Acquisizione di piccola molecola comunicazione tra tessuti e cellule mediante spettrometria di massa di Imaging

Summary

Un nuovo metodo di preparazione del campione è stato sviluppato per ospitare coculture delle cellule e del tessuto per rilevare cambio piccola molecola usando la spettrometria totale imaging.

Abstract

Spettrometria di massa (IMS) di imaging ordinariamente è stato applicato a tre tipi di campioni: sezioni di tessuto, sferoidi e le colonie microbiche. Questi tipi di campioni sono stati analizzati mediante spettrometria di massa tempo-di-volo del desorbimento/ionizzazione laser assistito da matrice (MALDI-TOF MS) per visualizzare la distribuzione di proteine, lipidi e metaboliti attraverso il campione biologico di interesse. Abbiamo sviluppato un metodo di preparazione del campione romanzo che unisce i punti di forza delle tre applicazioni precedenti per affrontare un approccio underexplored per l'identificazione di comunicazione chimica nel cancro, tramite la semina di colture di cellule di mammifero in agarosio in coculture con tessuti sani seguiti da essiccazione del campione. Cellule e tessuti di mammiferi sono cocultured nelle immediate vicinanze permettendo la comunicazione chimica tramite diffusione tra i tessuti e le cellule. Intervalli di tempo specifici, il campione basato su agarosio è asciugato nello stesso modo come colonie microbiche preparato per l'analisi IMS. Il nostro metodo è stato sviluppato per la comunicazione tra cancro ovarico sieroso di alta qualità derivata dal tubo fallopian come interagisce con l'ovaia durante metastasi di modello. Ottimizzazione della preparazione del campione ha portato alla identificazione di noradrenalina come componente chimico chiave nel microambiente ovarico. Questo metodo di recente sviluppato può essere applicato ad altri sistemi biologici che richiedono una comprensione della comunicazione chimica tra celle adiacenti o tessuti.

Introduction

Spettrometria di massa (IMS) di imaging è stato ottimizzato per caratterizzare la distribuzione spaziale delle caratteristiche molecolari in tre applicazioni ampiamente usate: fettine di tessuto, sferoidi e colonie microbiche^1,2,3. Fettine di tessuto possono essere utilizzati per valutare la localizzazione di metaboliti nel contesto di condizioni biologiche in un host, mirati o ciechi in uno specifico intervallo di massa. Tuttavia, le differenze tra le caratteristiche molecolari sono il più significativo ed evidente quando un tessuto sano è rispetto a una condizione di malato....

Protocol

Tutte le procedure di animali erano in conformità con gli istituti nazionali di salute orientamenti per la cura e l'uso di animali da laboratorio e approvato dal Comitato istituzionale animale uso e cura (IACUC) presso l'Università dell'Illinois a Chicago.

1. preparazione dei reagenti

1. Mantenere cellule di epitelio oviduttali murino (MOE) a 37° C con 5% di CO₂ in un incubatore alfa media minimo essenziale medio (αMEM) completati con 10% siero bovino fetale selenio (FBS), 2 mM L-Glutammina, 10mg/mL insulina, transferrina, (ITS) , 1,8 ng/mL fattore crescita epidermico (EGF), 100 U/mL di penicillina-streptomicina, la gentam....

Results

Una diapositiva in modo ottimale secca di ITO si tradurrà in un piatto campione essiccato con minima o nessuna rughe su tutta la superficie del agarosio e pezzi di agarosio che mantengono la separazione spaziale sulla diapositiva (Figura 3). Figura 3A Mostra asciugatura ottimale, mentre Figura 3B Mostra le rughe che dovrebbero essere evitate. Questa ottimizzazione richiede un'attenta sorveglianza del.......

Discussion

C'è un corpo crescente di prova che implica il ruolo di noradrenalina in HGSOC^12,17,18, e questa tecnica ha contribuito più meccanicistici informazioni. Con almeno otto condizioni biologiche presenti nella stessa diapositiva, il metodo può rappresentare controlli biologici come gene e specificità delle cellule come pure i controlli multimediali in un singolo IMS eseguire. Mentre il metodo è stato ottimizzato per valutare scambia.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Provette Falcon da 15 mL	Denville	C1017-O	Per raccogliere le cellule
Camera a 8 pozzetti (Millipore EZ-slide chamber)	Millipore	PEZGS0816	Riproposto da Millipore Millicell EZ-slide chamber slide slide
Acetonitrile	Sigma-Aldrich	34998-4L	Solvente per matrice spruzzata
Alpha Minimum Essential Medium (α MEM)	Fisher	10-022-CV	Terreni di coltura cellulare
Velocità Autoflex MALDI-TOF LRF	Bruker		Per l'analisi dei dati IMS
Centrifuga	Eppendorf	5810 R	Per raccogliere le cellule e rimuovere il surnatante
CHCA Matrix	Bruker Daltonic	8201344	Matrix spruzzato su vetrino essiccato
DHB Matrix	Bruker Daltonic	8201346	Matrix spruzzato su vetrino asciutto
Bisturi monouso	Fisher	22-079-707	Per la rimozione delle ovaie
Forbici da dissezione	Fisher	13-804-6	Per la rimozione delle ovaie
DMEM Media	Gibco	11995-065	Terreno miscelato con agarosio
fattore di crescita epidermico	Peprotech Inc.	100-15	Integratore di terreni per colture cellulari
Provette Eppendorf	Genesee Scientific	22-282	Per aliquote di agarosio
Estradiolo-17β	Simga-Aldrich	E2758	Integratore per terreni di coltura cellulare
Siero fetale bovino	Denville	fb5001	Integratore per terreni di coltura cellulare
FlexControl 3.4	di acquisizione dati	Bruker Daltonic
FlexImaging 4.1	di analisi dati	Bruker Daltonic
Pinze (fine)	Fsiher	22-327379	Per la rimozione del ovaie
Gentamycin	Cellgro	30-005-CR	Integratore di terreni per colture cellulari
Insulina, transferrina, selenio (ITS)	Sigma-Aldrich	11074547001	Supplemento per terreni di coltura cellulare
Vetrino rivestito in ITO	Bruker	Piattaforma per l'incubazione in co-coltura
11415064	Gibco	L-15 Medium di Leibovitz	utilizzati durante i tessuti dissezione
L-glutammina	Gibco	25030-081	Integratore di terreni per colture cellulari
Agarosio a basso punto di fusione	Sigma-Aldrich	A9414-10G	Miscelato con terreni per la placcatura
Bacino dei terreni	Corning	4870	Utilizzato per tagliare divisori in plastica per camere divise
Penicillina-streptomicina	Gibco	15140-122	Supplemento
ai terreni per colture cellulariCalibrazione dei peptidi Standard	Bruker Daltonic	8206195	Calibrante per gamma di massa media
Phophorus red	Sigma-Aldrich	343-242-5G	Calibrante per gamma di massa bassa
SCiLS Lab 2015	Bruker Daltonic		IMS analisi statistica dei dati
Pinze chirurgiche (smussate)	Fisher	08-875-8B	Per la rimozione delle ovaie
TFA	Fisher Tecnologie	A116-50	Aggiunto alla soluzione
matrice TM Spruzzatore	HTX Tecnologie		Per l'applicazione della matrice