Descriviamo un protocollo dettagliato per la valutazione dei profili tossicologici delle nanoparticelle di ossido di zinco (NO NP) in particolare, il tipo di morte cellulare nei fibroblasti polmonari MRC5 umani e la formazione di ROS nel farro della frutta Drosophila.
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Articolo metodologico
Studio di tossicità delle nanoparticelle di ossido di zinco nella coltura cellulare e nella drosophila melanogaster
In questo articolo
Sommario
Abstract
Le nanoparticelle di ossido di zinco (NO NP) hanno un'ampia gamma di applicazioni, ma il numero di rapporti sulla tossicità associata a NP è cresciuto rapidamente negli ultimi anni. Tuttavia, gli studi che chiariscono i meccanismi sottostanti per la tossicità indotta da NP nO sono scarsi. Abbiamo determinato i profili di tossicità degli NP di nO utilizzando modelli sperimentali sia in vitro che in vivo. È stata osservata una significativa diminuzione della vitalità cellulare nei fibroblasti polmonari MRC5 esposti da NP, dimostrando che le NP di NO esercitano effetti citotossici. Allo stesso modo, è interessante notare che l'intestino esposto alle NP di NP ha mostrato un drammatico aumento dei livelli di specie reattive dell'ossigeno (ROS) nel moscerino della frutta Drosophila. Sono necessari studi più approfonditi per stabilire una valutazione del rischio per l'aumento dell'utilizzo da parte degli NP di NO da parte dei consumatori.
Introduzione
La nanotecnologia si riferisce all'applicazione di materiali di dimensioni nanometriche che vengono utilizzati in tutti i campi scientifici, tra cui la medicina, la scienza dei materiali e la biochimica. Ad esempio, gli NP nO, noti per la loro dispersione ultravioletta, il rilevamento chimico e le proprietà antimicrobiche, nonché l'elevata conduttività elettrica, sono utilizzati nella produzione di vari prodotti di consumo come imballaggi alimentari, cosmetici, tessuti, gomme, batterie, catalizzatore per il trattamento del gas coda di automobili e applicazioni biomediche1,2,3....
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Protocollo
1. Fluorescenza Activated Cell Sorting (FACS) Analisi su celle vissute / fisse
- Sonicato NP nO in sospensione per 15 min.
- Preparare gli NP nO a varie concentrazioni (ad esempio, 0, 10, 25, 50.100 e 200 g/mL) utilizzando una soluzione di stock di 1 mg/mL nO NP per il trattamento delle cellule coltivate.
- Semina MRC5 fibroblasti polmonari umani (1 x 105 cellule/bene) su una piastra di coltura 6-pozzio un giorno in anticipo, e poi trattare le cellule con 2 mL di NP nO (in triplicati) per 8 h, 16 h, e 24 h.
- Ad ogni punto temporale, raccogliere le cellule centrifugando a 300 x g per 5 min.
- Lavare i pellet ....
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Risultati
Le cellule esposte np sono state elaborate con il kit di reagente di colorazione delle cellule, seguito dallo smistamento delle celle utilizzando la citometria di flusso. Le celle trattate con NP nO (in basso, pannello destro) presentano una percentuale più alta di celle apoptotiche anticipate (R3) / tardive (R6) rispetto alle celle di controllo (R5, in basso, pannello sinistro). La morte necrotica delle cellule è indicata da R4 (in alto, pannello destro) (Figura 2
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Discussione
Al fine di valutare se l'NP nO può indurre l'apoptosi nei fibroblasti MRC5, usiamo la citometria di flusso per distinguere le cellule dalla morte cellulare necrotica o apoptotica. Nelle cellule vive normali, la fosfatidilaselserina (PS) è localizzata nella membrana cellulare. Se si verifica l'apoptosi, PS viene traslocato al volantino extracellulare della membrana plasmatica, consentendo il legame dell'annessione V etichettata con fluoresceina (FITC Annexin V)29. D'altra parte, lo iodio propidio r.......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.
Ringraziamenti
Lo studio è stato sostenuto dal numero di sovvenzione R706-000-043-490. Lo studio non rappresenta il parere dello sponsor della sovvenzione.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 15% Metil 4-idrossibenzoato | Sigma Aldrich | ||
| 4% Paraformaldeide | Sigma Aldrich | P6148 | |
| Bacto Agar | BD biosciences | ||
| cncCK6/TM3, Sb | un dono dal Dr. Kerppola T | ||
| Farina di mais, glucosio, lievito di birra | Sigma Aldrich | ||
| CyAn ADP con Summit Software | DAKO | https://flow.usc.edu/files/2014/07/BC-Cyan-ADP-User-Guide-2016.pdf | |
| Diidroetidio (Idroetidina) | Thermo Fisher Scientific | D11347 | |
| FITC Annexin V Kit di rilevamento dell'apoptosi I | BD biosciences | 556547 | |
| Microscopio a fluorescenza | Olympus | ||
| Glucolin | Supermarket | ||
| Software ImageJ | NIH | ||
| MRC5 fibroblasto polmonare umano | ATCC | CCL-171 | |
| Schneider' s Drosophila medium | Thermo Fisher Scientific | 21720-024 | |
| Vectashield terreno di montaggio antisbiadimento con DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Wild-type Canton-S; Sod2N308/CyO | NIG-FLY | ||
| Nanoparticelle di ossido di zinco | Sigma Aldrich | 721077 | Fare riferimento al foglio 2 |
Riferimenti
- Kim, Y. R., et al. Toxicity of 100 nm zinc oxide nanoparticles: a report of 90-day repeated oral administration in Sprague Dawley rats. International Journal of Nanomedicine. 9 Suppl 2, 109-126 (2014).
- Xie, Y., He, Y., Irwin, P. L., Jin, T., Shi, X.
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Ristampe e permessi
