Descriviamo un protocollo dettagliato per la valutazione dei profili tossicologici delle nanoparticelle di ossido di zinco (NO NP) in particolare, il tipo di morte cellulare nei fibroblasti polmonari MRC5 umani e la formazione di ROS nel farro della frutta Drosophila.
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Articolo metodologico
Studio di tossicità delle nanoparticelle di ossido di zinco nella coltura cellulare e nella drosophila melanogaster
In questo articolo
Sommario
Abstract
Le nanoparticelle di ossido di zinco (NO NP) hanno un'ampia gamma di applicazioni, ma il numero di rapporti sulla tossicità associata a NP è cresciuto rapidamente negli ultimi anni. Tuttavia, gli studi che chiariscono i meccanismi sottostanti per la tossicità indotta da NP nO sono scarsi. Abbiamo determinato i profili di tossicità degli NP di nO utilizzando modelli sperimentali sia in vitro che in vivo. È stata osservata una significativa diminuzione della vitalità cellulare nei fibroblasti polmonari MRC5 esposti da NP, dimostrando che le NP di NO esercitano effetti citotossici. Allo stesso modo, è interessante notare che l'intestino esposto alle NP di NP ha mostrato un drammatico aumento dei livelli di specie reattive dell'ossigeno (ROS) nel moscerino della frutta Drosophila. Sono necessari studi più approfonditi per stabilire una valutazione del rischio per l'aumento dell'utilizzo da parte degli NP di NO da parte dei consumatori.
Introduzione
La nanotecnologia si riferisce all'applicazione di materiali di dimensioni nanometriche che vengono utilizzati in tutti i campi scientifici, tra cui la medicina, la scienza dei materiali e la biochimica. Ad esempio, gli NP nO, noti per la loro dispersione ultravioletta, il rilevamento chimico e le proprietà antimicrobiche, nonché l'elevata conduttività elettrica, sono utilizzati nella produzione di vari prodotti di consumo come imballaggi alimentari, cosmetici, tessuti, gomme, batterie, catalizzatore per il trattamento del gas coda di automobili e applicazioni biomediche1,2,3.
Tuttavia, le fiorenti applicazioni dei prodotti basati su NP di NO, che hanno portato ad una maggiore esposizione umana alle NP di NO, hanno sollevato preoccupazioni sui loro potenziali effetti negativi sulla salute umana. Una serie di studi cellulari in vitro hanno dimostrato che nO NP può indurre stress ossidativo, citobilsia autofagia, infiammazione, e genotossicità4,5,6,7 . In particolare, si presume che la tossicità degli NP di NP sia causata dalla dissoluzione di n2 o 2 o più ioni, nonché dalla reattività superficiale di inibizione del trasporto iosilio4,7,9,10. È importante sottolineare che gli studi hanno dimostrato che la generazione di specie reattive dell'ossigeno (ROS) è uno dei meccanismi primari alla base della tossicità associata a NPs. È stato dimostrato che un'insufficiente attività antiossidante a seguito di un insulto AL ROS è stato dimostrato di essere responsabile di suscitare la citotossicità e il danno al DNA9. Gli effetti tossici delle NP di NO sono stati riportati anche in modelli animali, tra cui roditore1, pesce zebra11,12, così come l'invertebrato Drosophila13.
La Drosophila funge da modello animale alternativo consolidato per lo screening della tossicità di entità chimiche e nanomateriali (MN)14,15. È importante sottolineare che esistono alti livelli di somiglianza genetica e fisiologica tra l'uomo e la Drosophila che giustifica l'uso della Drosophila come modello in vivo per valutare le risposte biologiche ai contaminanti ambientali come le MMM 16. Inoltre, ci sono molti vantaggi dell'uso della Drosophila a causa delle sue piccole dimensioni, della sua breve durata, dell'amenabilità genetica e del mantenimento facile ed economico. Inoltre, la Drosophila è stata ampiamente adottata per lo studio della genetica, della biologia molecolare e dello sviluppo, sin da quando il suo genoma completo è stato completamente sequenziato anni fa nel 2000, rendendolo quindi adatto per una varietà di screening ad alto valore e per affrontare questioni biologiche irrisolte17,18,19,20,21. Negli ultimi anni, una serie di studi relativi all'immunotossicità utilizzando diversi tipi di NP in Drosophila sono stati segnalati15,22,23,24. Queste nuove conoscenze fondamentali ottenute dagli studi che utilizzano la Drosophila hanno contribuito a fornire maggiori informazioni sulla nostra comprensione della nanotossicologia.
ROS è un noto colpevole di citotossicità e genotossicità causata da NP, in particolare, NP a base metallica25. I ROS sono specie chimiche contenenti ossigeno con proprietà reattive più elevate rispetto all'ossigeno molecolare. I radicali liberi come il superossido radicale (O2-) e anche molecole non radicali come il perossido di idrogeno (H2O2)possono agire come ROS. In condizioni fisiologiche normali, sono tenuti a mantenere l'omeostasi cellulare26, tuttavia, un ROS eccessivo a causa della sovrapproduzione o della disregolazione del sistema di difesa antiossidante può causare stress ossidativo, che porta a danni alle proteine, lipidi e acido deossiribonucleico (DNA)27. Ad esempio, con l'aumento dei livelli di ROS e l'aumento del livello di glutathione (GSH) concomitante, l'interruzione della sintesi del triposfato di adenosina (ATP) avviene e il livello di dehydrogenasi in lattato (LDH) aumenta nel mezzo, culminando nella morte cellulare27.
Qui, forniamo protocolli per l'esecuzione di analisi cellulari e genetiche utilizzando cellule di mammiferi coltivati e Drosophila per determinare i potenziali effetti negativi delle NP nO. Nella figura 1è riportata una panoramica del metodo utilizzato per lo studio di tossicità degli NP nO.
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Protocollo
1. Fluorescenza Activated Cell Sorting (FACS) Analisi su celle vissute / fisse
- Sonicato NP nO in sospensione per 15 min.
- Preparare gli NP nO a varie concentrazioni (ad esempio, 0, 10, 25, 50.100 e 200 g/mL) utilizzando una soluzione di stock di 1 mg/mL nO NP per il trattamento delle cellule coltivate.
- Semina MRC5 fibroblasti polmonari umani (1 x 105 cellule/bene) su una piastra di coltura 6-pozzio un giorno in anticipo, e poi trattare le cellule con 2 mL di NP nO (in triplicati) per 8 h, 16 h, e 24 h.
- Ad ogni punto temporale, raccogliere le cellule centrifugando a 300 x g per 5 min.
- Lavare i pellet cellulari due volte con salina tamponata da fosfato (PBS).
- Risospendere le celle con buffer di rilegatura 1x, composto da 0,1 M di idrossido di hePES/sodio (NaOH), 1,4 M di cloruro di sodio (NaCl) e 25 mM di cloruro di calcio (CaCl2), a una concentrazione di 1 x 105 celle per 100 .
- Aggiungere 5 -L L di isotoniociocianate (FITC) Annexin V macchia e 5 -L di macchie di DNA di iodio di propidium iodide (PI), e incubare le cellule per 15 min a temperatura ambiente (RT; 25 ) al buio.
- Ricaricare i campioni con un buffer di rilegatura aggiuntivo di 400 l of 1x prima di ordinare le celle in base alla citometria di flusso. Per ogni campione viene analizzato un minimo di 10.000 cellule.
- Tabulazione il grafico a barre utilizzando l'intensità mediana ottenuta.
2. Esposizione delle NP di znO alla Drosophila
- Aggiungere 1 mL di nanoparticelle a concentrazioni diverse in fiale, seguito da 9 mL di cibo a mosca per fare una concentrazione finale di 0,1 mg/mL, 0,25 mg/mL o 0,5 mg/mL nP.
- Mescolare accuratamente le nanoparticelle con il cibo nelle fiale utilizzando la pipetta.
- Lasciare raffreddare gli alimenti a mosca contenenti NP nO per almeno 2-3 h prima dell'uso.
- Introdurre adulti maschio e femmina vola nelle fiale per 5 giorni, e consentire loro di accoppiarsi e deporre le uova (che appaiono come macchie bianche) sulla superficie del cibo.
- Rimuovere le mosche parentali e consentire alle uova di subire un ulteriore sviluppo, che consiste in 4 diversi stadi di sviluppo (stadio embrionale, larvale, pupale e adulto).
3. Dissezione del volo
- Raccogliere larve a tarda 3rd instar dalla parete delle fiale per le analisi. Le uova appena deposte normalmente si sviluppano in larve instelle alla fine 3rd dopo 72-120 h a RT.
- Pulire il piatto di dissezione e riempire il pozzo con il mezzo di dissezione/PBS.
- Dissezionare le larve (più tardi 3rd instar) sotto lo stereoscopio, utilizzando un paio di pinze.
- Utilizzare la punta delle pinze per fare un piccolo foro e rompere aprire lo strato cuticola delle larve. Estrarre con attenzione l'intestino e metterlo in un tubo di microcentrifuga da 1,5 ml contenente il mezzo Drosophila di Schneider, prima della fase di fissaggio utilizzando 1 mL di 4% di paraformaldeide (PF).
- 3.5Fissare l'intestino in PF per 10 min a RT, per esperimenti successivi, come l'immunostaining.
4. Rilevamento ROS utilizzando la colorazione diHydroethidium (DHE)
- Trattare le larve con varie concentrazioni di NP nO come descritto al punto 2.1.
- Dopo la dissezione dell'intestino da 3rd larve instelle come descritto nella sezione 3, incubare l'intestino nel mezzo Drosophila di Schneider a RT prima di colorare i tessuti. Sciogliere 1 l l di colorante DHE (dalla concentrazione di magazzino di 30 mM) in 1 mL del mezzo di Schneider, facendo una concentrazione di lavoro finale di 10-30 M dy e DHE colorante.
- Incubare l'intestino per 5 min al buio, quindi lavare tre volte utilizzando il mezzo di Schneider per ogni 5 min.
- Fissare l'intestino con il 4% PF (passo opzionale) e montare l'intestino su vetrini di vetro, con un supporto di montaggio anti-dissolvenza contenente 4,6-diamidino.2-fenilondole (DAPI). Acquisire immagini al microscopio confocale.
5. Misurazione della fluorescenza mediante il software ImageJ
- Importare le immagini a fluorescenza acquisite mediante microscopia a fluorescenza o microscopia a scansione laser confocale nel software ImageJ.
- Fare clic sul menu Analizza e selezionare Imposta misure.
- Selezionare la misura di output, ad esempio l'intensità integrata dell'area e il valore medio del grigio.
- Fare clic su Misura.
- Selezionare un'area senza fluorescenza per impostare lo sfondo.
- Esportare i dati nel foglio di calcolo di Excel e determinare la fluorescenza totale delle celle (CTCF) corretta, utilizzando il calcolo come illustrato di seguito.
CTCF - Densità integrata - (Area della cella selezionata X Media fluorescenza delle letture di fondo) - Costruire un grafico a barre ed eseguire analisi statistiche.
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Risultati
Le cellule esposte np sono state elaborate con il kit di reagente di colorazione delle cellule, seguito dallo smistamento delle celle utilizzando la citometria di flusso. Le celle trattate con NP nO (in basso, pannello destro) presentano una percentuale più alta di celle apoptotiche anticipate (R3) / tardive (R6) rispetto alle celle di controllo (R5, in basso, pannello sinistro). La morte necrotica delle cellule è indicata da R4 (in alto, pannello destro) (Figura 2
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Discussione
Al fine di valutare se l'NP nO può indurre l'apoptosi nei fibroblasti MRC5, usiamo la citometria di flusso per distinguere le cellule dalla morte cellulare necrotica o apoptotica. Nelle cellule vive normali, la fosfatidilaselserina (PS) è localizzata nella membrana cellulare. Se si verifica l'apoptosi, PS viene traslocato al volantino extracellulare della membrana plasmatica, consentendo il legame dell'annessione V etichettata con fluoresceina (FITC Annexin V)29. D'altra parte, lo iodio propidio r...
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.
Ringraziamenti
Lo studio è stato sostenuto dal numero di sovvenzione R706-000-043-490. Lo studio non rappresenta il parere dello sponsor della sovvenzione.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 15% Metil 4-idrossibenzoato | Sigma Aldrich | ||
| 4% Paraformaldeide | Sigma Aldrich | P6148 | |
| Bacto Agar | BD biosciences | ||
| cncCK6/TM3, Sb | un dono dal Dr. Kerppola T | ||
| Farina di mais, glucosio, lievito di birra | Sigma Aldrich | ||
| CyAn ADP con Summit Software | DAKO | https://flow.usc.edu/files/2014/07/BC-Cyan-ADP-User-Guide-2016.pdf | |
| Diidroetidio (Idroetidina) | Thermo Fisher Scientific | D11347 | |
| FITC Annexin V Kit di rilevamento dell'apoptosi I | BD biosciences | 556547 | |
| Microscopio a fluorescenza | Olympus | ||
| Glucolin | Supermarket | ||
| Software ImageJ | NIH | ||
| MRC5 fibroblasto polmonare umano | ATCC | CCL-171 | |
| Schneider' s Drosophila medium | Thermo Fisher Scientific | 21720-024 | |
| Vectashield terreno di montaggio antisbiadimento con DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Wild-type Canton-S; Sod2N308/CyO | NIG-FLY | ||
| Nanoparticelle di ossido di zinco | Sigma Aldrich | 721077 | Fare riferimento al foglio 2 |
Riferimenti
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