Complessi di allungamento dell'RNA artificiale Polymerase II per eventi di elaborazione dell'RNA co-trascrizione

Sommario

Qui, descriviamo l'assemblaggio di complessi di allungamento della polimerasi RNA II (Pol II) che richiedono solo brevi oligonucleotidi di DNA sintetico e RNA e Pol II purificati. Questi complessi sono utili per studiare i meccanismi alla base dell'elaborazione co-trascrizione delle trascrizioni associate al complesso di allungamento di Pol II.

Abstract

La sintesi dell'mRNA eucariotico è un complesso processo biochimico che richiede la trascrizione di un modello di DNA in un RNA precursore da parte dell'enzima multi-subunità RNA polymerase II e il capping e giunzione co-trascrizione dell'RNA precursore per formare l'mRNA maturo. Durante la sintesi dell'mRNA, il complesso di allungamento dell'RNA polimerasi II è un obiettivo per la regolazione da parte di una vasta raccolta di fattori di trascrizione che controllano la sua attività catalitica, così come il capping, lo splicing e 3'enzimi che elaborano l'mRNA maturo. A causa della complessità intrinseca della sintesi dell'mRNA, sistemi sperimentali più semplici che consentono l'isolamento e l'indagine delle sue varie fasi co-trascrizioni hanno una grande utilità.

In questo articolo, descriviamo uno di questi semplici sistemi sperimentali adatti per studiare il capping dell'RNA co-trascrizione. Questo sistema si basa su complessi di allungamento definiti per la polimerasi II, assemblati da polimerasi purificate e bolle di trascrizione artificiale. Quando immobilizzati tramite DNA biotinylato, questi complessi di allungamento dell'RNA polimerasi II forniscono uno strumento facilmente manipolabile per distrusire il capping dell'RNA co-trascrizione e i meccanismi con cui il complesso di allungamento recluta e regola l'enzima di capping durante il ceforo co-trascrizione dell'RNA. Prevediamo che questo sistema potrebbe essere adattato per studiare il reclutamento e/o l'assemblaggio di proteine o complessi proteici con ruoli in altre fasi della maturazione dell'mRNA accoppiato al complesso di allungamento della polimerasi II.

Introduzione

La sintesi dell'RNA del messaggero eucaico (mRNA) è un processo biochimico elaborato che comporta la sintesi di un RNA precursore non elaborato mediante polimerasi RNA II e l'elaborazione dell'RNA precursore per produrre l'mRNA maturo. Le fasi di lavorazione dell'RNA di capping, splicing e poliadenilazione vengono eseguite in gran parte co-trascrizione. Il complesso di allungamento di Pol II funge da scaffold che recluta e orchestra le attività di molti degli enzimi di elaborazione dell'RNA. Di conseguenza, la nostra comprensione finale di come vengono generati mRNA eucarici maturi dipenderà fortemente dallo sviluppo di sistemi sperimentali per consentire la dissezion....

Protocollo

1. Assemblaggio di complessi di allungamento artificiale e Pol II Walking

1. Immobilizza 1 nmol di oligo di DNA non modello contenente una molecola di biotina 3' su perline magnetiche.
   NOTA: i seguenti passaggi possono essere eseguiti in anticipo per prepararsi per esperimenti futuri. Tutte le sequenze di oligo utilizzate in questo protocollo sono riportate nella Tabella 1. Gli olighi dell'RNA sono sintetizzati con modifiche di 5'-tripofosfato.
   1. Aggiungere 200 l di perline magnetiche (10 mg/mL) a un tubo di legame a bassa proteina da 1,5 mL, quindi posizionare su un rack magnetico per 2 min.
   2. Mentre il tubo ....

Risultati

Le figure 2 e 3 mostrano reazioni ai risultati rappresentativi utilizzate per generare complessi di allungamento artificiale contenenti trascrizioni di diverse lunghezze estendendo o Pol II da fonti diverse. La figura 4 illustra come questi complessi di allungamento possono essere utilizzati per analisi del numero co-trascrizione del fosforylazione del fosfolo dipendente dalla CTD.

Discussione

Gli studi che cercano di sezionare gli eventi accoppiati al complesso di allungamento di Pol II come l'elaborazione dell'RNA e la regolazione dell'allungamento della trascrizione stessa possono essere notevolmente facilitati dall'uso di un sistema enzimatico altamente purificato. La creazione di tali sistemi enzimatici può essere difficile. La trascrizione dipendente dal promoter da Pol II richiede almeno cinque fattori generali di trascrizione. La preparazione e l'accumulo di questi fattori possono richiedere mesi; quin.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
[α-32P] UTP (3000 Ci/mmol), 1 mCi	Perkin Elmer	NEG007H001MC	Per la radiomarcatura dell'RNA
2x colorante caricamento RNA	New England Biolabs	B0363S	Altamente raccomandato. Per la preparazione dell'RNA durante il caricamento del gel
Soluzione di Bis:Acrilammide al 40%	Biorad	1610144
Albumina sierica bovina (20 mg/mL)	New England Biolabs	B9000S
Cdk7/Ciclina H/MAT1 (complesso CAK) Proteina, attiva, 10 &; g	Millipore Sigma	14-476	Utilizzato per fosforilare gli
oligonucleotidi del DNA	IDT		Vedere la Tabella 8 per le specifiche di purezza
Dynabeads MyOne Streptavidin C1	Life Technologies Invitrogen	65001	Abbiamo anche usato la streptavidina Dynabeads M-280 senza problemi, ma preferiamo le perle di streptavidina MyOne perché sedimentano più lentamente
GlycoBlue Coprecipitant (15  mg/mL)	Life Technologies Invitrogen	AM9516	Altamente raccomandato. Colora il blu del pellet di acido nucleico che rende le reazioni molto più facili da gestire
di elettroforesi verticale standard a doppio raffreddamento Hoefer SE600 con distanziatori da 1 mm e pettine a 15 pozzetti	Provette ad alta densità Hoefer	SE600-15-1.5
MaXtract (1,5 mL)	Qiagen	129046	Altamente raccomandato. Contiene un gel ad alta densità che forma una barriera stabile tra la fase acquosa e quella organica; migliora la resa dell'RNA durante le estrazioni
Soluzione di proteinasi K (20  mg/mL)	Life Technologies Invitrogen	25530049
Oligonucleotidi di RNA	Trilink		Vedere la Tabella 8 per maggiori dettagli
Pirofosfatasi inorganica del lievito (100 unità/mL)	New England Biolabs	NEBM2403S	Richiesto solo durante le reazioni di tappatura

Pol II CTD Sistema