cono. Isolare qualsiasi metallo esposto in eccesso utilizzando nastro maschera per ridurre gli artefatti di fotovoltaici (Figura 1B-C).
      Nota: Dopo ogni sessione sperimentale, togliere la spugna del filo d'argento. Lavare la spugna utilizzando acqua ad osmosi inversa e lasciare asciugare all'aria per il riutilizzo. Per garantire la raccolta di segnale ottimale, è consigliabile monouso di filo d'argento. Spugne PVA non dovrebbero essere riutilizzati più di 5 volte.
   6. Il giorno dell'esperimento, immergere la spugna-punta dell'elettrodo registrazione 1x buffer di Ringer per almeno 15 min saturare completamente la spugna.
2. Preparare gli elettrodi di riferimento come descritto sopra, ma senza allegare la punta di spugna.
3. Ottenere l'elettrodo di terra commercialmente.

3. Zebrafish preparazione

1. Scuro adattare larve di zebrafish durante la notte (> 8 h) prima di registrazioni inserendo zebrafish in una provetta da 15 mL (< 20 larve per tubo) avvolto in carta stagnola in un incubatore scuro. Togliere il coperchio per assicurare un'adeguata ossigenazione.
2. Il giorno della registrazione, stringere il coperchio per il tubo di falcon cartoccio contenente larve e assicurarsi che il tubo sia a prova di luce. Larve di trasporto al laboratorio di ERG.
3. Versare il pesce nei piatti Petri nel buio con l'aiuto di illuminazione dim rosso da un diodo a emissione luminosa (LED; 17,4 cd.m^-2, λ_max 600 nm). Coprire di Petri utilizzando gli asciugamani a prova di luce per ridurre al minimo l'esposizione alla luce.

4. spugna piattaforma preparazione

1. Tagliare un rettangolo di spugna PVA asciutta per adattarsi comodamente in una capsula di Petri da 35 mm. Assicurarsi che lo spessore della spugna dovrebbe essere all'incirca uguale alla profondità del piatto petri.
2. Fare un piccolo taglio in verticale attraverso un'estremità della spugna per accogliere il filo d'argento dell'elettrodo di riferimento.
3. Immergere la spugna PVA in 1x tampone di goldfish Ringer fino alla saturazione. Quindi, posizionare la spugna in una capsula Petri pulito 35 mm. Utilizzare un tovagliolo di carta per assorbire il liquido supplementare fino a quando nessuna soluzione trasuda dalla spugna in risposta ad una pressa di luce dito.

5. animali e posizionamento elettrodi

1. Anestetizzare le larve utilizzando tricaina 0,02%, diluito in tampone di goldfish Ringer 1x.
2. Utilizzare una pipetta Pasteur da 3 mL per trasferire una larva anestetizzata in un quadratino di carta assorbente (~ 3 cm²).
3. Posizionare il tovagliolo di carta contenente la larva sulla piattaforma spugna umida usando il forcipe. Utilizzare un pennello fine imbevuto nel buffer di Ringer per regolare la posizione della larva. Garantire che un occhio rivolta verso l'alto, isolato da qualsiasi liquido vicina sulla Piazza del tovagliolo di carta sotto la larva.
4. Smalto del corpo larvale, escludendo la testa, con eye gel per mantenere la larva umido durante la registrazione di ERG idratante.
5. Posizionare la capsula di Petri con piattaforma di spugna su una piccola piattaforma di acqua riscaldata fronte il Ganzfeld ciotola stimolo luminoso situato all'interno di una gabbia di Faraday (Figura 1).
   Nota: Mantenimento della temperatura del corpo larvale e la spugna garantisce segnale stabile di ERG.
6. Inserire l'elettrodo di riferimento il taglio effettuato nella spugna piattaforma (Figura 1).
7. Collegare l'elettrodo di terra commercialmente ottenuti per la gabbia di Faraday.
8. Collegare l'elettrodo di registrazione ad un titolare di elettrodo e fissare il supporto al braccio stereotassica di un micromanipolatore (Figura 1). Utilizzare una pipetta Pasteur da 3 mL per gocciolare una goccia di soluzione di Ringer sulla punta dell'elettrodo per ri-saturazione spugna 1x.
9. Posizionare il microscopio nella gabbia di Faraday sopra la piattaforma ERG per il posizionamento dell'elettrodo.
   Nota: Illuminazione dovrebbe essere fornita da un LED rosso dim (17,4 cd.m^-2, λ_max 600 nm) per permettere l'osservazione della larva e il posizionamento dell'elettrodo attivo, pur mantenendo dark-adaptation.
10. Regolare la posizione della piattaforma spugna per permettere l'osservazione della larva sotto il microscopio. Quindi, utilizzare tessuto assorbente per rimuovere il liquido in eccesso dalla punta di spugna dell'elettrodo.
11. Posizionare l'elettrodo attivo unirla delicatamente la superficie corneale centrale dell'occhio zebrafish larvale (Figura 1E).
12. Spostare la ciotola Ganzfeld verso la piattaforma di spugna e assicurarsi che la larva è coperto dalla ciotola.
13. Chiudere la gabbia di Faraday per ridurre rumore elettromagnetico estraneo.

6. elettroretinogramma registrazione

1. Utilizzare il software per computer del particolare sistema ERG (per dettagli, vedere tabella materiali) per innescare lo stimolo e acquisire dati basato sulle impostazioni consigliate sotto².
   1. Impostare la frequenza di campionamento del sistema a 4 KHz sopra un ms 650 registrazione finestra (2.560 punti) del software di acquisizione.
   2. Impostare il guadagno del sistema a 1.000 ×.
   3. Impostare il filtro passa-banda del sistema a 1-300 Hz.
   4. Utilizzare un filtro notch per ridurre 60 Hz (o 50 Hz, a seconda della frequenza della rete locale) rumore.
      Nota: Il livello di rumore ideale non dovrebbe essere più di ± 10 µV.
2. Inizio raccolta dati utilizzando la procedura descritta di seguito.
   1. Utilizzare un singolo flash di prova (0.06 registro cd.s/m²) per misurare una risposta di prova dall'occhio per valutare il posizionamento degli elettrodi.
      Nota: Questa intensità del lampo di prova dovrebbe provocare un b-fluttua l'ampiezza maggiore di 25 µV a 4-dpf larve. Se una risposta forte non può essere misurata, quindi riposizionare gli elettrodi e fare un altro test flash per confermare che gli elettrodi siano ben posizionati.
   2. Dopo il lampo di prova, permettere all'animale di buio adattare per 3 min in completa oscurità prima di registrazioni.
   3. Presente lampeggia da dimmer a intensità di luce più luminosa.
   4. Media segnali attraverso ripetizioni in base al livello di segnale-rumore.
      Nota: In generale, media più segnali a livello luce dimmer (non meno di 3 ripetizioni) e meno presso i livelli di luce più luminosi (solitamente 1 ripetizione). Allungare gradualmente l'intervallo Inter-stimolo da 10 a 60 s dal livello di luce più debole alla più chiara. Un protocollo di esempio è illustrato nella tabella 1.
   5. Dopo le registrazioni, umanamente uccidere larve utilizzando tricaina 0,1%.

7. analisi

1. Misurare l'ampiezza di un onda dal basale alla depressione a onda negativa e b-fluttua l'ampiezza dal trogolo di un onda negativo per il picco di b-onda positiva.
2. Misurare i tempi di implicita di a - e b-fluttua dall'inizio di stimolo per la depressione a-onda e il picco dell'onda-b, rispettivamente.

Risultati

Questa sezione fornisce risultati rappresentativi per ERG misurazioni effettuate ogni giorno da 4 a 7 dpf. Da 4 dpf, ERG risposte mostrano robusti componenti di onde a e b, che derivano da fotorecettori e cellule bipolari, rispettivamente. A ogni età testati, l'ampiezza delle onde b aumentato con intensità della luce (Figura 2; Figura 3). In particolare, la sensibilità della retina larvale zebrafish per dimmer lampi aumentato con l'età. L'a -...

Discussione

Letture di funzionali quali l'ERG sono diventati sempre più importanti in una suite di strumenti utilizzati per lo studio di zebrafish larvale^8,9,12,14. A causa delle piccole dimensioni dell'occhio larvale zebrafish, micropipette di vetro sono state adattate come elettrodi di registrazione pubblicato più protocolli^3,4,

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
0,22 µ m filter	Millex GP	SLGP033RS	Filtra il tampone 10× goldfish ringer per sterilizzazione
Siringa da 1 mL	Terumo	DVR-5175	Con un 30G × ½ " ago per aggiungere gocce di soluzione fisiologica alla punta della spugna dell'elettrodo per evitare l'essiccazione e l'aumento del rumore nei segnali ERG.
30 G &volte; ½ " ago	Terumo	NN*3013R	Per l'aggiunta di soluzione fisiologica all'elettrodo della punta.
Bioamplificatore	ADInstruments	ML135	Per amplificare i segnali ERG.
Soluzione di candeggina	King White	9333441000973	Per un metodo alternativo di clorazione con elettrodo a nastro. Principio attivo: 42 g/L di ipoclorito di sodio.
Bagnomaria a circolazione	Lauda-Ko?nigshoffen	MGW Lauda	Utilizzato per realizzare la piattaforma riscaldata ad acqua.
Elettrodo	Grass Telefactor	F-E2-30	Cavi in platino per il collegamento di elettrodi a filo d'argento all'amplificatore.
gabbia di Faraday	International		Per mantenere l'adattamento al buio e racchiudere la configurazione Ganzfeld per migliorare il rapporto segnale/rumore.
Ganzfeld Bowl	Photometric Solution International		Stimolatore di luce progettato su misura: diametro 36 mm, apertura 13 cm.
Luxeon LED	Phillips Light Co.		Per la stimolazione della luce venti LED da 5W e uno da 1W.
Micromanipolatore	Harvard Apparatus	BS4 50-2625	Tiene l'elettrodo di registrazione durante gli esperimenti.
Microsoft Office Excel	Microsoft	versione 2010	Software per fogli di calcolo per l'analisi dei dati.
Gel idratante per gli occhi	GenTeal Gel	9319099315560	Utilizzato per coprire le larve di pesce zebra durante le registrazioni per evitare la disidratazione. Principio attivo: 0,3 % ipromellosa e 0,22 % carbomer 980.
Pipetta Pasteur	Copan	200C	Utilizzata per trasferire con cura le larve di pesce zebra.
Sistema di acquisizione dati Powerlab	ADInstruments	ML785	Controlla i LED per generare stimoli.
Spugna PVA	MeiCheLe	R-1675	Per il posizionamento di larve di pesce zebra e la realizzazione dell'elettrodo a forma di cono ti
Soluzione salina	Aaxis Pacific	13317002	Per la galvanica dell'elettrodo a filo d'argento.
Scope Software	ADInstruments	versione 3.7.6	Attiva simultaneamente lo stimolo attraverso il sistema Powerlab e raccoglie i dati
Argento (filo rotondo sottile)	A& E metallo	0,3 mm	Utilizzato per realizzare elettrodi ERG di registrazione e di riferimento.
Stereomicroscopio	Leica	M80	Utilizzato per modellare e misurare l'apice della spugna a forma di cono (con barra graduata sull'oculare). Posizionato nella gabbia di Faraday per il posizionamento degli elettrodi.
Tricaina	Sigma-aldrich	E10521-50G	Per l'aneetizzazione delle larve di pesce zebra.
Piattaforma riscaldata ad acqua	su		Per il mantenimento della temperatura della piattaforma in spugna e del corpo larvale durante le registrazioni ERG