Uso di un acceleratore lineare per condurre esperimenti di radiobiologia in vitro

La radioterapia è un trattamento efficace per molti tipi di cancro^1,2,3,4. L'irradiazione extra-alta del tasso di dose è relativamente nuova nella radioterapia ed è resa possibile dai recenti progressi tecnologici negli acceleratori lineari⁵. I vantaggi clinici dell'irradiazione extra elevata rispetto al tasso di dose standard includono tempi di trattamento ridotti e una migliore esperienza del paziente. Gli acceleratori lineari forniscono anche un ambiente clinico per gli studi di biologia delle radiazioni basate sulla coltura cellulare. Le implicazioni biologiche e terapeutiche della dose e dei tassi di dose di radiazioni sono state al centro dell'interesse degli oncologi e biologi delle radiazioni per i decenni^6,7,8. Tuttavia, la radiobiologia dell'irradiazione extra elevata della dose e dell'irradiazione flash - un tasso di dose estremamente elevato di radiazioni - deve ancora essere studiata a fondo.

L'irradiazione a raggi gamma è ampiamente utilizzata nella biologia delle radiazioni basata sulla coltura cellulare^9,10,11. La radiazione è ottenuta dai raggi gamma emessi da sorgenti di isotopi radioattivi in decomposizione, tipicamente Cesio-137. L'uso di fonti radioattive è altamente regolamentato e spesso limitato. Con l'irradiazione basata sulle fonti, è difficile testare un'ampia gamma di tassi di dose, limitando la sua utilità nell'analisi degli effetti biologici dei tassi di dose misurabili cliniche¹².

Ci sono stati diversi studi che illustrano sia la dose e gli effetti tasso di dose^{12,13,14,15,16,17}. In questi studi, sono state utilizzate sia l'irradiazione gamma generata da isotopi radioattivi che dai raggi X generati da acceleratori lineari. Sono state utilizzate una varietà di linee cellulari che rappresentano il cancro del polmone, il cancro cervicale, il glioblastoma e il melanoma. Gli effetti delle radiazioni sulla sopravvivenza delle cellule, l'arresto del ciclo cellulare, l'apoptosi e il danno al DNA sono stati valutati come letture^{12,13,14,15,16,17} . Qui, descriviamo un metodo per definire gli effetti biologici della dose di radiazioni clinicamente rilevanti e dei tassi di dose fornendo radiazioni a raggi X utilizzando un acceleratore lineare. Questi studi devono essere eseguiti con stretta collaborazione tra il biologo, l'oncologo delle radiazioni e il fisico medico.

1. Preparazione cellulare per la coltura delle cellule di sospensione

1. Coltura le cellule staminali del glioma nei media di coltura delle cellule staminali a circa 5 x 10⁶ lastre di cellule/10 cm in un'incubatrice di coltura cellulare con 5% di CO₂, 95% di umidità relativa a 37 gradi centigradi.
   NOTA: la condizione di coltura cellulare è la stessa in tutte le procedure. I supporti utilizzati nel protocollo sono supporti completi.
2. Due giorni prima dell'irradiazione programmata, raccogliere le cellule staminali del glioma dalla piastra di coltura con una pipetta sterile da 5 mL in un tubo di centrifugadi da 15 mL in una cappa di coltura.
3. Centrifugare le cellule raccolte a 200 x g per 3 min in una centrifuga di controsoffitto.
4. Eliminare il supernatante e digerire il pellet cellulare (circa 1 x 10⁷ celle) con 1 mL di trypsin-EDTA a temperatura ambiente per 5 minuti per effettuare una sospensione a cella singola in trypsin-EDTA. Scuotere delicatamente il fondo del tubo di centrifuga ogni 2 minuti durante la digestione per assicurarsi che le cellule siano digerite accuratamente.
5. Aggiungere 3 mL di supporti di coltura delle cellule staminali (vedere la tabella dei materiali) per eseguire l'accodamento della trypsin. Centrifugare le cellule raccolte a 200 x g per 3 min in una centrifuga top. Scartare il supernatante e salvare il pellet cellulare.
6. Risospendere le cellule con 5 mL di colture cellulari e contare le cellule con un emocitometro.
7. Piastra 5 x 10⁶ cellule in due piastre da 10 cm contenenti 10 mL di colture cellulari.
8. Subito prima dell'irradiazione programmata, raccogliere le cellule e scartare il supernatale dopo la centrifugazione, come descritto al punto 1.3. Sospendere nuovamente il pellet cellulare con 5 mL di colture cellulari. Trasferire 1 mL di sospensione cellulare in una piastra da 35 mm contenente 2 mL di supporti di coltura cellulare.
   NOTA: Il volume totale dei supporti è di 3 mL nella piastra da 35 mm per rendere il liquido di 1 cm di altezza nella piastra.
9. Trasferire le celle placcate in un contenitore secondario, ad esempio una scatola di plastica o schiuma, per ridurre il rischio di contaminazione e portare le cellule nel contenitore all'impianto di irradiazione sul carrello.
10. Irradiare le cellule come descritto al punto 4.

2. Preparazione cellulare per la coltura cellulare associata

1. Un giorno prima dell'irradiazione, nella cappa di coltura cellulare, rimuovere il supporto DMEM dalla piastra di coltura cellulare della linea cellulare collegata, come le cellule HEK-293. Il supporto può essere assottigliato utilizzando una pipetta Pasteur collegata ad un vuoto.
2. Lavare le cellule con 5 mL di PBS sterile al piatto di coltura per sciacquare i supporti residui.
3. Pipette 1 mL di trypsin-EDTA nel piatto di coltura e inclinare delicatamente il piatto di coltura per assicurarsi che l'intero piatto sia coperto di trypsin-EDTA.
4. Orpsinizzare le cellule a temperatura ambiente per 5 min. Quench la reazione trypsin-EDTA con 3 mL di supporti DMEM e raccogliere le cellule con una pipetta da 5 mL in tubo di centrifuga di 15 mL nel cofano di coltura.
5. Centrifugare le cellule raccolte a 200 x g per 3 min in una centrifuga top. Scartare il supernatante e salvare il pellet cellulare.
6. Risospendere le celle con 5 mL di supporti DMEM e contare le celle con un emocitometro.
7. Piastra 2 x 10⁵ celle in una piastra da 35 mm che utilizza 3 mL di supporti di coltura cellulare fino ad un'altezza di 1 cm di supporto.
8. Dopo 24 h di coltura cellulare nell'incubatrice a 37 , trasferire le cellule placcate in un contenitore secondario (cioè una scatola di schiuma isolante) all'impianto di irradiazione su un carrello di utilità.
9. Irradiare le cellule come descritto al punto 4.

3. Preparazione cellulare per l'immunostaining dopo l'irradiazione

1. Scongelare la matrice proteica extracellulare commerciale sul ghiaccio a 4 gradi centigradi durante la notte. Pre-freddo 200 punte pipette e tubi di centrifuga di 1,5 mL a 4 gradi durante la notte.
2. Matrice di proteine extracellulari con punte di pipetta pre-raffreddata e tubi di centrifuga di 1,5 mL a 200 - L per tubo.
3. Diluire 200 - L di matrice di proteine extracellulari in mezzi pre-raffreddati di coltura cellulare per produrre un supporto di matrice proteica extracellulare dell'1%.
4. Posizionare un coperchio sterilizzato (22 mm x 22 mm) in una piastra da 35 mm. Posizionare sul coperchio un supporto a matrice proteica extracellulare dell'1%L l dell'1%.
5. Collocare la piastra da 35 mm nell'incubatrice a coltura cellulare a 37 gradi centigradi per 1 h per consentire alla matrice di proteine extracellulari di polimerizzare sul coperchio.
6. Quando si usa la coltura delle celle di sospensione, creare una sospensione a cella singola come descritto nei passaggi da 1.1 a 1.5.
7. Piastra 5 x 10⁴ cellule su un coperchio rivestito a matrice di proteine extracellulari collocato in una piastra di 35 mm. Riportare le cellule placcate all'incubatrice a coltura cellulare durante la notte per garantire che le cellule siano supportate dalla matrice proteica. Il volume totale del supporto nella piastra dovrebbe essere 3 mL per rendere l'altezza dei media raggiungere 1 cm nel piatto di coltura.
8. Osservare le cellule al microscopio a campo luminoso con lente obiettivo di ingrandimento 10x. Le cellule dovrebbero diffondersi sul coperchio invece di galleggiare. Trasferire il piatto di coltura con cellule placcate in un contenitore secondario, ad esempio una scatola di schiuma all'impianto di irradiazione su un carrello di utilità e irradiare le cellule come descritto al punto 4.
9. Quando si utilizzano colture di cellule associate (ad esempio, celle HEK-293), digerire le celle come descritto nei passaggi da 2.1 a 2.6. Posizionare 5 x 10⁴ cellule su uno scivolo di copertura sterile in una piastra di 35 mm un giorno prima dell'irradiazione per assicurarsi che le cellule siano completamente attaccate alla superficie del coperchio osservandole al microscopio come nel punto 3.9. Utilizzare 3 mL di supporti DMEM per rendere il liquido di 1 cm di altezza nella piastra.
10. Dopo aver coltivato le cellule sui coprilettidurantele durante la notte o fino a un giorno, trasferire il piatto di coltura con cellule placcate in un contenitore secondario all'impianto di irradiazione. Un carrello di servizio può essere utilizzato per ridurre il rischio di fuoriuscita. Irradiare le cellule come descritto al punto 4.

4. Irradiation con acceleratore lineare (LINAC)

1. Utilizzando il software console di LINAC, impostare l'acceleratore gantry e collimator a 0 , aprire le ganasce X e Y a una dimensione simmetrica di 20 x 20 cm² e ritrarre i collimatori multi-foglia (MLC) se presenti.
   NOTA: I LINAC possono avere una modalità FFF (Flattening Filter free), che consente tassi di dose molto elevati. Come suggerisce il nome, questa radiazione non è uniforme (piatta), e l'alto tasso di dose è raggiunto solo al centro del fascio. In questo caso viene utilizzato un campo 7 x 7 cm 2.
2. Posizionare almeno 5 cm di materiale equivalente per l'acqua sul divano di trattamento. Posizionare la parabola cellulare da irradiare a 400 MU/min (tasso di dose standard) sul materiale equivalente all'acqua e centrarlo sul mirino LINAC.
3. Posizionare le cellule da irradiare ad una profondità di dose massima in un fascio di raggi X 6 MV, circa 1,5 cm. Posizionare un ulteriore 1 cm di materiale equivalente acqua sulla parte superiore del piatto. In combinazione con l'1 cm di mezzo in cui le cellule sono sospese, questo pone le cellule ad una profondità media di 1,5 cm.
4. Apporre il puntatore anteriore alla testa del LINAC. Estendere il puntatore anteriore fino a quando non viene visualizzata la superficie del materiale di accumulo e notare la distanza. Regolare l'altezza della tabella fino a quando la distanza dalla sorgente alla superficie di accumulo è di 100 cm.
   NOTA: la distanza può essere confermata con l'indicatore ottico della distanza. In alternativa, l'indicatore di distanza ottica può essere utilizzato al posto del puntatore anteriore per impostare la sorgente per costruire la superficie a 100 cm.
5. Calcolare il numero appropriato di unità di monitoraggio (MU) per fornire la dose desiderata di radiazioni alle cellule e programmare l'acceleratore per consegnare a 400 MU/min.
   NOTA: Per l'impostazione della distanza sorgente-superficie (SSD) su un LINAC calibrato per fornire 1 cGy/MU alla profondità della dose massima, il numero richiesto di unità di monitor viene calcolato utilizzando MU : Dose(cGy) / (1 cGy/MU) / OF(20x20), dove OF sta per fattore di uscita. Questo calcolo dovrà essere modificato per i LINAC utilizzando impostazioni di calibrazione alternative.
6. Lasciare il caveau del trattamento e verificare che tutti gli altri individui siano usciti. Vrify che non ci sono altre cellule nella stanza, o riceveranno basse dosi di radiazioni. Chiudi lo sportello del caveau.
7. Confermare le dimensioni del campo, MU e MU/min nella console, quindi abilitare il fascio.
8. Ripetere i passaggi da 4,3 a 4,8 affinché le cellule siano irradiate a tassi di dose superiori o inferiori.
   1. Per ottenere tassi di dose più elevati (ad esempio, 2100 MU/min o superiore) con l'acceleratore, diminuire l'SSD al fine di aumentare il tasso di dose effettivo alle cellule secondo la legge quadrata inversa: DoseRateEffective - Doserate (100 cm / SSD_New)².
   2. Per bassi tassi di dose (ad esempio, 20 MU/min), aumentare la fonte alla distanza superficiale (SSD_New) per diminuire la dose. Ad esempio, il piatto di coltura cellulare può essere posizionato sul pavimento della sala di trattamento.
   3. Ricalcolare l'impostazione dell'unità di monitor sull'acceleratore se questa impostazione è necessaria, utilizzando MU : Dose(cGy) / (1 cGy/MU) / OF(20x20)/ (100 cm / SSD_New)². Per ulteriori informazioni sui calcoli MU, fare riferimento a Riferimento di McDermott e Orton¹⁸.
9. Determinare la velocità della dose in Gy/minuto da DoseRate(Gy/Min) : Dose(Gy) ad esempio, 4 Gy consegnati a 400 MU/min richiede 380 MU, quindi 4/400/380 - 4,2 Gy/min. Vedere tabella 1.

Figura 1 : Impostazione del piatto di coltura cellulare sull'acceleratore lineare. (A) Viene visualizzato un acceleratore lineare clinico. (B) 5 cm di materiale equivalente acqua è posto sul divano di trattamento. (C) Un piatto di coltura cellulare è posto sulla superficie del materiale. (D) Il piatto è centrato utilizzando il mirino dell'acceleratore nel campo di trattamento mostrato dal campo di luce quadrata. (E) 1 cm di materiale equivalente all'acqua è posto sopra il piatto di coltura cellulare. La distanza da sorgente a superficie (SSD) viene controllata utilizzando un indicatore di distanza ottico (F, G) o un puntatore anteriore (H, I). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

5. Saggi biologici dopo l'irradiazione

1. Dopo l'irradiazione, riportare le cellule all'incubatore di coltura cellulare nello stesso modo descritto in precedenza (passaggio 1.9, 2.8 e 3.10).
2. Se necessario, personalizza una varietà di analisi biologiche per adattarsi al progetto di ricerca.
   NOTA: Qui, mostriamo un'analisi del ciclo cellulare rappresentativo¹⁶ come esempio di un saggio biologico che segue l'irradiazione.

Per studiare l'effetto del ciclo cellulare del tasso di dose standard e dell'irradiazione extra elevata del tasso di dose da parte di un acceleratore lineare, sono stati preparati tre campioni di cellule staminali del glioma utilizzando questo protocollo e raccolti 24 h dopo l'irradiazione17: un campione di controllo che non è stato irradiato (Figura 2A), un campione irradiato con 400 MU/min (unità di monitoraggio, 4.2 Gy/min tasso di dose standard, Figura 2B) a 4 Gy, e un altro campione irradiato con 2100 MU/min (21.2 Gy/min extra high dose rate, Figura 2 C) a 4 Gy. I profili del ciclo cellulare vengono visualizzati con le percentuali di cellule in diverse fasi del ciclo cellulare.

Figura 2 : Esempio di analisi del ciclo cellulare dopo l'irradiazione a 4 Gy dell'acceleratore lineare. L'arresto del ciclo cellulare G2 è stato osservato dopo l'irradiazione di cellule staminali del glioma con una dose standard (400 MU/min) (B) o un tasso di dose extra elevato (2100 MU/min) (C) rispetto alle cellule di controllo irradiate non -A). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tabella 1: Impostazione per i tassi di dose utilizzati negli esperimenti, assumendo 4 Gy dose. MU può essere scalato linearmente per altre dosi richieste. Questi sono esempi di MU per il LINAC che abbiamo usato. Il MU deve essere calcolato per l'LINAC specifico dell'utente utilizzando l'equazione precedente.

Gli autori non hanno nulla da rivelare.