Acquisizione di piccola molecola comunicazione tra tessuti e cellule mediante spettrometria di massa di Imaging

Sommario

Un nuovo metodo di preparazione del campione è stato sviluppato per ospitare coculture delle cellule e del tessuto per rilevare cambio piccola molecola usando la spettrometria totale imaging.

Abstract

Spettrometria di massa (IMS) di imaging ordinariamente è stato applicato a tre tipi di campioni: sezioni di tessuto, sferoidi e le colonie microbiche. Questi tipi di campioni sono stati analizzati mediante spettrometria di massa tempo-di-volo del desorbimento/ionizzazione laser assistito da matrice (MALDI-TOF MS) per visualizzare la distribuzione di proteine, lipidi e metaboliti attraverso il campione biologico di interesse. Abbiamo sviluppato un metodo di preparazione del campione romanzo che unisce i punti di forza delle tre applicazioni precedenti per affrontare un approccio underexplored per l'identificazione di comunicazione chimica nel cancro, tramite la semina di colture di cellule di mammifero in agarosio in coculture con tessuti sani seguiti da essiccazione del campione. Cellule e tessuti di mammiferi sono cocultured nelle immediate vicinanze permettendo la comunicazione chimica tramite diffusione tra i tessuti e le cellule. Intervalli di tempo specifici, il campione basato su agarosio è asciugato nello stesso modo come colonie microbiche preparato per l'analisi IMS. Il nostro metodo è stato sviluppato per la comunicazione tra cancro ovarico sieroso di alta qualità derivata dal tubo fallopian come interagisce con l'ovaia durante metastasi di modello. Ottimizzazione della preparazione del campione ha portato alla identificazione di noradrenalina come componente chimico chiave nel microambiente ovarico. Questo metodo di recente sviluppato può essere applicato ad altri sistemi biologici che richiedono una comprensione della comunicazione chimica tra celle adiacenti o tessuti.

Introduzione

Spettrometria di massa (IMS) di imaging è stato ottimizzato per caratterizzare la distribuzione spaziale delle caratteristiche molecolari in tre applicazioni ampiamente usate: fettine di tessuto, sferoidi e colonie microbiche^1,2,3. Fettine di tessuto possono essere utilizzati per valutare la localizzazione di metaboliti nel contesto di condizioni biologiche in un host, mirati o ciechi in uno specifico intervallo di massa. Tuttavia, le differenze tra le caratteristiche molecolari sono il più significativo ed evidente quando un tessuto sano è rispetto a una condizione di malato, ad esempio, un tumore. Questo approccio IMS è particolarmente adatto alla rilevazione di biomarcatori di malattia, tuttavia, l'acquisizione di campioni di tessuto alle fasi discrete in progressione di malattia (ad esempio, classi di tumore) esclude l'identificazione dei segnali che potrebbero essere importanti per l'inizio della malattia. Lo scambio di informazioni attraverso lo spazio è una caratteristica onnipresente di molti sistemi biologici, e fettine di tessuto non possono catturare questo relè chimico dinamico. Una tecnica che è in grado di visualizzare la diffusione e lo scambio chimico è IMS di colonie microbiche coltivate su piastre di agar; piccole molecole sono in grado di diffondere attraverso e l'agar e possono essere acquisiti tramite spettrometria di massa di matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI-TOF)⁴. Questa configurazione di crescita può essere utilizzata per identificare le molecole scambiati tra entità biologiche discrete (colonie) e può anche determinare la direzionalità della produzione del metabolita. La piattaforma progettata originariamente per la crescita di colonie microbiche è stata adattata per esplorare il metabolismo primario degli espianti di tessuto coltivato con cellule di mammifero e IMS è stato usato per valutare lo scambio chimico dinamico in un sistema di mammiferi in vitro.

Negli ultimi anni, è diventato chiaro che il cancro ovarico sieroso di alto grado (HGSOC) spesso ha origine nell'epitelio del tubo fallopian (FTE) e quindi si riproduce per metastasi all'ovaia durante malattia precoce sviluppo^{5,6, 7 , 8}. il motivo che FTE tumorigeniche cellule diffusione all'ovaia, dove grandi tumori alla fine formano e riprodurrsi per metastasi ulteriormente, è attualmente poco chiaro. Precedenti ricerche si sono concentrate sul ruolo delle proteine ovariche nella metastasi primaria all'ovaia; Tuttavia, recentemente è stato dimostrato che la transizione da un sano ad un tessuto cancerogeno provoca enorme perturbazione del metabolismo cellulare e altera la produzione di piccole molecole^9,10,11. Di conseguenza, abbiamo supposto che piccole molecole scambiati tra il FTE e l'ovaia possono essere parzialmente responsabile di metastasi primaria di HGSOC.

Utilizzando la nostra procedura IMS recente sviluppato, abbiamo determinato che coculture delle FTE tumorigeniche e tessuto ovarico sano induce la produzione di noradrenalina dall'ovaio. Tuttavia, in altri tipi cellulari o cellule normali FTE non hanno provocato questo effetto. Un beneficio straordinario di questo metodo è che la produzione molecolare e lo scambio di segnali che rappresentano molecole reali possono essere visualizzati, quindi anche in un coculture è possibile determinare l'origine di un segnale. Questo è un vantaggio sopra l'analisi dei campioni omogeneizzati, dove si perde tutte le informazioni spaziali. Nel nostro sistema modello, siamo stati in grado di assegnare chiaramente la produzione di noradrenalina all'ovaia. Noradrenalina è stata collegata alla metastasi e chemioresistenza dei cancri ovarici, e nostro rilevamento di questa molecola ha convalidato che il nuovo metodo IMS può scoprire molecole biologicamente rilevanti^{12,13, 14}. questa convalida ci permette di proporre che questa nuova applicazione di IMS può essere particolarmente utile per ricercare gruppi che tentano di identificare piccole molecole in ambienti coculture e per comprendere i primi eventi che influenzano la trasformazione delle cellule e la metastasi. L'obiettivo generale di questo metodo è quello di delucidare l'identità e la distribuzione spaziale di piccole molecole durante lo scambio tra tessuti e organi, rappresentati da in vitro colture cellulari 3D o ex vivo del tessuto.

Protocollo

Tutte le procedure di animali erano in conformità con gli istituti nazionali di salute orientamenti per la cura e l'uso di animali da laboratorio e approvato dal Comitato istituzionale animale uso e cura (IACUC) presso l'Università dell'Illinois a Chicago.

1. preparazione dei reagenti

1. Mantenere cellule di epitelio oviduttali murino (MOE) a 37° C con 5% di CO₂ in un incubatore alfa media minimo essenziale medio (αMEM) completati con 10% siero bovino fetale selenio (FBS), 2 mM L-Glutammina, 10mg/mL insulina, transferrina, (ITS) , 1,8 ng/mL fattore crescita epidermico (EGF), 100 U/mL di penicillina-streptomicina, la gentamicina 1mg/mL e 18,2 ng/mL estradiolo-17 β. Passare le cellule ogni 3 – 4 giorni, assicurando che non ci sono abbastanza cellule nello stesso giorno i topi saranno sacrificati.
2. Preparare agarosio al 2% con 1 g di agarosio basso punto di fusione con 50 mL di acqua distillata. Autoclave l'agarosio, lasciarlo raffreddare e poi aliquota (1 mL) in 2 mL provette (Vedi Tabella materiali) prima dell'agarosi si solidifica. Dell'agarosi possono essere memorizzati a-20 ° C a tempo indeterminato.
3. Preparare almeno 2 mL di media Medium (DMEM) dell'Aquila di 1 x Dulbecco per volta.
4. Per la matrice per MALDI-TOF MS, preparare 10 mL di 5 mg/mL 1:1 l'acido alfa-ciano-4-hyroxycinnamic (CHCA): acido diidrossibenzoico (DHB) (Vedi Tabella materiali) in 90: 10 ACN:H₂O + 0,1% acido trifluoroacetico (TFA). Sonicare soluzione fino a matrice è dissolto.

2. mouse Colony e rimozione dell'ovaio

1. Mantenere le coppie riproduttrici di topi CD-1 utilizzando le procedure di custodia standard. Vicino il giorno del parto, controllare i topi ogni giorno in modo che l'età dei cuccioli è nota.
2. Eutanasia cuccioli a 16 – 18 giorni di età per CO₂ inalazione secondo le linee guida NIH. Consegnare la CO₂ (100%) flusso di tasso del 10% – 20% volume al minuto della camera e continuare per due minuti dopo che aveva smesso di respirazione. Confermare l'eutanasia di dislocazione cervicale.
3. Disinfettare tutte le apparecchiature chirurgiche immergendo in etanolo al 70%. Caldo L-15 media di Leibovitz con 1x penicillina-streptomicina a 37 ° C.
4. Bagnare la superficie addominale con etanolo al 70% per disinfettare la zona e minimizzare la contaminazione con i capelli. Afferrare la pelle che copre la parete addominale utilizzando smussato forcipe e uso forbici chirurgiche per rendere una grande forma di V tagliata attraverso la pelle e la parete addominale, esponendo gli organi interni.
5. Spostare gli organi interni al lato usando il forcipe. Individualmente, afferrare ogni corno uterino con una pinzetta e sollevare leggermente.
6. Individuare l'ovario, che sarà alla fine del corno uterino, immediatamente di sotto del rene. Usare le forbici chirurgiche per sezionare l'ovario libero del tessuto connettivo. Quindi, tagliare il corno ovarico a metà.
7. Spostare l'ovaia, ovidotto e circa una metà di ogni corno uterino di media L-15 di Leibovitz pre-riscaldato.
8. Sotto un microscopio per dissezione muovere con cautela ogni ovaia da bursa circostante, liberandola dal ovidotto, bursa e qualsiasi tessuto adiposo. Spostare ogni ovaia un nuovo piatto di media L-15 di Leibovitz.
9. Tagliare ogni ovaia a metà assialmente. Tenere i pezzi ovarici (ora chiamati espianti) mantenuti a 37 ° C fino al fasciame di agarosio.

3. impostazione e incubando il vetrino ITO-trattati per Cocultures

1. Cocultures indivisa
   1. Fluidifica l'agarosio a 70 ° C su una piastra calda.
   2. Posizionare il divisore 8 pozzetti in cima il tinoxide di Indio (ITO)-trattato diapositiva (Figura 1A). Il fondo in gomma sul divisore aiuta nella adesione alla diapositiva, ma assicurarsi di applicare continuo leggera pressione verso il basso durante la placcatura dell'agarosi per garantire nessuna colatura o miscelazione tra pozzetti.
   3. Raccogliere le cellule in una provetta conica da 15 mL, centrifugare (5 min a 800 giri/min) e risospendere a 50K cellule per 150 µ l 1 x DMEM media. Se una cella diversa densità è ottima, assicurarsi che in questa fase la sospensione cellulare è 2x la densità finale desiderata (ad esempio, per una concentrazione finale di 50.000 cellule a 300 µ l, densità delle cellule in questa fase è 50.000 cellule in 150 µ l).
   4. Prima coltura cellulare di placcatura, aggiungere explant ovarico al centro del pozzo (Figura 1B).
   5. Aggiungere dell'agarosi per ogni coltura cellulare in provette individuali 2 mL appena prima di placcatura. Per ciascun pozzetto, combinare 200 µ l di sospensione cellulare e 200 µ l di agarosio liquefatto in una provetta da 2 mL. Ad esempio, per quattro pozzi, combinare 800 µ l di sospensione cellulare e 800 µ l di agarosio al 2%. Qualche miscela sarà lasciato, ma che rende un po' più del necessario evita bolle d'aria durante il pipettaggio.
      1. Aggiungere dell'agarosi per colture cellulari individuali immediatamente prima di tale coltura cellulare di placcatura. L'agarosio sarà freddo in meno di un minuto, quindi preparatevi a piastra rapidamente.
   6. Immediatamente aggiungere 300 µ l di miscela delle cellule/agarosio in ciascun pozzetto (Figura 1). Figura 1 Mostra tre condizioni di cella e condizione uno dei media, che ognuno placcato con e senza un ovaio.
   7. Incubare il vetrino a 37 ° C e 5% di CO₂ in un incubatore.
2. Cocultures diviso.
   1. Tagliare i divisori in plastica sottile, liscia (Figura 2A).
      Nota: Questo esperimento utilizza i lati di un bacino di terreno sterile usa e getta, perché sono piatte e sottili. Tagliarli appena sufficientemente ampia per adattarsi comodamente l'ipotenusa del pozzo (~ 13 mm).
   2. Fluidifica l'agarosio a 70 ° C su una piastra calda.
   3. Posizionare il divisore 8 pozzetti in cima alla diapositiva di ITO-trattati (Figura 2B). Il fondo in gomma sul divisore aiuta nella adesione alla diapositiva, ma assicurarsi di applicare continuo leggera pressione verso il basso durante la placcatura dell'agarosi per garantire nessuna colatura o miscelazione tra pozzetti.
   4. Raccogliere le cellule in una provetta conica da 15 mL, centrifugare (5 min a 800 giri/min) e risospendere a 50K cellule per 150 µ l 1 x DMEM media. Se una cella diversa densità è ottima, assicurarsi che in questa fase la sospensione cellulare è 2 volte la densità finale desiderato (ad esempio per una concentrazione finale di 50.000 cellule a 300 µ l, densità delle cellule in questa fase è 50.000 cellule in 150 µ l).
   5. Inserire i divisori in plastica diagonalmente in pozzetti (Figura 2).
   6. Aggiungere dell'agarosi per ogni sospensione cellulare uno alla volta poco prima di placcatura. Per ciascun pozzetto, combinare 100 µ l di sospensione cellulare e 100 µ l di agarosio liquefatto in una provetta da 2 mL. Ad esempio, per quattro pozzi, combinare 400 µ l di coltura cellulare e 400 µ l di agarosio al 2%. Alcune cellule/agarosio miscela sarà lasciato ma rendendo un po' più del necessario evita bolle d'aria durante il pipettaggio.
      1. Aggiungere dell'agarosi per colture cellulari individuali immediatamente prima di tale coltura cellulare di placcatura. L'agarosio sarà freddo in meno di un minuto, quindi preparatevi a piastra rapidamente.
   7. Su un lato del divisore, piastra 150 µ l di miscela delle cellule/agarosio. Consentire l'agarosio a raffreddare e solidificare (circa un minuto) e poi rimuovere il divisore (Figura 2D).
   8. Posizionare al centro della metà vuota del pozzo espianto dell'ovaia. Miscela di media/agarosio posto 150 µ l sopra la parte superiore dell'ovaia e solo nel lato corretto del pozzo (Figura 2E).
   9. Incubare il vetrino a 37 ° C e 5% di CO₂ in un incubatore.

4. Slide di essiccazione e preparazione per MALDI-TOF MS

1. Dopo quattro giorni (o punto orario preferito), rimuovere il divisore camera dalle spine dell'agarosi e lo scivolo (Figura 1). Staccare delicatamente i lati dell'agarosi dalla camera con una spatola piatta e tirare delicatamente la camera verso l'alto, facendo attenzione a non spostare eventuali spine dell'agarosi. Se si muovono, delicatamente riposizionarli in modo che non toccano un l'altro.
2. Porre il vetrino in un forno di 37 ° C per circa 4 h, rotazione di 90° ogni h.
   Nota: La rotazione della diapositiva è importante per garantire la distribuzione uniforme del calore in tutto il campione.
3. Una volta asciutto, rimuovere il vetrino dal forno (Figura 1E).
4. Applicare la soluzione di matrice usando lo spruzzatore (Figura 1F), con i seguenti parametri: temperatura = 30 ° C, portata = 0,2 mL/min, numero di passaggi = 8, direzione = CC e distanza dell'ugello = 40 mm.
   Nota: Al posto di uno spruzzatore di matrice, un aerografo artistico consente di applicare la matrice liquida. La stessa soluzione di matrice può essere utilizzata per spruzzare, ma circa due volte tanto soluzione è necessaria. Con lo scivolo bloccato affinché si blocca in verticale, spruzzare la diapositiva da un angolo di 90° da circa un piede di distanza (adattato da Hoffmann¹⁵) fino a quando la matrice di livello è visibile.
5. Aggiungere 1 µ l di calibratore (fosforo rosso per obiettivi < 500 Da, una miscela di peptidi (Vedi Tabella materiali) per obiettivi < Da 5.000) a clear spot sulla diapositiva. Fosforo rosso non richiede nessuna mescolanza con matrice, ma la miscela peptidica miscela 1:1 con matrix per aiutare la ionizzazione. Attendere il calibratore a secco.
6. Disegnare una X usando un pennarello indelebile in ogni angolo della diapositiva e prendere un'immagine ottica utilizzando una fotocamera o uno scanner a 1.200 dpi.

5. acquisizione di dati di spettrometria di massa imaging

1. Aprire una nuova sequenza sul software di analisi dati IMS (Vedi Tabella materiali). Impostare la larghezza della trama per risoluzione spaziale desiderata, almeno 50 µm.
2. Caricare l'immagine ottica della diapositiva per il software di analisi e insegnare set tre punti utilizzando le intersezioni nella x disegnata in ogni angolo.
3. Designare le regioni di interesse per l'imaging del software di acquisizione e denominarli conseguenza.
4. Calibrare lo strumento utilizzando il software di acquisizione dati (Vedi Tabella materiali) all'interno di errore di 5 ppm.
5. Salvare il metodo ottimizzato e cominciare il funzionamento. Questo esperimento ottimizzato i seguenti parametri: polarità = positivo, rivelatore = Reflectron, dimensione Laser = 2, Potenza Laser = 50%, riflettore modalità rivelatore guadagno = 3x.

6. elaborazione dati IMS

1. .Mis file di importazione in un software statistico (Vedi Tabella materiali) per l'analisi del significato.

Risultati

Una diapositiva in modo ottimale secca di ITO si tradurrà in un piatto campione essiccato con minima o nessuna rughe su tutta la superficie del agarosio e pezzi di agarosio che mantengono la separazione spaziale sulla diapositiva (Figura 3). Figura 3A Mostra asciugatura ottimale, mentre Figura 3B Mostra le rughe che dovrebbero essere evitate. Questa ottimizzazione richiede un'attenta sorveglianza del...

Discussione

C'è un corpo crescente di prova che implica il ruolo di noradrenalina in HGSOC^12,17,18, e questa tecnica ha contribuito più meccanicistici informazioni. Con almeno otto condizioni biologiche presenti nella stessa diapositiva, il metodo può rappresentare controlli biologici come gene e specificità delle cellule come pure i controlli multimediali in un singolo IMS eseguire. Mentre il metodo è stato ottimizzato per valutare scambia...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Provette Falcon da 15 mL	Denville	C1017-O	Per raccogliere le cellule
Camera a 8 pozzetti (Millipore EZ-slide chamber)	Millipore	PEZGS0816	Riproposto da Millipore Millicell EZ-slide chamber slide slide
Acetonitrile	Sigma-Aldrich	34998-4L	Solvente per matrice spruzzata
Alpha Minimum Essential Medium (α MEM)	Fisher	10-022-CV	Terreni di coltura cellulare
Velocità Autoflex MALDI-TOF LRF	Bruker		Per l'analisi dei dati IMS
Centrifuga	Eppendorf	5810 R	Per raccogliere le cellule e rimuovere il surnatante
CHCA Matrix	Bruker Daltonic	8201344	Matrix spruzzato su vetrino essiccato
DHB Matrix	Bruker Daltonic	8201346	Matrix spruzzato su vetrino asciutto
Bisturi monouso	Fisher	22-079-707	Per la rimozione delle ovaie
Forbici da dissezione	Fisher	13-804-6	Per la rimozione delle ovaie
DMEM Media	Gibco	11995-065	Terreno miscelato con agarosio
fattore di crescita epidermico	Peprotech Inc.	100-15	Integratore di terreni per colture cellulari
Provette Eppendorf	Genesee Scientific	22-282	Per aliquote di agarosio
Estradiolo-17β	Simga-Aldrich	E2758	Integratore per terreni di coltura cellulare
Siero fetale bovino	Denville	fb5001	Integratore per terreni di coltura cellulare
FlexControl 3.4	di acquisizione dati	Bruker Daltonic
FlexImaging 4.1	di analisi dati	Bruker Daltonic
Pinze (fine)	Fsiher	22-327379	Per la rimozione del ovaie
Gentamycin	Cellgro	30-005-CR	Integratore di terreni per colture cellulari
Insulina, transferrina, selenio (ITS)	Sigma-Aldrich	11074547001	Supplemento per terreni di coltura cellulare
Vetrino rivestito in ITO	Bruker	Piattaforma per l'incubazione in co-coltura
11415064	Gibco	L-15 Medium di Leibovitz	utilizzati durante i tessuti dissezione
L-glutammina	Gibco	25030-081	Integratore di terreni per colture cellulari
Agarosio a basso punto di fusione	Sigma-Aldrich	A9414-10G	Miscelato con terreni per la placcatura
Bacino dei terreni	Corning	4870	Utilizzato per tagliare divisori in plastica per camere divise
Penicillina-streptomicina	Gibco	15140-122	Supplemento
ai terreni per colture cellulariCalibrazione dei peptidi Standard	Bruker Daltonic	8206195	Calibrante per gamma di massa media
Phophorus red	Sigma-Aldrich	343-242-5G	Calibrante per gamma di massa bassa
SCiLS Lab 2015	Bruker Daltonic		IMS analisi statistica dei dati
Pinze chirurgiche (smussate)	Fisher	08-875-8B	Per la rimozione delle ovaie
TFA	Fisher Tecnologie	A116-50	Aggiunto alla soluzione
matrice TM Spruzzatore	HTX Tecnologie		Per l'applicazione della matrice