Ex Vivo espansione di cellule staminali da cordone ombelicale umano derivate dal sangue CD34+ cellule utilizzando acido valproico

Sommario

Qui, descriviamo l'ex espansione vivo di cellule staminali ematopoietiche da CD34⁺ le cellule derivate dal sangue del cordone ombelicale trattati con una combinazione di una citochina cocktail e VPA. Questo metodo conduce ad un grado significativo di ex espansione vivo di HSCs primitivo per una clinica o applicazioni di laboratorio.

Abstract

Cordone ombelicale unità di sangue (UCB) forniscono una fonte alternativa di cellule staminali ematopoietiche (HSCs) per pazienti che richiedono il trapianto allogenico di midollo osseo. Mentre UCB ha diversi vantaggi unici, il numero limitato di HSCs all'interno di ogni unità UCB limiti loro uso nella medicina rigenerativa e trapianto di HSC negli adulti. Espansione efficiente di HSCs umano funzionale può essere ottenuta ex vivo coltura delle CD34⁺ cellule isolate da UCBs e trattati con un inibitore delle deacetilasi, acido valproico (VPA). Il protocollo dettagliato qui descrive le condizioni di coltura e la metodologia per isolare rapidamente CD34⁺ cellule ed espandere ad un alto grado un pool di HSCs primitivo. Le HSCs espanso sono in grado di stabilire l'attecchimento sia a breve che a lungo termine e sono in grado di dar luogo a tutti i tipi di cellule ematopoietiche differenziate. Questo metodo inoltre tiene il potenziale per l'applicazione clinica di terapia genica con HSC autologa e fornisce un approccio attraente per superare la perdita di HSCs funzionale associata con il gene editing.

Introduzione

Ex vivo espansione di cellule staminali ematopoietiche (HSCs) da sangue del cordone ombelicale unità (UCB) tiene la grande promessa per applicazioni di HSC nella medicina rigenerativa e nella terapia di trapianto. Il trapianto con unità di UCB ha diversi vantaggi unici come collezione easy, disponibilità elevata, minimo rischio di infezione, basso rischio di ricaduta di malattia e bassa frequenza dell'innesto-contro la malattia ospite (GVHD). Tuttavia, gli svantaggi principali del loro utilizzo in ambito clinico sono il limitato numero di HSCs presenti all'interno di ogni unità UCB¹. Il numero insufficiente di HSCs provoca engraftment in ritardo e recupero ematopoietico, rischio di rigetto e di ricostituzione immunitaria aberrante.

Attualmente, sono state sviluppate vari metodi e strategie per ex vivo espandere il numero limitato di HSCs da UCBs. Combinazioni di diverse citochine cocktail con piccole molecole o composti in ex vivo culture causare vari gradi di espansione in HSC numeri^{2,3,4,5,6, 7,8}. D'importanza, ex vivo cultura condizioni inducono stress, portando a proliferazione rapida delle cellule, l'attività metabolica aumentata e perdita delle caratteristiche primitive che definiscono HSCs primario. Pertanto, sono necessari protocolli in via di sviluppo che portano all'espansione di un gran numero di HSCs funzionale con caratteristiche che assomigliano molto alle primarie HSCs primitivo.

Privo di siero culture di CD34⁺ cellule isolate da UCBs e trattate con risultato di (VPA) acido valproico nell'espansione di un gran numero di primitivo HSCs^4,9,10. L'espansione di HSC non è solamente dovuto la proliferazione delle HSCs esistente derivata da UCBs. Invece, questa espansione è dovuta all'acquisizione di un fenotipo primitivo combinato con un numero limitato di divisioni cellulari e proliferazione⁹. All'interno l'iniziale 24 – 48 h di incubazione con una combinazione di citochine e VPA, CD34⁺ le cellule acquisiscono un trascrittomica e profilo fenotipico che caratterizzano HSCs a lungo termine. L'aumento significativo della percentuale di HSCs è accompagnato da un rapido aumento del numero di HSCs (aumento di 63 volte entro 24 h del trattamento di VPA)⁹. In particolare, la strategia di espansione di VPA-ex vivo si espande HSCs con bassa attività metabolica, che evidenzia ulteriormente la loro caratteristiche primitive.

Il metodo qui descritto fornisce condizioni e trattamenti che conducono ad un grado significativo di ex vivo espansione di HSCs primitivo per uno clinica o applicazioni di laboratorio. Questo ex vivo la strategia di espansione utilizza un cocktail di citochina combinato con il trattamento di VPA. VPA è un farmaco approvato dalla FDA per il trattamento di disturbi bipolari e altre malattie neurologiche. L'espansione di HSC con VPA è veloce e si verifica entro 7 giorni, riducendo al minimo il tempo di manipolazione e il rischio di contaminazione. D'importanza, questo protocollo consente l'acquisizione di lungo termine marcatori fenotipici HSC come CD90 e CD49f entro 24-48 h dopo il trattamento con VPA⁹. Innesti HSC espansi creati con questo protocollo hanno la capacità di rigenerare il sistema ematopoietico poiché possono differenziarsi in tutti i lignaggi di cellule ematopoietiche e stabilire attecchimento a lungo termine dopo trapianto in topi NSG myeloablated modelli⁴. Inoltre, questo protocollo è altamente riproducibile e permette per l'isolamento efficiente e rapido di CD34 vitali⁺ cellule da UCBs, che è fondamentale per l'industrializzazione di questa procedura.

Il VPA ex vivo protocollo di espansione ha anche il potenziale per superare la perdita significativa di HSCs che si verifica durante il gene editing¹¹. Gene modifica richiede l'esposizione a citochine, che sono necessari per cellule ciclanti e attivazione dei meccanismi di riparazione del DNA. A causa degli effetti di richiesta del trattamento di VPA, questo metodo potrebbe essere utile per la generazione di un numero maggiore di cellule geneticamente modificate entro un periodo di tempo che è rilevante per attualmente utilizzati protocolli di modifica del gene.

Protocollo

L'HSC ex vivo protocollo di espansione segue le linee guida del comitato etico di ricerca presso la Mount Sinai School of Medicine.

1. buffer e preparazione di terreni

1. Preparare il tampone di separazione 24 h prima dell'isolamento di CD34⁺ cellule da lattine aggiungere 2 mL di 0.5 M etilene diammina Tetra-acetico (EDTA) e 33 mL di 7,5% albumina di siero bovino (BSA) a 465 mL tamponata di soluzione salina (1x PBS). Mescolare delicatamente e mantenere il buffer durante la notte a 4 ° C.
2. Supporto caldo a temperatura ambiente il giorno della purificazione.

2. isolamento di cellule mononucleari (MNCs) dall'unità di UCB

1. Erogare l'intera unità UCB in un matraccio da² di 75 cm. Diluire e mescolare delicatamente il UCB con un volume uguale di PBS a temperatura ambiente.
2. Determinare il numero di provette necessarie per elaborare l'intera unità UCB (una provetta conica da 50 mL può essere utilizzato per elaborare 35 mL di diluito UCB). Aggiungere 15 mL di media gradiente di densità (Vedi Tabella materiali) ad ogni provetta ed erogare il UCB diluito sulla parte superiore i supporti di gradienti di densità creando due strati.
   Nota: Dispensare il UCB diluito molto lentamente mentre si tiene il tubo ad angolo 45° per evitare la miscelazione del livello sfumatura media densità con il UCB.
3. Centrifugare a 400 x g per 30 min a un basso tasso di accelerazione e decelerazione. Dopo la centrifugazione, MNCs individuare nello strato bianco (buffy-coat) tra lo strato di pendenza media del plasma e la densità.
4. Aspirare lentamente 2/3 del plasma senza disturbare lo strato del buffy-coat. Trasferire con cautela lo strato del buffy-coat in una nuova provetta da 50 mL. Raccogliere tutti i MNCs dallo stesso gruppo UCB in una provetta da 50 mL fino a 25 mL. Usare un nuovo tubo se il volume dei raccolti MNC supera 25 mL.
5. Aggiungere 25 mL di PBS freddo nella provetta contenente 25 mL di MNC e mescolare bene. Centrifuga a 400 x g per 10 min a 4 ° C.
   Nota: PBS freddo è importante prevenire la tappatura di anticorpi sulla superficie delle cellule e ridurre il contrassegno non specifico.
6. Aspirare accuratamente il supernatante e Risospendere delicatamente il pellet cellulare in 50 mL di PBS freddo.
7. Rimuovere 20 μL della sospensione delle cellule per il conteggio. Contare il numero di cellule colorato con acridina arancio/propidio ioduro colorazione utilizzando un contatore di cellule automatizzato. Calcolare il numero totale dei MNC.
   Nota: Il conteggio delle cellule può essere anche eseguito con il metodo di esclusione blu di trypan utilizza un emocitometro.
8. Centrifuga a 400 x g per 15 min a 4 ° C.
   Nota: Se non richiesto immediatamente, MNCs può essere bloccata in questa fase.

3. isolamento di CD34 cellule di⁺ da UCBs

1. Preparare il CD34⁺ anticorpo accoppiato con soluzione di biglie magnetiche per l'isolamento di CD34 cellule di⁺ da MNCs. Mix 300 µ l di tampone di separazione con 100 µ l di IgG umane umane FcR (Reagente Bloccante) e 100 µ l di CD34 biglie magnetiche per l'isolamento di CD34 ⁺ cellule da ogni 10 MNCs di⁸ . Per l'isolamento di un maggior numero di CD34 cellule di⁺ da (> 10⁸) MNCs, scalare i reagenti di conseguenza.
2. Attentamente e aspirare il supernatante dal tubo centrifugato a passo 2.8. Risospendere il pellet nella soluzione di biglie magnetiche CD34 preparata al punto 3.1 (utilizzare 500 µ l di soluzione per 10⁸ cellule).
3. Mescolare delicatamente e incubare a 4 ° C per 30 min.
   Nota: Preparare il dispositivo separatore cellulare (Vedi Tabella materiali) durante il periodo di incubazione. Sostituire la soluzione di storage con il buffer di lavoro seguendo le istruzioni del fabbricante ed eseguire un programma di lavaggio seguito da un programma di risciacquo.
4. Aggiungi separatore freddo cellulare in esecuzione il tampone nella provetta contenente la miscela di cella fino a quando il tubo è riempito completamente. Centrifuga a 400 x g per 15 min a 4 ° C.
5. Aspirare il supernatante e risospendere il pellet cellulare nel separatore di cella fredda tampone (2 mL/10⁸ cellule) di corsa. Trasferire il 2 mL della miscela di sospensione cellulare in provette da 15 mL.
6. Caricare 3 set di provette da 15 mL in rack separatore cellulare prechilled a 4 ° C. Un insieme di tubi contiene MNCs, utilizzerà il secondo set di tubi per raccogliere la frazione negativa e verrà utilizzato il terzo set di tubi per raccogliere purificata CD34⁺ cellule.
7. Caricare il rack nel dispositivo separatore cellulare ed eseguire il programma preimpostato di posseld2 .
   Nota: Un metodo alternativo che utilizza il separatore magnetico manuale può essere utilizzato per sostituire il dispositivo di separatore cellulare¹² .
8. Provette per centrifuga con la frazione positiva a 400 x g per 15 min a 4 ° C. Aspirare il supernatante e risospendere purificata CD34⁺ cellule in 1 mL di terreno privo di siero.
9. Contare le celle colorate con acridina arancio/propidio ioduro utilizzando un contatore di cellule automatizzato.
   Nota: Se non richiesto immediatamente, purificato CD34⁺ le cellule possono essere congelate in questa fase.

4. VPA di espansione Ex Vivo di cellule purificate UCB-CD34⁺

1. Preparare un volume sufficiente di media per il CD34 purificata del piatto⁺ le cellule ad una densità di 3,3 x 10⁴ cellule/mL. La composizione di terreni di coltura è terreno di coltura libera del siero (Vedi Tabella materiali) completati con 10 µ l/mL penna/strep, fattore di 150 ng/mL cellule staminali (SCF), 100 ng/mL fms-come recettore tirosino-chinasico 3 (FLT3 ligand), 100 ng/mL trombopoietina (TPO), e 50 ng/mL interleuchina 3 (IL-3).
2. Piastra purificato CD34⁺ di celle in una piastra 12-pozzetti (5 x 10⁴ CD34⁺ cellule / 1,5 mL di media / bene) e coltura a 37 ° C in un incubatore di 5% CO₂ .
3. Valutare la purezza di CD34 isolato⁺ cellule e composizione cellulare mediante analisi Citofluorimetrica come descritto di seguito al punto 6.3.
4. Aggiungere VPA ad una concentrazione finale di 1 mM in culture di cellule trattate per 16 h con cocktail di citochina.
5. Coltura delle cellule per altri 7 giorni a 37 ° C in un incubatore di 5% CO₂ .
   Nota: Media rimane invariato durante tutta la durata dell'ex espansione vivo.

5. anticorpo che macchia per analisi di citometria a flusso

1. Preparare la soluzione di macchiatura dell'anticorpo a macchia 2 x 10⁴– 6 x 10⁴ celle e isotype soluzione per determinare la strategia di gating FACS e determinare il livello di legame non specifico. Diluire gli anticorpi (1/100 APC anti-CD34, 1/200 FITC anti-CD90) e i rispettivi isotipi in 50 µ l di tampone di separazione (composizione del buffer di separazione è definito al punto 1.1).
   Nota: Eseguire singole macchiatura delle cellule con ogni anticorpo per un FMO gating strategia. Anticorpo totale compensazione perlina kit (Vedi Tabella materiali) può essere utilizzato per l'installazione di compensazione.
2. Omogeneizzare la coltura delle cellule pipettando più volte. Contare le cellule e dispensare 5 x 10⁴ cellule in una provetta da 1,5 mL.
3. Aggiungere 1 mL di tampone di separazione e centrifuga a 400 x g per 15 min a temperatura ambiente.
4. Aspirare il supernatante e risospendere il pellet in 50 µ l di soluzione colorante. Incubare le cellule per 30 min a temperatura ambiente.
5. Aggiungere 450 µ l di tampone di separazione e centrifuga a 400 x g per 15 min a temperatura ambiente.
6. Aspirare il supernatante e risospendere il pellet in 100 µ l di tampone di separazione. Mantenere le cellule in ghiaccio per almeno 5 minuti fino a quando l'analisi di FACS. Aggiungere 1 µ l di 7-AAD a cancello di cellule vitali.
7. Caricare il campione di cellule macchiato sulla macchina FACS e acquisire le cellule alla minima portata.
8. Per ogni fluoroforo, analizzare l'isotipo controlli e cellule singole macchiate per impostare gating per FITC (CD90), APC (CD34) e la macchiatura PerCP/Cy 5.5 (7-AAD).
9. Cancello PerCP/Cy 5.5 negativo frazione e trama APC vs FITC per determinare la percentuale di CD34 vitali⁺, CD90⁺e CD34⁺CD90⁺ cellule che definisce la popolazione HSPC/HSC nella cultura.

6. anticorpo che macchia per flusso Cytometry Cell Sorting

1. Risospendere le cellule espanse di pipettaggio più volte. Contare il numero di cellulare e trasferire tutta la cultura in una provetta da 15 mL o 50 mL.
2. Riempire il tubo con il tampone di separazione freddo
3. Centrifuga a 400 x g per 15 min a 4 ° C.
4. Preparazione della soluzione di macchiatura dell'anticorpo a macchiare 5x10⁵– 2 x 10⁶ cellule e soluzione di isotipo di macchia 1x10⁵ cellule e determinare FACS gating. Diluire 1/10 (APC anti-CD34), 1/20 (FITC-CD90) anticorpi e il corrispondente isotipi in 500 µ l di separazione del buffer per ogni condizione.
5. Preparare i controlli di compensazione di singolo colore utilizzando un anticorpo totale compensazione perlina kit secondo le istruzioni del produttore.
6. Trasferire il surnatante dal punto 5.2 in un nuovo tubo e tenerlo a 37 ° C. Questa coltura verrà riutilizzata per coltura le cellule ordinate.
7. Risospendere il pellet cellulare in buffer di separazione freddo per ottenere una concentrazione di 5 x 10⁵ cellule / mL. Trasferire 1 x 10⁵ celle in tubi di 1,5 mL per la macchiatura di isotipo e le celle rimanenti che verranno ordinate in altre provette da 1,5 mL.
8. Centrifugare le provette a 400 x g per 15 min a 4 ° C.
9. Eliminare il supernatante e risospendere il pellet di cellule in isotype macchiatura soluzione e il pellet di cellule che verranno ordinati nell'anticorpo che macchia la soluzione.
10. Incubare per 30 min a 4 ° C.
11. Aggiungere 450 µ l di tampone di separazione e centrifuga a 400 x g per 15 min a 4 ° C.
12. Risospendere il pellet con 2 mL di tampone di separazione freddo.
13. Per evitare che gli zoccoli, filtrare i campioni attraverso un 40 μm cella filtro e posto su ghiaccio fino al FACS.
14. Classificatore celle di set-up per l'ordinamento con i parametri corretti.
15. Eseguire isotipo campioni per impostare tensione e guadagno per la marcia avanti e dispersione laterale e identificare popolazioni fluorescenza negativa.
16. Controlli di esecuzione singolo colore di fissare un coefficiente di compensazione e applicare compensata parametro di protocollo di raccolta.
17. Eseguire una piccola aliquota del campione (Ab) (~ 50.000 eventi) per stabilire la strategia di gating.
18. Impostare le decisioni di sorta per raccogliere il CD34⁺ CD90 frazione delle cellule^– .
19. Cellule di sorta nelle provette di raccolta rivestiti con 2 mL di tampone di separazione.
20. Dopo la cernita, raccontano le cellule e loro Centrifugare a 400 x g per 15 min a 4 ° C.
21. Eliminare il supernatante e risospendere il pellet in media ha recuperati nel passaggio 5.5 per raggiungere una concentrazione finale di 3 x 10⁴ cellule/mL.
22. Piastra di CD34⁺ CD90^– purificata cellule in 12 pozzetti con medie 1,5 mL/pozzetto (5 x 10⁴ CD34⁺ CD90^– cellule/1.5 mL di media/pozzetto).
23. Valutare la purezza mediante analisi Citofluorimetrica, utilizzando 50 µ l di cellule contenenti media.
24. Trattare le culture di CD34⁺CD90^– cellule con VPA alla concentrazione finale di 1mM.
25. Incubare a 37 ° C in un incubatore di 5% CO₂ .

Risultati

L'ex vivo protocollo descritto qui aumenta il numero di HSCs primitivo generato da CD34⁺ cellule isolate da UCBs (Figura 1). Priming di CD34⁺ cellule per 16 h con una citochina cocktail, seguita dal trattamento con VPA per un ulteriore 7 giorni, conduce ad un grande grado di espansione di HSC. Notevolmente, il pool di cellule espanse è altamente arricchito per HSCs, che sono definiti fenotipico di CD34⁺CD90⁺ marcato...

Discussione

Qui, presentiamo un protocollo per espandere rapidamente in modo significativo il numero di HSC umane funzionali da UCBs. Gli studi pilota e cinetici usando questo protocollo indicano che l'ex vivo cellule espanse prontamente acquisire e mantenere l'espressione di HSC diversi marcatori fenotipici tra cui CD90 così come primitivo HSC caratteristiche metaboliche⁹.

Questo ex vivo protocollo di espansione è relativamente semplice e affidabile. Purificazione di CD34⁺

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Terreni di dilatazione	Sigma-Aldrich	Stemline II Terreni di dilatazione per cellule staminali S0192-500ML
AO/PI (arancio acridina/ioduro di propidio) soluzione colorante per cellule nucleate di mammiferi vivi/morti.	Nexcelom	CS2-0106-25mL
APC Topo Anti-Umano CD34 Clone 581	BD BIOSCIENCE	555824
APC Topo IgG1, κ Clone di controllo isotipico MOPC-21	BD BIOSCIENCE	555751
autoMACS Soluzione di risciacquo	MACS Miltenyi Biotec	130-091-222
BD Falcon Tubo da 15 mL	BD Biosciences	352097
BD Falcon 5 mL Tubo in polistirene a fondo tondo	BD Biosciences	352063
BD Falcon Tubo da 50 mL	BD Biosciences	352098
Soluzione di albumina di siero bovino	Sigma-Aldrich	A8412
CD34 MicroBead Kit, contiene perle cd34 e reagente bloccante fcr, umano	Miltenyi Biotec	130-046-703
Analizzatore cellulare	BD Biosciences	FACS Canto II
Analizzatore e selezionatore cellulare	BD Biosciences	FACS Aria II
Contatore cellulare	Nexcelom	Cellometro Auto 2000 Cell Viability Counter
Cell separator device	autoMACS Pro Separator Miltenyi Biotec
Counting Chambers	Nexcelom	CHT4-PD100-002
Gradiente di densità	GE Healthcare Bio-Sciences AB	17-1440-03
Etilene diammina acido tetraacetico (EDTA)	Sigma-Aldrich	E8008-100ML
FITC anti-umano CD90 ( Thy1) Clone 5E10	BIOLEGEND	328108
FITC IgG1 di topo, κ Isotipo Ctrl (FC) Anticorpo	BIOLEGEND	400109
Microscopio
PBS	Corning cellgro	21-040-CV
Penicillina-Streptomicina	Thermo Fisher Scientific	15140122
Ricombinant Human Flt-3 Ligand Protein	R& D Systems	308FKN
Proteina umana ricombinante IL-3 (IL-3)	R& D Systems	203-IL
Proteina SCF umana ricombinante	R& D Systems	255-SC
Proteina della trombopoietina umana ricombinante (TPO)	R& D Systems	288-TP
Kit di perline di compensazione totale degli anticorpi	thermofisher	A10497
cordone ombelicale	presso il New York Blood Center	http://nybloodcenter.org/products-services/blood-products/national-cord-blood-program/cord-blood-101/
sale sodico dell'acido valproico	Sigma-Aldrich	P4543

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