Visualizzazione della proteina Kinase un'attività nel mouse behaving fissato per la testa utilizzando la microscopia fluorescenza a due fotoinina in vivo

Summary

Viene presentata una procedura per visualizzare le attività della chinasi proteica A nei topi con problemi alla testa e che si comportano. Un giornalista di attività A-kinase migliorato, tAKAR, è espresso in neuroni corticali e reso accessibile per l'imaging attraverso una finestra cranica. La microscopia di imaging a durata della fluorescenza a due fotoni viene utilizzata per visualizzare le attività PKA in vivo durante la locomozione applicata.

Abstract

Neuromodulazione esercita un potente controllo sulla funzione del cervello. La disfunzione dei sistemi neuromodulatori si traduce in disturbi neurologici e psichiatrici. Nonostante la loro importanza, le tecnologie per monitorare gli eventi neuromodulatori con risoluzione cellulare stanno appena cominciando ad emergere. I neuromodulatori, come dopamina, noradrenalina, acetilcolina e serotonina, innescano eventi di segnalazione intracellulare tramite i rispettivi recettori accoppiati alle proteine G per modulare l'eccitabilità neuronale, le comunicazioni sinaptiche e altri neuronali funzioni, regolando così l'elaborazione delle informazioni nella rete neuronale. I neuromodulatori di cui sopra convergono sul percorso cAMP/protein a chinasi A (PKA). Pertanto, l'imaging PKA in vivo con risoluzione a singola cellula è stato sviluppato come lettura per gli eventi neuromodulatori in modo analogo all'imaging del calcio per le attività elettriche neuronali. Qui, viene presentato un metodo per visualizzare l'attività PKA a livello di singoli neuroni nella corteccia di topi che si comportano alla testa.Here, a method is presented to visualize PKA activity at the level of individual neurons in the cortex of head-fixed behaving mic. A tale scopo, viene utilizzato un giornalista di attività A-kinasi (AKAR) migliorato, chiamato tAKAR, che si basa sul trasferimento di energia di risonanza del Fàrster (FRET). Questo sensore PKA geneticamente codificato viene introdotto nella corteccia motoria tramite elettroporazione in utero (IUE) di plasmidi di DNA, o iniezione stereotassica di virus adeno-associato (AAV). I cambiamenti freT sono immagini utilizzando la microscopia di imaging a vita a durata a due fotoni (2pFLIM), che offre vantaggi rispetto alle misurazioni geometriche FRET per quantificare il segnale FRET nel tessuto cerebrale che disperde la luce. Per studiare le attività della PKA durante la locomozione forzata, tAKAR è immagine attraverso una finestra cranica cronica sopra la corteccia di topi svegli, fissati per la testa, che corrono o poggiano su un tapis roulant motorizzato a velocità controllata. Questo approccio di imaging sarà applicabile a molte altre regioni del cervello per studiare le corrispondenti attività PKA indotte dal comportamento e ad altri sensori basati su FLIM per l'imaging in vivo.

Introduction

La neuromodulazione, nota anche come trasmissione sinaptica lenta, impone un forte controllo sulla funzione cerebrale durante i diversi stati comportamentali, come lo stress, l'eccitazione, l'attenzione e la locomozione^{1,2,3, 4}. Nonostante la sua importanza, lo studio di quando e dove si svolgono eventi di neuromodulatori è ancora agli inizi. Neuromodulatori, tra cui acetilcolina, dopamina, noradrenalina, serotonina, e molti neuropeptidi, attivare G recettori accoppiati a proteina (GPCR), che a sua volta innescano percorsi di messaggeri intracellulari secondo con una vasta finestra di scale temporali che vanno da secondi a ore. Mentre ogni neuromodulatore innesca una serie distinta di eventi di segnalazione, il percorso cAMP/proteina kinase A (PKA) è un percorso a valle comune per molti neuromodulatori^1,5. Il percorso cAMP/PKA regola l'eccitabilità neuronale, la trasmissione sinaptica e la plasticità^6,7,8^,9e quindi sintonizza le dinamiche della rete neuronale. Poiché neuroni o tipi neuronali diversi esprimono diversi tipi o livelli di recettori neuromodulatori¹⁰, gli effetti intracellulari dello stesso neuromodulatore extracellulare possono essere eterogenei tra neuroni diversi e, quindi, devono essere studiato con risoluzione cellulare. Ad oggi, rimane difficile monitorare gli eventi neuromodulatori nei singoli neuroni in vivo durante il comportamento.

Per studiare la dinamica spatiotemporale della neuromodulazione, è necessaria una modalità di registrazione adeguata. La microdialisi e la cimmimetria a scansione rapida sono spesso utilizzate per studiare il rilascio di neuromodulatori, ma mancano della risoluzione spaziale per monitorare gli eventi cellulari^11,12. Analoga alla dinamica del calcio utilizzata come proxy per l'attività elettrica neuronale nell'imaging della popolazione^13,l'imaging PKA può essere utilizzato per leggere eventi neuromodulatori in una popolazione neuronale a risoluzione cellulare. Il presente protocollo descrive l'uso di un activity reporter A-kinase (AKAR) migliorato per monitorare le attività PKA in vivo durante il comportamento animale. Il metodo qui descritto consente l'imaging simultaneo di popolazioni neuronali a risoluzione subcellulare con una risoluzione temporale che tiene traccia degli eventi neuromodulatori fisiologici.

Gli AKAR sono composti da un donatore e da proteine fluorescenti accettatore collegate da un peptide del substrato pkA phosphorylation e da un dominio associato alla forchetta (FHA) che si lega al serino fosforolato o alla treonina del substrato^14,15. Al momento dell'attivazione della via PKA, il peptide substrato di AKAR viene fosforato. Di conseguenza, il dominio FHA si lega al peptide del substrato fosforilo, portando così i due fluorofori in stretta vicinanza, indicato come lo stato chiuso dell'AKAR. Lo stato chiuso di un AKAR fosforolato si traduce in un aumento del trasferimento di energia di risonanza del fàrster (FRET) tra il donatore e l'accettatore fluorofori. Poiché la percentuale di ACR al fosforo è correlata al livello di attività PKA¹⁶, la quantità di FRET in un campione biologico può essere utilizzata per quantificare il livello di attività PKA^{16,17,18, 19,20}.

Le prime versioni degli AKAR sono state progettate principalmente per l'imaging ratiometrico a due colori¹⁴. Quando si immagina più in profondità nel tessuto cerebrale, il metodo ratiometrico soffre di distorsione del segnale a causa della dispersione della luce dipendente dalla lunghezza d'onda^17,18,21. Come discusso di seguito, la microscopia per l'imaging a vita di fluorescenza (FLIM) elimina questo problema perché Il FLIM misura solo i fotoni emessi dal donatore fluoroforo^18,21. Di conseguenza, la quantificazione FLIM di FRET non è influenzata dalla profondità tissutale¹⁷. Inoltre, può essere utilizzata una variante "scura" (cioè bassa resa quantistica [QY]) del fluoroforo dell'accettatore. Questo libera un canale di colore per facilitare la misurazione multiplexata delle proprietà neuronali ortogonali tramite l'imaging simultaneo di un secondo sensore o di un marcatore morfologico^17,19,20.

L'imaging FLIM quantifica il tempo che un fluoroforo trascorre nello stato eccitato, cioè la durata della fluorescenza¹⁸. Il ritorno di un fluoroforo allo stato di terra, così la fine dello stato eccitato, spesso si contempla con l'emissione di un fotone. Anche se l'emissione di un fotone per una singola molecola eccitata è stocastica, in una popolazione la durata media della fluorescenza è una caratteristica di quel particolare fluoroforo. Quando una popolazione pura di fluorofori è eccitata contemporaneamente, la fluorescenza risultante seguirà un singolo decadimento esponenziale. La costante temporale di questo decadimento esponenziale corrisponde alla durata media della fluorescenza, che in genere varia da uno a quattro nanosecondi per le proteine fluorescenti. Il ritorno di un fluoroforo donatore eccitato allo stato di terra può avvenire anche da PARTE di FRET. In presenza di FRET, la durata della fluorescenza del fluoroforo del donatore è ridotta. Gli AKAsphorylated unphosphorylated mostrano una durata di fluorescenza del donatore relativamente più lunga. Al fosforo della PKA, il sensore presenta una vita più breve perché i fluorofori donatore e accettatore sono portati l'uno vicino all'altro e FRET è aumentato. La quantificazione della durata della fluorescenza in una popolazione di AKAR rappresenta quindi il livello di attività PKA.

Le prime versioni degli AKA non sono state utilizzate con successo per l'imaging in vivo a risoluzione a cella singola. Ciò è dovuto principalmente alla bassa ampiezza del segnale dei sensori AKAR alle attivazioni fisiologiche¹⁷. Recentemente, confrontando sistematicamente i sensori AKAR disponibili per la microscopia di imaging a durata della fluorescenza a due fotoni (2pFLIM), è stato scoperto che un sensore chiamato FLIM-AKAR ha sovraperformato i sensori alternativi. Inoltre, una serie di varianti FLIM-AKAR chiamate AKAR mirati (tAKAR) sono state sviluppate per visualizzare l'attività PKA in posizioni subcellulari specifiche: microtubuli (tAKAR), citosol (tAKAR), actina (tAKAR) , actina mentoluta (tAKAR) , membrana (tAKAR) densità postsinaptica (tAKAR). Tra i tAKARR, tAKAR ha aumentato l'ampiezza del segnale suscitata dalla noradrenalina di 2,7 volte. Questo è coerente con la conoscenza che la maggior parte della PKA nei neuroni sono ancorati ai microtubuli allo stato di riposo^22,23. il tAKAR è stato il migliore tra gli AKAR esistenti per 2pFLIM. Inoltre, tAKAR ha rilevato un'attività PKA fisiologicamente rilevante suscitata da più neuromodulatori, e l'espressione di tAKAR non ha alterato le funzioni neuronali¹⁷.

Di recente, tAKAR è stato utilizzato con successo per visualizzare le attività PKA nei mouse che si comportano alla testa¹⁷. È stato dimostrato che la locomozione forzata ha innescato l'attività PKA nel soma dei neuroni a strati superficiali (strato da 1 a 3, fino a una profondità di 300 m da pia) nel motore, nella canna e nelle cortici visive. L'attività PKA innescata dalla locomozione dipendeva in parte dalla segnalazione tramite recettori adrenergici e recettori della dopamina D1, ma non era influenzata da un antagonista del recettore della dopamina D2. Questo lavoro illustra la capacità dei tAKAR di tenere traccia degli eventi di neuromodulazione in vivo utilizzando 2pFLIM.

Nel protocollo corrente, l'intero metodo per l'imaging dell'attività PKA nei topi svegli fissati alla testa durante un paradigma di locomozione forzata è descritto in sei passaggi. In primo luogo, l'aggiunta di funzionalità 2pFLIM a un microscopio convenzionale a due fotoni (Figura 1). In secondo luogo, la costruzione di un tapis roulant motorizzato (Figura 2). In terzo luogo, l'espressione del sensore tAKAR nella corteccia del topo per elettroporazione inutero (IUE) di plasmidi di DNA, o iniezione stereotassica di virus adeno-associato (AAV). Protocolli eccellenti per interventi chirurgici per IUE^24,25 e iniezione stereotassica di particelle virali²⁶ sono stati precedentemente pubblicati. I parametri chiave che abbiamo usato sono descritti di seguito. Forth, l'installazione di una finestra cranica. Protocolli eccellenti sono stati precedentemente pubblicati per la chirurgia della finestra cranica^27,28. Vengono descritti diversi passaggi che sono stati modificati dai protocolli standard. Quinto, esecuzione in vivo 2pFLIM. Sesto, le analisi delle immagini 2pFLIM (Figura 3 e Figura 4). Questo approccio dovrebbe essere facilmente applicabile a molti altri paradigmi comportamentali fissati alla testa e aree cerebrali.

Protocol

Tutti i metodi qui descritti sono stati approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) dell'Oregon Health and Science University.

1. Configurazione del microscopio 2pFLIM

1. Installare un modulo di conteggio dei tempi di fotoni (PTCM, tabella deimateriali) e connettersi al computer (Figura 1) in base al manuale del produttore.
   NOT: Il PTCM è in genere una scheda di computer che riceve un ingresso di "sincronizzazione" per la temporizzazione dell'impulso laser e un ingresso fotone dal tubo fotomoltiplicatore (PMT). Riceve anche la temporizzazione dell'orologio per pixel, linee e cornici, dal software di controllo dell'imaging a due fotoni. Il PTCM utilizza i segnali di clock per separare i singoli fotoni in diversi pixel e fotogrammi.
2. Aggiungere un fotodiode con larghezza di banda >200 MHz per misurare la temporizzazione del laser. Posizionare un coperchio di vetro standard nel percorso della luce per riflettere una piccola frazione della luce laser nel fotodiode posizionato perpendicolare al percorso della luce (Figura 1). Collegare l'uscita fotodiode all'ingresso "sync" di PTCM.
   NOT: Molti laser moderni emetteno anche la temporizzazione laser. Per questi laser, il fotodiodo non è necessario e si può collegare direttamente l'uscita di temporizzazione laser all'ingresso di sincronizzazione del PTCM.
3. Scambiare il PMT, nel caso del tAKAR, il canale verde PMT, con un basso rumore, veloce GaAsP PMT (Figura 1). Collegare l'uscita PMT all'ingresso del segnale di PTCM.
   1. Aggiungere uno splitter di segnale opzionale (Figura 1) se si desidera un'acquisizione simultanea di intensità attraverso il canale di imaging convenzionale a due fotoni. Collegare l'uscita PMT allo splitter del segnale e collegare l'uscita dello splitter al PTCM e al modulo di imaging a due fotoni convenzionale.
      NOT: I PMT GaAsP offrono segnali a singolo fotone più veloci rispetto ai PMT bialkali convenzionali e consentono una determinazione più precisa della temporizzazione dei fotoni. Alcuni modelli di PMT GaAsP possono essere raffreddati a 10-35 gradi al di sotto della temperatura ambiente, permettendo la soppressione dei conteggi scuri ad un livello inferiore a poche centinaia al secondo (tipicamente 200 dollari/ s). Questo basso livello di rumore è importante per la misurazione precisa delle durate della fluorescenza perché il numero di fotoni di rumore non può essere facilmente distinto o sottratto dalla curva di durata della fluorescenza.
4. Aggiungere un filtro di emissione di fluorescenza passa-banda che riduca al minimo la contaminazione spettrale, se presente, dal fluoroforo dell'accettatore. Ad esempio, per tAKAR, per ridurre la contaminazione dall'accettatore sREACh, che è una proteina fluorescente gialla (YFP)^29,30scura (QY 0,07). Collegare i segnali di temporizzazione, ad esempio gli orologi per singoli pixel dell'immagine, linee e fotogrammi, a seconda del software di controllo e descritto nel manuale utente di PTCM. Installare il software di acquisizione e controllo dati appropriato.
   NOT: Alcuni produttori di PTCM (Tabella dei materiali) forniscono il loro software per l'imaging 2pFLIM. Qui, viene utilizzato un software personalizzato chiamato FLIMimage, che è stato sviluppato dallo Yasuda Lab (Max Planck Florida, tramite comunicazione personale). Questo software funziona come una funzione utente add-on per alcuni software di acquisizione a due fotoni (Tabella dei materiali). Controlla e comunica con il PTCM al momento opportuno durante l'imaging a due fotoni per acquisire immagini 2pFLIM.

2. Costruzione di un tapis roulant motorizzato

NOT: La progettazione del tapis roulant motorizzato su misura è illustrata nella Figura2.

1. Tagliare un rullo di schiuma (200 mm) a 150 mm di lunghezza con un seghetto fine. In alternativa, incollare le due metà di una palla di schiuma insieme e posizionare il nastro sopra la cucitura. Facoltativamente, incollare un tappetino di gomma con profilo sul rullo per aumentare la trazione sul rullo.
2. Forare un foro di diametro di 1/4 di pollice attraverso il centro del rullo sul lato piatto del rullo o praticare un foro di diametro di 1/4 di pollice attraverso il centro di ogni metà della palla se viene utilizzata la palla di schiuma.
3. Installare un asse d'acciaio di 1/4 di pollice attraverso il foro. Incollare il rullo/palla di schiuma all'asse utilizzando colla compatibile con la schiuma. Facoltativamente, modificare due accoppiamenti flessibili dell'albero (diametro interno da 1/4 di pollice) per rafforzare l'accoppiamento dell'asse al rullo/palla di schiuma.
   NOT: Si prega di notare che molte colle comuni possono dissolvere schiuma.
   1. Per ogni accoppiamento dell'albero, posizionare l'accoppiamento dell'albero sul lato piatto e al centro della piastra metallica rettangolare (0,7 mm x 15 mm x 76 mm). Saldare la piastra all'accoppiamento dell'albero. Forare un foro di un pollice al centro della piastra per consentire l'installazione dell'accoppiamento dell'albero modificato sull'asse e due fori a vite nella piastra metallica laterale dal centro.
   2. Installare l'accoppiamento dell'albero sull'asse contro il rullo/palla di schiuma. Se si utilizza quest'ultimo, piegare leggermente la piastra per adattarsi alla curvatura della palla. Posizionare le viti nei fori laterali per fissare il rullo/palla sull'asse.
4. Forare e toccare un filo 3/8-32 al centro di una piastra gabbia e installare l'encoder rotante. Forare un foro a vite nella base della staffa motorica ad angolo retto per consentire l'attaccamento del motore sul supporto del palo. Attaccare sia l'encoder rotante che il motore all'estremità dell'asse utilizzando un accoppiamento flessibile dell'albero.
5. Installare il tapis roulant assemblato su una scheda di pane in alluminio utilizzando i pali per il motore e l'encoder rotante (Figura 2). Collegare gli ingressi del motore al controller di velocità e l'uscita dell'encoder rotante a un ingresso analogico della scheda di acquisizione dati del computer (DAQ).
   NOT: La velocità angolare di rotazione è codificata dall'encoder rotante come tensione e viene digitalizzata utilizzando un software personalizzato chiamato AnimalTracker scritto in MATLAB.
6. Installare il supporto compatibile con la testata in una staffa ad angolo retto. Installare un palo solido sulla piastra di pane di fronte al tapis roulant e installare il supporto assemblato con la staffa di angolo retto sul palo (Figura 2). Assicurarsi che le barre del portaportadella testata siano allineate con l'asse in modo che il mouse possa adottare una posizione di marcia adeguata e confortevole sul tapis roulant (Figura 2C).

3. Espressione del sensore tAKAR nella corteccia del mouse

1. Elettroporazione in utero
   1. Preparare una soluzione di DNA per l'IUE aggiungendo lo 0,2% di concentrazione finale di colorante verde veloce (per la visualizzazione durante l'iniezione) a un DNA plasmide (3,4 g/l; i costrutti del sensore che contengono un promotore CAG, una sequenza di sensori e un virus dell'epatite di legno elemento di risposta post-trascrizione [WPRE] esaltante traslazionale) disciolto/diluito in acqua o Tris-EDTA.
   2. Preparare un topo femmina incinta a tempo (ad esempio, C57BL/6) per IUE all'E16²⁴. Anestesizzare il topo con isoflurane (4% per l'induzione e 1,5% per lamanutenzione, su 95% O2 con 5% CO 2) e applicare l'iniezione sottocutanea di analgesici peri-operatorie contenenti 5 mg/kg Meloxicam e 4 mg/kg Bupivacaine. Tagliare aprire la cavità addominale con un bisturi e un paio di forbici ed esporre con attenzione le corna uterine.
   3. Iniettare 1 L di soluzione di DNA per embrione nel ventricolo laterale di un emisfero, come descritto in precedenza²⁴.
   4. Eseguire iUE²⁴ regolari per i neuroni corticali posizionando il piede finale dell'elettrodo positivo nella corteccia e utilizzando cinque impulsi quadrati da 100 ms (38 V) a 1 Hz con un elettroporatore.
      NOTA: Diverse regioni corticali possono essere mirate per l'elettroporazione cambiando il posizionamento del piede finale dell'elettrodo rispetto al ventricolo laterale.
2. Iniezione stereotassica
   1. Preparare un topo al giorno postnatale 30 per la chirurgia stereotaxic²⁶. Anestesizzare il topo come descritto al passo 3.1.2., e applicare l'iniezione sottocutanea di analgesici peri-operatori contenenti 5 mg/kg di Carprofen.
   2. Diluire il sierotipo AAV 2/1 (AAV2/1) esprimendo hSyn-tAKAR-WPRE a un titro empiricamente determinato (1 x 10^x10 x 10¹⁰ genomi/LL) in siringa filtrata (0,2 s. a cetami di cellulosa a membrana di acetosa) di salina con buffer di fosfatio.
   3. Forare un foro di 500 m di diametro utilizzando un trapano portatile sotto uno stereomicroscopio alle seguenti coordinate per la corteccia motoria: 0,5 mm anteriore a bregma, 1,2 mm laterale a linea mediana.
   4. Montare un iniettore (ad esempio, manipolatore idraulico ad olio, con supporto per tubi a stantuffo/vetro su misura) su un manipolatore motorizzato. Posizionare l'ago di iniezione ad un angolo di 15 gradi rispetto al piano bregma-lambda. Programmare un movimento diagonale attraverso gli assi x e z, equivalente rispettivamente a una progressione di 700 e 200 m lungo gli assi anteriore-posteriore e dorsale-ventrale.
      NOT: Per evitare danni al tessuto direttamente sopra il campo di imaging previsto, le particelle AAV vengono iniettate ad angolo rispetto al piano bregma-lambda.
   5. Posizionare la punta dell'ago di iniezione al centro del foro di perforazione ed eseguire lentamente il movimento diagonale (25 m/s) descritto in precedenza. Questa procedura posizionerà il centro di iniezione a 1,2 mm anteriore a bregma, 1,2 mm laterale a linea mediana, 0,2 mm sotto il pia.
   6. Iniettare 20 nL di particelle virali diluite (10 nL/min). Attendere almeno 10 min e ritrarre lentamente l'ago di iniezione (12,5 m/s).
   7. Terminare la procedura di iniezione stereotassica e incollare/suturare la pelle²⁶.

4. Installazione della finestra Cranial

1. Eseguire il posizionamento della finestra cranica sui topi che esprimono tAKAR tramite iUE (sezione 3.1) o l'iniezione stereotassica di particelle virali (sezione 3.2), tra i giorni postnatali 30 e 60. Per i topi infettati da particelle virali, implementare la finestra cranica almeno due settimane dopo l'iniezione di virus. Installare la finestra cranica come descritto in precedenza^27,28, con i seguenti dettagli. Anestesizzare il topo come descritto nel passaggio 3.1.2., e applicare l'iniezione sottocutanea di analgesici peri-operatorii 0.075 mg/kg Buprenex e agente antinfiammatorio Dexamethasone a 4 mg/kg.
2. Rimuovere il periosteo e ritrarre il muscolo del collo. Incollare il bordo della pelle al cranio con adesivo per evitare l'esposizione della muscolatura del collo dopo l'intervento chirurgico.
3. Asciugare e rimuovere qualsiasi periosteo dal cranio raschiando delicatamente con un bisturi. Posizionare la piastra di testa di imaging (8 mm di diametro interno) per circondare il campo di imaging previsto. Incollare la testata al cranio utilizzando colla a base di cianoacrilato, seguita da cemento acrilico dentale. Per un'adesione ottimale, assicurarsi che la testata poggia sul cranio esposto ed essiccato. L'acceleratore di colla può essere utilizzato per accelerare l'indurimento.
4. Disegnare un cerchio di 5 mm di diametro sopra il campo di imaging previsto (coordinate come specificato al punto 3.2.3) utilizzando un trapano dentale ed esporre la dura mater.
5. Applicare un sottile strato di polimero trasparente, chiamato anche dura artificiale, sulla superficie dura per coprire l'intera finestra cranica. Il polimero proteggerà e stabilizzerà la dura mater. Posizionare un coperchio circolare sterile (5 mm di diametro) sulla dura mater. Fissare la coverslip con colla cianoacrilata applicata intorno ai bordi della finestra seguita da cemento acrilico dentale.

5. Microscopia Fluorescenza a 2 fotoni in vivo in vivo

1. Iniziare 2pFLIM imaging a o oltre 2 settimane dopo l'installazione della finestra cranica (sezione 4). Ridurre al minimo le interferenze sperimentali dovute allo stress mediante la movimentazione frequente e la traspuntatura del mouse prima dell'inizio dello studio di imaging per abituare il mouse.
2. Impostare la lunghezza d'onda laser di eccitazione a due fotoni a 960 nm utilizzando il software che controlla il laser a due fotoni.
3. Anestesizzare il topo utilizzando 4% isoflurane. Confermare la corretta anestesizzazione con la coda-pizzico e osservando i tassi di respirazione. Cioè, non ci dovrebbe essere risposta al pizzico di coda e la frequenza respiratoria dovrebbe essere ridotta a 1 respiro al secondo. Per ridurre al minimo il tempo procedurale non necessario e poiché l'anestesia dura solo per due o tre minuti, i lubrificanti per gli occhi non vengono utilizzati.
4. Trasferire il mouse aestizzato al tapis roulant motorizzato (Figura 2C) e montare la tela del mouse sul supporto della testata della configurazione del tapis roulant (vedere Figura 2 per i dettagli). Pulire la superficie della finestra cranica coverslip sul mouse con 70% di etanolo.
5. Posizionare il tapis roulant motorizzato con il mouse montato sotto l'obiettivo 2pFLIM. Applicare una goccia di acqua distillata tra la vetrina della finestra cranica e l'obiettivo.
6. Lasciate che il topo montato svegliarsi dall'anestesia e acclimatarsi all'ambiente del tapis roulant e del microscopio per almeno 10 min. Monitor frequenza respiratoria del mouse mentre il mouse montato si sveglia dall'anestesia.
7. Navigare verso la posizione di iniezione sotto epi-illuminazione. Documentare le caratteristiche fiduciarie (cioè i vasi sanguigni) sotto il campo luminoso per facilitare l'imaging della stessa regione di interesse (ROI) durante le successive sessioni di imaging.
8. Eliminare qualsiasi luce in entrata diversa dalla luce emessa dal tessuto cerebrale. Spegnere la sorgente luminosa dell'epiilluminazione e chiudere il recinto del rig 2pFLIM. Attivare il PMT 2pFLIM attivando il controllo della tensione del comando hardware.
9. Acquisire un'immagine z-stack 2pFLIM utilizzando il software di acquisizione 2pFLIM FLIMimage con le seguenti impostazioni consigliate per l'imaging di somata tAKAR-positivo in topo sveglio. Impostare la media dei fotogrammi su 3 fotogrammi, la velocità di scansione su 2 ms/linea, le dimensioni dell'immagine su 128 x 128 pixel e il campo visivo su 90 e 100 m. Regolare le impostazioni di imaging in base alla preparazione e alla configurazione hardware.
10. Ispezionare l'immagine acquisita in FLIMview (software personalizzato sviluppato internamente; vedere sezione 6). Regola le impostazioni di imaging seguendo il passaggio 5.9 per ottimizzare il numero di fotoni e ridurre al minimo il fotobleaching.
    NOT: Un numero di fotoni integrato utilizzabile in un ROI per l'imaging a vita di un soma tAKAR-positivo in vivo è di 1.000-10.000 di fotoni a seconda dell'ampiezza del segnale che deriva da un particolare stimolo (vedi Discussione).
    1. Se necessario, utilizzare un campo visivo ridotto, la riduzione della velocità di scansione, una maggiore potenza laser e un aumento del numero di fotogrammi da mediare per aumentare il numero di fotoni integrati e ridurre l'errore di stima della durata. Allo stesso tempo, assicurati di utilizzare la potenza laser essenziale minima, la media dei fotogrammi e la velocità di scansione per ridurre al minimo il fotosbiancamento.
11. Immagine a intervalli di tempo regolari (ad es. ogni 30-60 s) ripetendo l'acquisizione dello stack z utilizzando le impostazioni determinate nel passaggio 5.10. Acquisire immagini di base 2pFLIM per almeno 15 min alla velocità del tapis roulant zero.
12. Impostare la velocità di rotazione del tapis roulant su 15 cm/s per 15 min durante l'acquisizione di immagini 2pFLIM. Continuare l'imaging per 20 minuti dopo aver spento la rotazione del tapis roulant, per valutare la durata dell'attività PKA dopo la cessazione della locomozione forzata.

6. Analisi delle immagini 2pFLIM

1. Aprite le immagini acquisite in FLIMview e impostate i seguenti parametri in FLIMview.
   NOTA: i dettagli dei parametri sono descritti in DISCUSSIONE.
   1. Fare clic sui campi di conteggio dei singoli fotoni (SPC) di intervallo minimo e massimo in FLIMview. Immettere il valore dell'intervallo SPC minimo e massimo appropriato, in genere compreso tra 1,2 e 10-12 ns rispettivamente.
   2. Fare clic sul campo valore t₀ in FLIMview e immettere il valore t₀ (in genere 2 ns). Fate clic sul campo del valore soglia minimo di luminanza a vita in FLIMview e immettete il valore di soglia desiderato a 5-30 fotoni.
2. Fare clic sul pulsante del nuovo gruppo (N)e assegnare il nome di un gruppo di esperimenti. Verrà generato un gruppo che combina i dati di ogni immagine FLIM aggiunta.
3. Fare clic sul pulsante ROI nel modulo Controlli Roi di FLIMview e disegnare un ROI intorno a un soma tAKAR-positivo. Ridurre l'intervallo z-stack, spostando il limite z inferiore e superiore nei cursori di controllo dello stack z in FLIMview, per ridurre al minimo la contaminazione del segnale proveniente dai fotoni di sfondo in altre profondità z.
4. Fare clic sul pulsante s per aggiungere l'immagine FLIM al gruppo (passaggio 6.2). Fare clic sul pulsante Calc per calcolare la durata media (LT, denominato anche tempo medio di emissione di fotoni [MPET]), per il ROI e l'errore di stima a vita (z) .
5. Aprire il file successivo nella serie di immagini 2pFLIM cronica. Ripetere il passaggio 6.4. Assicurarsi di regolare la posizione del ROI e dell'intervallo z-stack per misurare lo stesso soma positivo al tAKAR nel corso del tempo, perché ci può essere deriva del tessuto nel tempo.
6. Selezionare deltaMPET/MPET₀ nel menu a discesa del modulo Controlli gruppo. Fare clic sul campo baseline e immettere gli indici (ad esempio, 1 2 3 4 5 per le prime cinque immagini del gruppo creato nel passaggio 6.3). In questo modo verranno definite le immagini utilizzate per calcolare la durata prevista (LT₀).
7. Fare clic su Stampa per generare un grafico contenente la risposta FLIM (LT/LT₀) di tAKAR durante l'esperimento nei ROI definiti. I cambiamenti normalizzati nella durata (SezioneLT) dei singoli ROI in base alla durata di base corrispondente (LT₀) consentono di confrontare l'attività PKA durante la locomozione tra diversi ROI.

Results

I sensori FRET-FLIM consentono la visualizzazione di molti percorsi di segnalazione diversi, tra cui il percorso cAMP/PKA coinvolto nella neuromodulazione. L'attuale protocollo utilizza il sensore tAKAR, sviluppato di recente, in combinazione con 2pFLIM per visualizzare le attività PKA nei mouse che si comportano con la testa fissa. La maggior parte dei microscopi a due fotoni esistenti può essere aggiornata con capacità 2pFLIM aggiungendo da tre a quattro componenti, come illustrato nell...

Discussion

Questo protocollo dimostra l'uso del sensore FRET-FLIM tAKAR per visualizzare l'attività PKA innescata dalla neuromodulazione nei topi che si comportano con la testa fissa. Questa applicazione si basa su test approfonditi e caratterizzazioni di tAKAR , in vitro e in vivo per dimostrare che il segnale FLIM ottenuto è rilevante per gli eventi neuromodulatori fisiologici¹⁷. Qui, un'applicazione in vivo, l'attività PKA indotta dalla locomozione nella corteccia motoria, viene utilizzata per descrivere ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0,2 μ m filtro per siringa in acetato di cellulosa	Nalgene	190-2520	Passaggio 3.2.2.
Obiettivo ad immersione in acqua 16x 0,8 NA	Nikon	MRP07220	Passaggio 5.5.
Cavo a 3 pin	US digitale	CA-MIC3-SH-NC	Passaggio 2.5. Per collegare il sensore di rotazione all'ingresso DAQ del microscopio
Breadboard in alluminio	Thorlabs	MB1012	Passaggio 2.5.
Software AnimalTracker MATLAB	N/A	N/A	Passaggio 2.5 e sezioni 5 - 6. Verrà fornito su richiesta all'autore principale
Filtro barriera passa-banda	Chroma	ET500-40m	Passaggio 1.4.
Piastra a gabbia	Thorlabs	CP01	Passaggio 2.4. Utilizzato come supporto per sensore
di rotazione Frese in acciaio al carbonio per microtrapano, diametro della punta 0,5 mm	FST	19007-05	Passaggi 3.2.3. e 4.4.
Vetrino coprioggetti circolare (diametro 5 mm)	VWR	101413-528	Passaggio 4.5.
Porta ago per iniezione su misura	N/A	N/A	Passaggio 3.2.4. Dettagli tecnici forniti su richiesta all'autore principale
Acrilico dentale	Yates Motloid	44114	Passaggi 4.3. e 4.5.
Trapano dentale; Prodotti Microtorque ii	Ram	66699	Passaggi 3.2.3. e 4.4.
Polimero trasparente Dowsil	The Dow Chemical Company	3-4680	Passaggio 4.5. Dura artificiale
Elettrodo per elettroporazione	Bex	LF650P5	Passaggio 3.1.4.
Elettroporatore	Bex	CUY21	Passaggio 3.1.4.
Verde veloce FCF	Sigma-aldrich	F7258-25G	Passaggio 3.1.1.
Software FLIMimage MATLAB	N/A	N/A	Sezione 5. Gentilmente fornito dal Dr. Ryohei Yasuda, Max Planck Florida
FLIMview software MATLAB	N/A	N/A	Sezioni 5. e 6. Verrà fornito su richiesta all'autore principale
Colla compatibile con schiuma (Gorilla White Glue)	Gorilla	5201204	Passaggio 2.3.
Piastra	di testa N/A	N/A	Passaggio 4.3. Dettagli tecnici forniti su richiesta all'autore principale
Portatarga	N/A	N/A	Passaggio 2.6. Dettagli tecnici forniti su richiesta autore principale, utilizzato in combinazione con la staffa del palo di montaggio e la staffa ad angolo retto
Micromanipolatore idraulico	Narishige	MO-10	Passaggio 3.2.4.
Colla Krazy	Colla Krazy	KG82648R	Passaggio 4.3. Colla a base di cianoacrilato
Tubo fotomoltiplicatore veloce a basso rumore	Hamamatsu	H7422PA-40 o H10769PA-40	Passaggio 1.3.
MATLAB 2012b	Mathworks	N/A	Passaggi 2.6 e sezioni 5 e 6. Utilizzato per eseguire il software di acquisizione e analisi dei dati
del microscopio	Motor Zhengke	ZGA37RG	Passaggio 2.4.
Regolatore di velocità del motore	Elenker	EK-G00015A1-1	Passaggio 2.5.
Micromanipolatore motorizzato	Sutter	MP-285	Passaggio 3.2.4.
Base di montaggio	Thorlabs	BA1S	Passaggio 2.5. Utilizzato per pali per motore e sensore in combinazione con PH4 e TR2
Palo	di montaggio Thorlabs	P14	Passaggio 2.6. Utilizzato per il supporto della piastra di testa in combinazione con PB2
Base per montante	Thorlabs	PB2	Passaggio 2.6. Utilizzato per il supporto della piastra di testa in combinazione con P14
Staffa di montaggio	Thorlabs	C1515	Passaggio 2.6. Utilizzato in combinazione con la staffa ad angolo retto e il supporto della piastra di testa
Palo ottico	Thorlabs	TR2	Step 2.5. Utilizzato per perni per motore e sensore in combinazione con BA1S e PH4
Soluzione salina tamponata con fosfato	Ν/Α	Ν/Α	Passaggio 3.2.2. Protocollo: Cold Spring Harbor Protocols 2006, doi: 10.1101/pbd.rec8247
Fotodiodo	Thorlabs	FDS010	Passaggio 1.2.
Modulo di conteggio temporizzazione	fotonica Becker e Hickl	SPC-150	Passaggio 1.1.
Plasmide: tAKAR&alfa; (CAG-tAKARα-WPRE)	Addgene	119913	Passaggio 3.1.3.
Portapalo	Thorlabs	PH4	Passaggio 2.5. Utilizzato per pali per motore e sensore in combinazione con BA1S e TR2 Staffa
ad angolo retto	Thorlabs	AB90	Passaggio 2.6 Utilizzato in combinazione con la staffa di montaggio e il supporto della piastra di testa
Encoder di rotazione	US digital MA3-A10-250-N		Passaggio 2.4.
Tappetino in gomma	Rubber-Cal	B01DCR5LUG	Passaggio 2.1.
Giunto albero (1/4 di pollice x 1/4 di pollice)	McMaster	6208K433	Passi 2.3. e 2.4.
ScanImage 3.6	Svoboda Lab/Vidrio Technology	N/A	Passaggi 5.9 e 6.1.
Splitter di segnale	Becker e Hickl	HPM-CON-02	Passaggio 1.3.1.
Asse in acciaio inox (diametro 1/4 di pollice, L = 12 pollice)	McMaster	1327K66	Passo 2.3.
Sistema di allineamento stereotassico	David kopf	1900	passaggi 3.2. e 4.1. modificato; Micromanipolatore Sutter, portaaghi per iniezione su misura, micromanipolatore idraulico
Microscopio a due fotoni	N/A	N/A	Sezione 5. Costruito sulla base del sistema modulare di microscopia multifotone in vivo (MIMMS) di HHMI Janelia Research Campus (https://www.janelia.org/open-science/mimms)
Adesivo tissutale Vetbond	3M	14006	Passaggio 3.2.6.
Virus: tAKARα (AAV2/1 hSyn-tAKARα-WPRE)	Addgene	119921	Passaggio 3.2.2.
Rullo in schiuma PE bianco (8 pollici x 12 pollici)	Imprese di fabbricazione INC.	30-2261	Passaggio 2.1.1.
Polistirene bianco per metà sfera	GrahamSweet	200 mm diametro 2 metà cave	Passaggio 2.1.1.
Zipkicker	PACER	PT29	Passaggio 4.3. Acceleratore di indurimento