Articolo metodologico

Valutazione del nucleo di lenti zebrafish localizzazione e integrità suturale

DOI:

10.3791/59528

⸱

6 maggio 2019

 ,  , 
1Department of Physiology and Biophysics, University of California, Irvine, 2Department of Developmental and Cell Biology, University of California, Irvine

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questi protocolli sono stati sviluppati per analizzare la morfologia delle lenti corticali, l'integrità strutturale delle suture delle lenti pesce zebra in lenti fisse e Live e per misurare la posizione del nucleo della lente pesce zebra lungo l'asse anteriore-posteriore.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il pesce zebra è particolarmente adatto alla manipolazione genetica e all'imaging in vivo , rendendolo un modello sempre più diffuso per gli studi genetici inversi e per la generazione di transgeniche per l'imaging in vivo . Queste capacità uniche rendono il pesce zebra una piattaforma ideale per studiare lo sviluppo e la fisiologia delle lenti oculari. I nostri recenti risultati che un aquaporin-0, Aqp0a, è necessario per la stabilità della sutura dell'obiettivo anteriore, così come per lo spostamento del nucleo della lente al centro dell'obiettivo con l'età ci ha portato a sviluppare strumenti particolarmente adatti ad analizzare le proprietà delle lenti pesce zebra. Qui delineamo metodi dettagliati per la dissezione delle lenti che possono essere applicate sia alle lenti larvale che agli adulti, per prepararle per l'analisi istologica, l'immunoistochimica e l'imaging. Ci concentriamo sull'analisi dell'integrità della sutura dell'obiettivo e della morfologia delle cellule corticali e confrontiamo i dati generati dalle lenti dissezionate con i dati ottenuti dall'imaging in vivo della morfologia delle lenti resa possibile da una nuova linea di pesce zebra transgenica con un geneticamente marcatore fluorescente codificato. L'analisi delle lenti dissezionate perpendicolari al loro asse ottico consente di quantificare la posizione relativa del nucleo dell'obiettivo lungo l'asse anteriore-posteriore. Il movimento del nucleo dell'obiettivo da una posizione anteriore iniziale al centro è necessario per le ottiche lente normali nel pesce zebra adulto. Pertanto, una misura quantitativa della posizione nucleare dell'obiettivo è direttamente correlata alle sue proprietà ottiche.

Introduzione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il pesce zebra è un ottimo modello per studiare lo sviluppo e la fisiologia delle lenti a causa delle somiglianze anatomiche con le lenti dei mammiferi, la relativa facilità di manipolazione genetica e farmacologica, la velocità di sviluppo embrionale degli occhi, le piccole dimensioni e la trasparenza fasi iniziali che consentono l'imaging in vivo . I metodi qui descritti sono stati sviluppati per analizzare la morfologia delle lenti pesce zebra a stadi embrionali e adulti con particolare attenzione all'integrità suturale, alla morfologia della membrana corticale in vitro e in vivoe alla posizione della posizione nucleare dell'obiettivo lungo la asse anteriore-posteriore ex vivo. Questi metodi fungono da punto di partenza per gli studi funzionali sullo sviluppo e la fisiologia delle lenti, nonché sugli schermi genetici inversi per i fenotipi delle lenti nel pesce zebra.

Imaging morfologia delle lenti pesce zebra

Aquaporin 0 (AQP0) è la proteina di membrana della lente più abbondante ed è fondamentale per entrambi, lo sviluppo della lente e la chiarezza, a causa di molteplici funzioni essenziali nei mammiferi. I zebrafish hanno due Aqp0s (Aqp0a e Aqp0b) e abbiamo sviluppato metodi per analizzare la perdita delle loro funzioni sia nelle lenti embrionali che in quelle adulte. I nostri studi rivelano cheaqp0a-/-mutanti sviluppano opacità polare anteriore a causa dell'instabilità della sutura anteriore, e aqp0a/b doppi mutanti sviluppano opacità nucleare1. AQP0 ha dimostrato di svolgere ruoli nel trasporto dell'acqua2, adesione3,4, citoscheletro ancoraggio5 e generazione del gradiente indice di rifrazione6, ma questi studi sono stati in gran parte eseguiti in in vitro. Il pesce zebra fornisce un'opportunità unica per studiare come la perdita di funzione o la funzione perturbata di Aqp0a o Aqp0b influenzerebbero la morfologia e la funzione in una lente vivente. Per valutare la morfologia delle cellule lente e l'integrità suturale durante lo sviluppo, abbiamo modificato i metodi immunoistochimici esistenti in vitro 7 per l'uso in lenti embrionali e adulte, e hanno generato transgenici per monitorare questo processo in vivo .

L'analisi immunoistochimica della struttura della membrana plasmatica e dell'integrità suturale è stata eseguita in embrioni fissi interi e lenti per adulti. Le lenti zebrafish sono estremamente piccole (il diametro della lente è ~ 100 μm in embrioni e fino a 1 mm negli adulti) rispetto ai loro omologhi di mammiferi e hanno punti di sutura8, che sono raramente catturati in criosezioni. Pertanto, le lenti intere sono essenziali per l'analisi dell'integrità suturale. Per l'analisi in vivo della formazione di sutura anteriore e per l'imaging di un'architettura delle cellule lente precisa, abbiamo generato delle transgeniche che esprimono Mapple etichettando specificatamente le membrane delle lenti.

I vantaggi dell'Imaging Live della membrana transgenica delle lenti includono: 1) evitando artefatti di fissazione, 2) studiando cambiamenti morfologici dinamici nei film time-lapse e 3) consentendo studi longitudinali in cui gli eventi precedenti possono essere correlati con i successivi Fenotipi. La pigmentazione dell'iride normalmente previene la chiara Imaging della periferia dell'obiettivo. L'aggiunta di 1-phenyl 2-Thiourea (PTU) prima della Primordia-5 (prim-5) fase9 previene la melanogenesi e la pigmentazione oculare fino a circa 4 giorni dopo la fertilizzazione (DPF). Tuttavia, dopo 4 DPF, la periferia dell'obiettivo è oscurata in vivo, in particolare nelle fasi più vecchie. Inoltre, la densità della lente stessa oscura l'imaging del suo palo posteriore. Pertanto, per studiare la morfologia della periferia della lente, o la sutura posteriore, dopo 4 DPF, le lenti devono essere asportate e fissate.

Le linee pesce zebra transgeniche sono state utilizzate per analizzare la struttura della membrana embrionale della lente in vivo10. L' Q01 transgenici esprime una proteina ciano fluorescente fusa ad una sequenza di targeting per membrana, Gap43, guidata dal promotore EF1α e un ESAMER dell'elemento DF4 PAX6 Enhancer onnipresente nelle cellule della fibra ottica11. Q01 ha un'espressione extra-lenticolare, comprese le cellule amacrine nella retina, che aggiunge il segnale di fondo se l'interesse primario è l'obiettivo. Abbiamo sviluppato una nuova linea transgenica che esprime un mApple legato a membrana specificamente nella lente, con l'obiettivo di evitare qualsiasi segnale extra-lenticolare.

Localizzazione del nucleo dell'obiettivo

Abbiamo scoperto che il nucleo della lente si muove da una posizione anteriore iniziale nel pesce zebra larvale in una posizione centrale nell'asse anteriore-posteriore nelle lenti adulte. Questo cambiamento nella posizione del nucleo dell'obiettivo ad alto indice di rifrazione è pensato per essere un requisito per lo sviluppo normale dell'ottica delle lenti pesce zebra1. I nostri metodi consentono la quantificazione della centralizzazione nucleare dell'obiettivo in relazione al raggio della lente. Utilizzando questo metodo, abbiamo mostrato che Aqp0a è necessario per la centralizzazione nucleare dell'obiettivo1, e questo metodo semplice può essere applicato ad altri studi dello sviluppo e della fisiologia della lente e delle sue proprietà ottiche nel modello pesce zebra.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Protocollo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

I protocolli animali utilizzati in questo studio aderiscono alla dichiarazione ARVO per l'uso degli animali nella ricerca oftalmica e visiva e sono stati approvati dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali (IACUC) dell'Università della California, Irvine.

1. allevamento di zebrafish e eutanasia

  1. Sollevare e mantenere il pesce zebra (ceppo AB) in condizioni di laboratorio standard12. Sollevare embrioni nel mezzo embrionale (EM)12. Aggiungere 0,003% PTU a EM da 20-24 h post fertilization (prima della fase Prim-5) per prevenire la formazione di pigmenti in embrioni12 utilizzati per l'imaging a stadi embrionali9. Sollevare le larve da 6-30 giorni dopo la fertilizzazione (DPF) su una dieta di rotiferi vivi fino a 14 DPF, e l'Artemia vivo dopo 14 DPF12.
    Attenzione: PTU è molto tossico
  2. Anestetizzare il pesce usando la tricaina fino a non rispondere al tatto.
    1. Preparare il brodo di tricaina combinando 400 mg di acidethylester 3-amino benzoico, con 2,1 mL di tris di 1 M (pH 9), in 100 mL di ddH2O. regolare a pH 7,0 e conservare a-20 ° c.
      Attenzione: La tricaina è tossica.
    2. Diluire 4,2 mL di brodo di tricaina in 100 mL di acqua del serbatoio per anestetizzare le larve/gli adulti o in EM per anestetizzare gli embrioni (concentrazione finale di tricaina al 0,0165% p/v).

2. fissazione di embrioni e larve

Nota: I protocolli immunoistochimici sono stati adattati dai materiali precedentemente pubblicati7.

  1. Fissare gli embrioni dechorionati o le larve fino a 2 settimane dopo la fertilizzazione nel 4% (v/v) di paraformaldeide (PFA) in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) durante la notte a 4 ° c su un rocker.
    Attenzione: Il PFA è combustibile ed è cancerogeno.
  2. Lavare gli embrioni tre volte per 10 minuti in PBS, e permeabilizzare in PBS con 10% Triton e 1% DMSO (PBS-T) durante la notte a 4 ° c.
    Attenzione: DMSO è tossico, è dannoso per ingestione o assorbimento cutaneo, trasporta materiali pericolosi attraverso la pelle, ed è combustibile. Triton è tossico, corrosivo ed è pericoloso per gli ambienti acquatici.

3. dissezione delle lenti larvale e zebrafish adulte

  1. Anestetizzare i pesci da 6 larve di DPF fino all'età adulta con la tricaina fino a non rispondere al tatto ma mostrando ancora un forte battito cardiaco. Misurare la lunghezza standard del pesce come da Schilling (2002) per la messa in scena13.
  2. Immediatamente accise gli occhi utilizzando le forbici di micro-dissezione e mettere in un piatto di dissezione in PBS (Figura 2 mostrato per gli occhi adulti).
    1. Creare un piatto personalizzato 35 mm riempito con silicone per dissezioni lente. Una volta che il silicone ha impostato, accisa un divot intorno 2-3 mm di diametro e 0,5 mm di profondità per immobilizzare gli occhi adulti/lenti durante la dissezione.
  3. Dissezione di lenti pesce zebra adulte
    1. Posizionare un occhio adulto nel piatto divot lato posteriore fino riempito con PBS. Immobilizzare l'occhio inserendo pinze a < angolo di 45 ° attraverso il disco ottico. Fare attenzione a non Nick o comprimere l'obiettivo. Effettuare due o tre incisioni radiali attraverso la retina e la sclera dal disco ottico alla zona ciliare con forbici di dissezione.
    2. Staccare la retina e sclera come petali di fiori e invertire l'occhio, lato cornea verso l'alto. Immobilizzare la lente indirettamente attraverso la manipolazione della sclera e della cornea con il lato piatto delle forbici, mentre tirando via la retina e i tessuti attaccati con pinze. Tagliare con cautela il tessuto in eccesso dall'obiettivo.
      Nota: È fondamentale sezionare con attenzione per ottenere lenti costantemente sane.
  4. Dissezione delle lenti a pesce zebra larvale
    1. Posizionare un occhio larvale lato posteriore verso l'alto sulla parte piatta del piatto di silicone riempito con PBS e utilizzare un ago di tungsteno affilato per fare tagli radiali attraverso la retina e sclera, mentre immobilizzare l'occhio con un altro ago di tungsteno o pinze.
      Nota: Fare attenzione a non danneggiare l'obiettivo.
      1. Affilare la punta di una lunghezza di 2 cm di 0,1 mm di filo di tungsteno elettrolticamente sospendendo la punta del filo in 10% (w/v) NaOH e applicando una bassa tensione corrente alternata14. Fissare l'ago in una pipetta Pasteur sciogliendo l'estremità in vetro utilizzando un bruciatore Bunsen.
        Nota: Possono essere utilizzati anche strumenti alternativi di dissezione.
        Attenzione: NaOH è corrosivo.
    2. Estrarre delicatamente la lente dall'occhio dissociato con un lato smussata dell'ago e tirare con cautela il tessuto attaccato.

4. fissazione delle lenti Dissected

  1. Fissare immediatamente lenti sezionato in 1,5% (v/v) PFA in PBS per 24 h a temperatura ambiente (RT). Lavare le lenti tre volte in PBS per 10 min ciascuno.
  2. Lenti permeabilize per analisi di montaggio integrale o crioprotezione per criosectioning (vedere paragrafo 8).
    1. Lenti permeabilize in PBS-T per una notte a 4 ° c.

5. immunoistochimica dell'obiettivo

  1. Etichettare le membrane delle lenti fisse embrionali/larvale o adulte per incubazione in Phalloidin-Alexa Fluor 546 (1:200) e nuclei cellulari con DAPI (1:1000 di 5 mg/ml di brodo) in PBS-T durante la notte a 4 ° c.
    Attenzione: DAPI è un irritante per la pelle e gli occhi.
  2. Lavare tre volte con PBS-T per 10 min ciascuno. Tessuto trasparente per incubazione in 30%, 50% e 70% glicerolo in PBS-T (v/v) per almeno 1 h a RT ciascuno, o durante la notte a 4 ° c.
  3. Montare il pesce in 70% glicerolo in PBS-T (v/v) sul fondo di vetro 35 mm piatti microtitolazione con gli occhi come piatto e dritto contro il coperchio scivolare il più possibile. Per i pesci più giovani, una leggera inclinazione anteriore-laterale può aiutare a orientare la sutura dell'obiettivo in parallelo al vetrino coprioggetti.

6. analisi delle suture lente anteriori zebrafish utilizzando una linea transgenica in vivo

  1. Generare linee TG (βB1cry: mAppleCAAX) utilizzando il kit Tol215. Il sistema di elementi traibili Tol215 consente l'integrazione stabile del costrutto in cui Mapple è guidata da 300 BP del promotore umano βb1-crystallin16 legato alla membrana dalla sequenza CAAX con conseguente espressione in particolare nelle membrane delle cellule delle fibre ottiche.
    Nota: Questo costrutto (ID: 122451) è disponibile per l'acquisto.
    1. La mattina dell'iniezione, preparare la miscela di iniezione e mantenere il ghiaccio. Per raggiungere un volume finale di 10 μL di contenente RNasi-e DNase-Free H2O, aggiungere: 1,5 μl di ogβb1grido: mAppleCAAX DNA costrutto a 50 ng/μl-[0.375-0,75 PG/iniezione finale], 1,5 μl di Tol2 Traacasi mRNA a 300 ng/μl (Tol2 kit)15 [15-30 iniezione finale], e 1 μL di indicatore rosso fenolo all'1% p/v [1 X10-5% (p/v)/iniezione finale].
    2. Iniettare 50-100 pL di miscela di iniezione in embrioni di stadio a 1 cellula12.
  2. Misurare l'efficienza della transgenesi negli embrioni iniettati F0 misurando la frequenza degli embrioni con le lenti positive mApple a 3 DPF.
    Nota: Aspettatevi di avere > 80% di efficienza transgenesi utilizzando questo metodo. I mosaici F0 consentono un'analisi dettagliata delle morfologie delle membrane delle singole cellule. I vari livelli di mosaicismo consentono di immagini le morfologie di singoli o piccoli gruppi di cellule, mentre l'espressione più globale dell'obiettivo consente l'analisi di strutture multicellulari come le suture lente in vivo.
  3. Outcross F0 pesce mosaico per generare linee stabili, che etichettare tutte le membrane delle cellule di fibra. I fondatori di F0 con il transgene integrato nella linea germinale generano prole con integrazioni stabili che possono essere mantenute come linee transgeniche.

7. analisi delle suture lente anteriore zebrafish utilizzando una linea transgenica in vivo

  1. Anestetizzare 3 DPF o mosaico per adulti o pesci transgenici stabili e montare in 1% di agarosio a bassa fusione (LMA) con tricaina con l'occhio piatto contro il coperchio scivolare di piatti microtitolazione fondo di vetro.
    1. Sciogliere 1 g di LMA in 100 mL di EM (senza blu di metilene) per fare l'1% di LMA. Conservare a lungo termine come scorte da 15 mL a 4 ° c. Microonde per sciogliere il brodo e conservare a 42 ° c fino a quando viene utilizzato ogni tubo.
  2. Coprire il pesce fino a 6 DPF con EM con tricaina, o con acqua del serbatoio con tricaina per gli adulti quando LMA è impostato.
    1. Mescolare 5 mL di EM senza blu di metilene o acqua del serbatoio con 250 μL di stock di tricaina e 7 μL di PTU se Imaging PTU trattati con pesce.

8. Criosectioning delle lenti e immunoistochimica

  1. Crioproteggere gli embrioni fissi o le lenti adulte inserendo nel 10% di saccarosio in PBS (w/v), il 20% di saccarosio per 1 h a RT ciascuno (o la notte a 4 ° c) e la notte in saccarosio al 30% a 4 ° c.
  2. Incorporare il tessuto in OCT negli stampi di base, quindi congelare i mandrini con OCT. Criosezione a 12-14 μm e raccogliere su vetrini per microscopio SuperFrost/Plus. Sezioni calde su slitta per 10 minuti su uno scaldabiberon preriscaldato a ~ 35 ° c.
  3. Lavare le sezioni tre volte con PBS per 10 min ciascuno. Etichettare le sezioni con Phalloidin-Alexa Flour 546 (1:200) con DAPI (1:1000) o WGA-Alexa Flour 594 (1:200), seguita da tre Lavini PBS. Montare con mezzo di montaggio anti-dissolvenza, e sigillare coprioggetto con smalto per unghie.

9. immagini di imaging

  1. Acquisisci immagini con un microscopio confocale. Acquisire pile z o sezioni ottiche utilizzando un obiettivo di immersione in acqua 60x N/A 1,2, o simile, in regioni specifiche dal palo dell'obiettivo anteriore a quello posteriore. Utilizzare le seguenti impostazioni di acquisizione: 1,2 disco arioso utilizzando il laser 561 Nm, il filtro rosso Texas per Phalloidin-Alexa farina 546 o mApple, o il laser 405 con il filtro UV per DAPI.
  2. Corretta potenza laser a intensità z per contrastare la perdita di segnale con la profondità nell'obiettivo. Questo permette un segnale forte al polo posteriore di embrioni fissi e vivi 3 DPF, e forte segnale in fette ottiche equatoriali in lenti per pesci adulti.
  3. Compila e visualizza le immagini utilizzando il software di elaborazione delle immagini.

10. misurazione della localizzazione del nucleo dell'obiettivo nell'asse anteriore-posteriore

  1. Orientare le lenti appena asportate assialmente in PBS in un piatto da 35 mm con fondo in vetro coprenti, con pali e suture orientati parallelamente al piano di messa a fuoco. Cercare una differenza nell'indice di rifrazione, che di solito si verifica all'interfaccia della corteccia dell'obiettivo e del nucleo dell'obiettivo per identificare il nucleo della lente.
    Nota: Le lenti sane per adulti di tipo selvaggio sono estremamente trasparenti, rendendo difficile vedere le suture e il nucleo dell'obiettivo o determinare l'orientamento dell'obiettivo. In questo caso, un lieve Nick con pinze alla capsula dell'obiettivo provoca danni minori, il che rende evidenti le suture e il nucleo dell'obiettivo in circa 10 minuti, contribuendo a orientare l'obiettivo per questa misura. Tuttavia, le lenti diventano inutilizzabili per le applicazioni a valle in quanto sono ora danneggiate.
  2. Scattare immagini di lenti con il nucleo della lente a fuoco sotto illuminazione di campo luminoso con o senza ottica DIC utilizzando un microscopio di dissezione con una fotocamera allegata. Immagine di un micrometro sotto lo stesso ingrandimento per la calibrazione.
    1. Fare clic sul pulsante Live View, regolare le impostazioni di esposizione per visualizzare il nucleo della lente e la periferia dell'obiettivo e scattare un'immagine facendo clic sul pulsante scatto. Salva come file TIF.
    2. Utilizzare il software di elaborazione immagini per calibrare le immagini delle lenti acquisite. Selezionare lo strumento linea retta e tracciare una linea di lunghezza nota sull'immagine del micrometro, fare clic su analizza | impostare la scala. Immettere la distanza nota, le unità e selezionare la calibrazione "globale" e fare clic su OK.
  3. Misurare la distanza del centro del nucleo dell'obiettivo con il Polo anteriore (a-r).
    1. Utilizzare lo strumento di linea diritta nel software di elaborazione delle immagini per tracciare una linea attraverso il centro immaturato del nucleo dell'obiettivo in un orientamento assiale. Prendi il centro di questa linea come centro del nucleo dell'obiettivo.
    2. Disegna un'altra linea da questo punto al Polo anteriore dell'obiettivo e seleziona ' misura ' nel menu ' analizza ' per misurare la distanza (a-r), dove a è il raggio dell'obiettivo e r è la distanza dal centro dell'obiettivo al centro del nucleo.
    3. Tracciare un'altra linea dalla parte anteriore ai pali posteriori e misurare questa distanza come il diametro della lente (2a). Copiare queste lunghezze dalla finestra "risultati" e trasferirle in un foglio di calcolo o in un programma statistico.
      Nota: È più facile misurare con precisione dal centro del nucleo al palo anteriore, che misurare dal centro del nucleo della lente al centro dell'obiettivo. Questa misura viene convertita dalla formula in Step 10.3.5 per riportare la distanza del centro del nucleo dell'obiettivo al centro dell'obiettivo. Utilizzare sempre il nucleo adulto per le misurazioni, anche se il nucleo embrionale è evidente.
    4. Dividere il diametro per 2, per calcolare il raggio dell'obiettivo, a.
    5. Calcola r/a, come figure-protocol-1 , che è la localizzazione normalizzata del nucleo dell'obiettivo rispetto al raggio dell'obiettivo.
      Nota: per un nucleo posizionato più vicino al palo anteriore, r/a sarà > 0.0, mentre un nucleo localizzato centralmente avrà una r/a di 0,0.
  4. Grafico del registro della misura del nucleo assiale normalizzato come funzione della lunghezza standard per determinare i cambiamenti nella localizzazione del nucleo dell'obiettivo durante lo sviluppo del pesce zebra.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Risultati

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L'anatomia degli occhi di pesce zebra adulto assomiglia molto a quella dei mammiferi (Figura 1a). Nonostante alcune differenze tra gli occhi di pesce zebra e mammiferi, come avere una zona ciliare invece di un corpo ciliare17, differenze nelle proprietà ottiche18, e differenze nella morfogenesi durante lo sviluppo embrionale19, il pesce zebra Eye è un ottimo modello per studiare lo svilup...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Discussione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L'analisi della morfologia delle lenti pesce zebra è il primo passo nella comprensione dei fenotipi nei mutanti, o degli effetti degli interventi farmacologici finalizzati allo studio della biologia della lente oculare. Delineamo metodi per analizzare le suture lente, la morfologia delle cellule della fibra corticale e gli aspetti del nucleo della lente. Questi approcci sono una combinazione di in vitro e in vivo (rispetto alla tabella 1). I metodi in vitro consentono un maggio...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Dichiarazioni

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Non abbiamo divulgazioni.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Vorremmo riconoscere la nostra fonte di finanziamento: NIH R01 EY05661 a J. E. H, Ines Gehring per aver assistito alla generazione del aqp0a/b doppio mutanti e allevamento di pesce zebra, Dr Daniel dranow per le discussioni che portano alla generazione dei transgenici, il dottor Bruce I laboratori di Blumberg e Dr Ken Cho per l'uso dei loro microscopi dissezione, e il dottor Megan Smith per l'aiuto con l'analisi statistica.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
1-fenil-2-tiourea (PTU)SigmaP7629ATTENZIONE - soluzione
acquosa di paraformaldeide al 4%Microscopia elettronica ScienzeRT 157-4ATTENZIONE - pericolo per la salute, combustibile
Microscopio confocaleNikonEclipse Ti-E
CryostatLeicaCM3050STemperatura dell'obiettivo e della camera impostata su -21 e Deg; C
DAPIInvitrogenD1306ATTENZIONE - irritante per gli occhi e la pelle
Dimetil solfossido (DMSO)Fisher ScientificD128ATTENZIONE - combustibile, penetra nella pelle
Stampo base monousoVWR Scientific15154-631
Pipette monouso in vetro PasteurFisherbrand13-678-20A
Dumont #5 pinzeDumont & FilsMantieni la pinza affilata
Etile 3-amminobenzoato sale metanosulfonato (Tricaina)Sigma-AldrichA5040ATTENZIONE - tossico
Piatto per micropozzetti con fondo in vetro (piastra di Petri da 35 mm, micropozzetto da 14 mm, vetro di copertura #1.5)MatTek CorporationP35G-1.5-14-C
GliceroloSigmaG2025
huβ B1cry:mAppleCAAX DNA constructAddgeneID:122451
ImageJWayne Rasband, NIHv1.51n
Low Melt Agarose (LMA)Apex902-36-6
NIS-ElementsNikonV 4.5
NIS-Elements AR softwareNikon
Olympus  con un modello 2.1.1.183 controllerOlympus CorpMicroscopio DP70
Olympus Olympus CorpSZX12
Falloidina-Alexa Farina 546Thermo FisherA22283
Fenolo Indicatore rosso (1% p/v)Ricca Chemical Company5725-16
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)Fisher ScientificBP399
PhotoshopAdobeCS5 v12.0
Photoshop SoftwareAdobeCS5 v12.0
Piano Apo 60x/1.2 WD obiettivoNikon
Fonte di alimentazioneWild HeerbruggMTr 22O fonte di alimentazione equivalente 
Scaldavetrini modello n. 26020FSFisher Scientific12-594
Perle di idrossido di sodioFisher ScientificS612-3ATTENZIONE - corrosivo/irritante per gli occhi e la pelle, organo bersaglio - sistema respiratorio, corrosivo per metalli
Vetrino per microscopio Superfrost/PlusFisher Scientific12-550-15
Sylgard 184 silicone Dow CorningWorld Prevision Instruments
Tissue-Tek O.C.T. CompoundSakura Finetek4583
Triton X-100 BioXtraSigmaT9284ATTENZIONE – Forbici per microdissezione Vannas tossiche, pericolose per l'ambiente acquatico, corrosive
Ted Pella Inc1346Punte dritte affilate/affilate
Vectashield mezzo di montaggio antisbiadimentoLaboratori vettorialiH-1000
Agglutinina del germe di grano (WGA)-Alexa Flour-594Life TechnologiesW11262
molto tossica SYLG184

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Vorontsova, I., Gehring, I., Hall, J. E., Schilling, T. F. Aqp0a Regulates Suture Stability in the Zebrafish Lens. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 59 (7), 2869-2879 (2018).
  2. Hall, J. E., Mathias, R. T. The Aquaporin Zero Puzzle. Biophysical Journal. 107 (1), 10-15 (2014).
  3. Nakazawa, Y., Oka, M., Funakoshi-Tago, M., Tamura, H., Takehana, M. The Extracellular C-loop Domain Plays an Important Role in the Cell Adhesion Function of Aquaporin 0. Current Eye Research. 42 (4), 617-624 (2017).
  4. Kumari, S. S., Varadaraj, K. Intact AQP0 performs cell-to-cell adhesion. Biochemical and Biophysical Research Communications. 390 (3), 1034-1039 (2009).
  5. Lindsey Rose, K. M., et al. The C Terminus of Lens Aquaporin 0 Interacts with the Cytoskeletal Proteins Filensin and CP49. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (4), 1562-1570 (2006).
  6. Kumari, S. S., Varadaraj, K. Aquaporin 0 plays a pivotal role in refractive index gradient development in mammalian eye lens to prevent spherical aberration. Biochemical and Biophysical Research Communications. 452 (4), 986-991 (2014).
  7. Uribe, R. A., Gross, J. M. Immunohistochemistry on Cryosections from Embryonic and Adult Zebrafish Eyes. Cold Spring Harbor Protocols. 2007 (7), (2007).
  8. Dahm, R., Schonthaler, H. B., Soehn, A. S., van Marle, J., Vrensen, G. F. J. M. Development and adult morphology of the eye lens in the zebrafish. Experimental Eye Research. 85 (1), 74-89 (2007).
  9. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).
  10. Greiling, T. M. S., Clark, J. I. Early lens development in the zebrafish: A three-dimensional time-lapse analysis. Developmental Dynamics. 238 (9), 2254-2265 (2009).
  11. Godinho, L., et al. Targeting of amacrine cell neurites to appropriate synaptic laminae in the developing zebrafish retina. Development. 132 (22), 5069-5079 (2005).
  12. Westerfield, M. The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). , University of Oregon Press. (2002).
  13. Schilling, T. F. Zebrafish. Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. 261, Oxford University Press. 59-94 (2002).
  14. Brady, J. A simple technique for making very fine, durable dissecting needles by sharpening tungsten wire electrolytically. Bulletin of the World Health Organization. 32 (1), 143-144 (1965).
  15. Kwan, K. M., et al. The Tol2kit: A multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs. Developmental Dynamics. 236 (11), 3088-3099 (2007).
  16. Hou, H. H., Kuo, M. Y. P., Luo, Y. W., Chang, B. E. Recapitulation of human βB1-crystallin promoter activity in transgenic zebrafish. Developmental Dynamics. 235 (2), 435-443 (2006).
  17. Soules, K., Link, B. Morphogenesis of the anterior segment in the zebrafish eye. BMC Developmental Biology. 5 (1), 12(2005).
  18. Greiling, T. M. S., Clark, J. I. The transparent lens and cornea in the mouse and zebra fish eye. Seminars in Cell & Developmental Biology. 19 (2), 94-99 (2008).
  19. Greiling, T. M. S., Aose, M., Clark, J. I. Cell Fate and Differentiation of the Developing Ocular Lens. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (3), 1540-1546 (2010).
  20. Richardson, R., Tracey-White, D., Webster, A., Moosajee, M. The zebrafish eye-a paradigm for investigating human ocular genetics. Eye. 31, 68(2016).
  21. Gestri, G., Link, B. A., Neuhauss, S. C. F. The Visual System of Zebrafish and its Use to Model Human Ocular Diseases. Developmental Neurobiology. 72 (3), 302-327 (2012).
  22. Chhetri, J., Jacobson, G., Gueven, N. Zebrafish on the move towards ophthalmological research. Eye. 28 (4), 367-380 (2014).
  23. Lim, J. C., Walker, K. L., Sherwin, T., Schey, K. L., Donaldson, P. J. Confocal Microscopy Reveals Zones of Membrane Remodeling in the Outer Cortex of the Human Lens. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 50 (9), 4304-4310 (2009).
  24. Lim, J. C., Vaghefi, E., Li, B., Nye-Wood, M. G., Donaldson, P. J. Characterization of the Effects of Hyperbaric Oxygen on the Biochemical and Optical Properties of the Bovine LensEffects of HBO on the Bovine Lens. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 57 (4), 1961-1973 (2016).
  25. Gold, M. G., et al. AKAP2 anchors PKA with aquaporin-0 to support ocular lens transparency. EMBO Molecular Medicine. 4 (1), 15-26 (2012).
  26. Petrova, R. S., Schey, K. L., Donaldson, P. J., Grey, A. C. Spatial distributions of AQP5 and AQP0 in embryonic and postnatal mouse lens development. Experimental Eye Research. 132, 124-135 (2015).
  27. Chee, K. N., Vorontsova, I., Lim, J. C., Kistler, J., Donaldson, P. J. Expression of the sodium potassium chloride cotransporter (NKCC1) and sodium chloride cotransporter (NCC) and their effects on rat lens transparency. Molecular Vision. 16, 800-812 (2010).
  28. Hayes, J. M., et al. Integrin α5/fibronectin1 and focal adhesion kinase are required for lens fiber morphogenesis in zebrafish. Molecular Biology of the Cell. 23 (24), 4725-4738 (2012).
  29. Imai, F., Yoshizawa, A., Fujimori-Tonou, N., Kawakami, K., Masai, I. The ubiquitin proteasome system is required for cell proliferation of the lens epithelium and for differentiation of lens fiber cells in zebrafish. Development. 137 (19), 3257-3268 (2010).
  30. Biswas, S. K., Lee, J. E., Brako, L., Jiang, J. X., Lo, W. K. Gap junctions are selectively associated with interlocking ball-and-sockets but not protrusions in the lens. Molecular Vision. 16, 2328-2341 (2010).

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Ristampe e permessi

Richiedi il permesso di riutilizzare il testo o le figure di questo articolo JoVE

Richiedi permesso

Tag

Sutura del cristallinoDissezione del cristallinoAnalisi istologicaImmunoistochimicaImaging in vivoMarcatore fluorescenteAsse otticoDiametro del cristallino

Articoli correlati