Articolo metodologico

Metodi per testare la disgregazione endocrina nella Drosophila melanogaster

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DOI:

10.3791/59535

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3 luglio 2019

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1Institute of Biosciences and BioResources, National Research Council of Italy (CNR), 2Institute of Research on Terrestrial Ecosystems (IRET), National Research Council of Italy (CNR), 3Department of Biology, UniNa "Federico II"

In questo articolo

Sommario

Le sostanze chimiche interferenti endocrine (EDC) rappresentano un grave problema per gli organismi e per gli ambienti naturali. La Drosophila melanogaster rappresenta un modello ideale per studiare gli effetti della CED in vivo. Qui, presentiamo metodi per studiare la perturbazione endocrina nella Drosophila, affrontando gli effetti della CED sulla fecondità, la fertilità, i tempi di sviluppo e la durata della vita della mosca.

Abstract

Negli ultimi anni ci sono state sempre più prove che tutti gli organismi e l'ambiente sono esposti a sostanze chimiche ormonali-come, noto come sostanze chimiche interferenti endocrine (EDC). Queste sostanze chimiche possono alterare il normale equilibrio dei sistemi endocrini e portare a effetti negativi, nonché un numero crescente di disturbi ormonali nella popolazione umana o una crescita disturbata e una minore riproduzione nelle specie selvatiche. Per alcuni EDC, ci sono documentati effetti sulla salute e restrizioni sul loro uso. Tuttavia, per la maggior parte di loro, non c'è ancora alcuna prova scientifica in questo senso. Al fine di verificare potenziali effetti endocrini di una sostanza chimica nel tutto l'organismo, abbiamo bisogno di testarlo in sistemi modello appropriati, così come nel filo della frutta, Drosophila melanogaster. Qui riportiamo protocolli dettagliati in vivo per studiare la perturbazione endocrina nella Drosophila, affrontando gli effetti della CED sulla fecondità/fertilità, sui tempi di sviluppo e sulla durata della vita della mosca. Negli ultimi anni, abbiamo usato questi tratti della vita della Drosophila per studiare gli effetti dell'esposizione al 17-e-ethinylestradiol (EE2), al bisfenolo A (BPA) e al bisfenolo AF (BPA F). Complessivamente, questi saggi hanno coperto tutte le fasi della vita della Drosophila e hanno permesso di valutare la perturbazione endocrina in tutti i processi mediati dall'ormone. I saggi di fedia/fertilità e tempistica dello sviluppo sono stati utili per misurare l'impatto della CED sulle prestazioni riproduttive delle mosche e sugli stadi dello sviluppo, rispettivamente. Infine, il saggio della durata della vita ha coinvolto esposizioni croniche di EDC agli adulti e ha misurato la loro sopravvivenza. Tuttavia, questi tratti di vita possono anche essere influenzati da diversi fattori sperimentali che dovevano essere attentamente controllati. Quindi, in questo lavoro, suggeriamo una serie di procedure che abbiamo ottimizzato per il giusto risultato di questi saggi. Questi metodi consentono agli scienziati di stabilire interruzioni endocrine per qualsiasi EDC o per una miscela di diversi EDC in Drosophila, anche se per identificare il meccanismo endocrino responsabile dell'effetto, potrebbero essere necessari ulteriori saggi.

Introduzione

Le attività umane hanno rilasciato nell'ambiente una massiccia quantità di sostanze chimiche, che rappresentano un grave problema per gli organismi e per gli ecosistemi naturali1. Di questi inquinanti, si stima che circa 1.000 sostanze chimiche diverse possano alterare il normale equilibrio dei sistemi endocrini; in base a questa proprietà, sono classificati come sostanze chimiche interferenti endocrine (EDC). In particolare, sulla base di una recente definizione della Società Endocrina, i CED sono "una sostanza chimica esogena, o miscela di sostanze chimiche, che può interferire con qualsiasi aspetto dell'azione ormonale"2. Negli ultimi tre decenni, ci sono state sempre più prove scientifiche che i CED possono influenzare la riproduzione e lo sviluppo di animali e piante3,4,5,6,7, 8. Ulteriormente, l'esposizione alla CED è stata correlata alla crescente prevalenza di alcune malattie umane, tra cui il cancro, l'obesità, il diabete, le malattie della tiroide e i disturbi comportamentali9,10,11.

Meccanismi generali di EdC

A causa delle loro proprietà molecolari, gli EDC si comportano come ormoni o precursori ormonali3,4,5,6,7,8,9, 10,11,12. In questo senso, possono legarsi al recettore di un ormone e interrompere i sistemi endocrini sia imitando l'attività ormonale o bloccando l'attacco di ormoni endogeni. Nel primo caso, dopo il legame al recettore, possono attivarlo come farebbe il suo ormone naturale. Nell'altro caso, il legame della CED al recettore impedisce il legame del suo ormone naturale, quindi il recettore è bloccato e non può più essere attivato, anche in presenza del suo ormone naturale3. Di conseguenza, gli EDC possono influenzare diversi processi, come la sintesi, la secrezione, il trasporto, il metabolismo o l'azione periferica di ormoni endogeni che sono responsabili del mantenimento dell'omeostasi, della riproduzione, dello sviluppo e/o del comportamento l'organismo. L'associazione del recettore non è l'unico modo di agire descritto finora per gli EDC. Ora è chiaro che possono anche agire reclutando coattivatori o corepressor in percorsi enzimatici o modificando marcatori epigenetici che deregolamentano l'espressione genica10,11,12,13 ,14, con conseguenze non solo per la generazione attuale ma anche per la salute delle generazioni a venire8.

Ormoni della drosofilia

I potenziali effetti di EDC selezionati sono stati studiati ampiamente, sia nelle specie selvatiche che in diversi sistemi modello in cui i meccanismi endocrini sono ragionevolmente ben noti. Per gli invertebrati, i sistemi endocrini che influenzano la crescita, lo sviluppo e la riproduzione sono stati ampiamente caratterizzati negli insetti per diversi motivi, coinvolgendo il loro ampio uso nel campo della ricerca biologica, la loro importanza economica e infine lo sviluppo di insetticidi in grado di interferire specificamente con il sistema ormonale degli insetti parassiti.

In particolare, tra gli insetti, il viafrutto della frutta D. melanogaster si è dimostrato un sistema modello molto potente per valutare i potenziali effetti endocrini degli EDC. In D. melanogaster, così come nei vertebrati, gli ormoni svolgono un ruolo importante durante l'intero ciclo di vita. In questo organismo, ci sono tre principali sistemi ormonali, che coinvolgono l'ormone steroide 20-idrossiecdysone (20E)15,16, l'ormone giovanile sesprorpenoide (JH)17, e i neuropeptidi e peptidi/ proteine ormoni18. Questo terzo gruppo è costituito da diversi peptidi scoperti più di recente ma chiaramente coinvolti in una grande varietà di processi fisiologici e comportamentali, come longevità, omeostasi, metabolismo, riproduzione, memoria e controllo locomotore. 20E è omologa agli ormoni steroidei derivati dal colesterolo come estradiolo, mentre JH condivide alcune somiglianze con acido retinoico; entrambi sono gli ormoni più noti in Drosophila19,20. Il loro equilibrio è fondamentale nel coordinare la fiscie e la metamorfosi, nonché nel controllo di diversi processi post-sviluppo, come la riproduzione, la durata della vita e il comportamento21,offrendo così diverse possibilità di testare l'endocrino perturbazione nella Drosophila. Inoltre, gli ormoni ecriosteroidi e JH sono i principali bersagli dei cosiddetti insetticidi di terza generazione, sviluppati per interferire con i processi mediati endocrini dello sviluppo e riproduttivi negli insetti. La modalità d'azione agonista o antagonista di queste sostanze chimiche è ben nota, e quindi possono servire come standard di riferimento per valutare gli effetti dei potenziali EDC sulla crescita, la riproduzione e lo sviluppo degli insetti22. Ad esempio, il methoprene, che è stato ampiamente utilizzato nel controllo di zanzare e altri insetti acquatici23,24, funziona come un agonista JH e reprime la trascrizione genica e la metamorfosi indotta da 20E.

Oltre agli ormoni, la superfamiglia del recettore nucleare (NR) nella Drosophila è anche ben nota; è costituito da 18 fattori di trascrizione evolutivamente conservati coinvolti nel controllo dei percorsi evolutivi dipendenti dall'ormone, così come la riproduzione e la fisiologia25. Questi NR ormone appartengono a tutti i sei sottotipi di superfamiglia NR, compresi quelli coinvolti nella neurotrasmissione26, due per gli acido retinoico NRs, e quelli per gli steroidi NRs che, nei vertebrati, rappresentano uno degli obiettivi primari di EDC27.

La Drosophila come sistema modello per studiare gli EDC

Attualmente, sulla base di proprietà molecolari, diverse agenzie ambientali in tutto il mondo stanno attribuendo il potenziale di interferire con i sistemi endocrini a diverse sostanze chimiche artificiali. Dato che i CED sono un problema globale e onnipresente per l'ambiente e per gli organismi, l'obiettivo generale della ricerca in questo campo è ridurre il loro onere della malattia, nonché proteggere gli organismi viventi dai loro effetti negativi. Al fine di approfondire la comprensione circa i potenziali effetti endocrini di una sostanza chimica, è necessario testarlo in vivo. A tal fine, D. melanogaster rappresenta un sistema di modelli valido. Ad oggi, la mosca della frutta è stata ampiamente utilizzata come modello in vivo per valutare gli effetti di diversi EDC ambientali; è stato riferito che l'esposizione a diversi EDC, come lo ftalato diaill (DBP)28, il bisfenolo A (BPA), 4-nonylphenol (4-NP), 4-tert-octylphenol (4-tert-OP)29, metilparaben (MP)30, ethylparaben (EP)31 32, bis-(2-ethylhexyl) ftalato (DEHP)33, e 17-ethinylestradiol (EE2)34, influenza il metabolismo e le funzioni endocrine come nei modelli vertebrati. Diverse ragioni hanno portato al suo utilizzo come modello in questo campo di ricerca. Al di là di un'ottima conoscenza dei suoi sistemi endocrini, ulteriori vantaggi includono il suo breve ciclo di vita, il basso costo, il genoma facilmente manipolabile, una lunga storia di ricerca e diverse possibilità tecniche (vedi il sito web FlyBase, http://flybase.org/). D. melanogaster fornisce anche un potente modello per studiare facilmente gli effetti transgenerazionali e le risposte della popolazione ai fattori ambientali8 ed evita le questioni etiche rilevanti per gli studi in vivo su animali superiori. Inoltre, la mosca della frutta condivide un alto grado di conservazione genica con gli esseri umani che potrebbe consentire ai saggi della Dnosophila EDC di aiutare a prevedere o suggerire potenziali effetti di queste sostanze chimiche per la salute umana. Oltre ad ampliare la comprensione degli effetti sulla salute umana, la Drosophila può contribuire a valutare i rischi di esposizione della CED all'ambiente, come la perdita di biodiversità e il degrado ambientale. Infine, la mosca della frutta offre il vantaggio aggiuntivo di essere utilizzata nei laboratori, dove i fattori che potenzialmente influenzano il suo sviluppo, la riproduzione e la durata della vita possono essere tenuti sotto controllo al fine di attribuire qualsiasi variazione alla sostanza da testare.

Con questo in mente, abbiamo ottimizzato semplici e robusti saggi di fitness per determinare gli effetti EDC su alcuni tratti ormonali della Drosophila, come la fecondità/fertilità, i tempi di sviluppo e la durata della vita adulta. Questi saggi sono stati ampiamente utilizzati per alcuni EDC23,24,25,26,27. In particolare, abbiamo utilizzato i seguenti protocolli per valutare gli effetti dell'esposizione all'estrogeno sintetico EE234 e al BPA e al bisfenolo AF (BPA F) (dati inediti). Questi protocolli possono essere facilmente modificati per studiare gli effetti di un dato EDC alla volta, così come gli effetti combinati di più EDC in D. melanogaster.

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Protocollo

1. Preparazione degli alimenti

  1. Per la manutenzione delle scorte e per la crescita larvale, utilizzare un mezzo di farina di mais contenente lievito in polvere del 3%, il 10 % di saccarosio, il 9 % di farina di mais precotta, lo 0,4% di agar, successivamente chiamato Cornmeal medium (CM).
    1. Mettere 30 g di lievito in 100 mL di acqua di rubinetto, portarla a ebollizione e far bollire per 15 min.
    2. Separatamente, mescolare bene 90 g di farina di mais precotta, 100 g di zucchero e 4 g di agar in 900 mL di acqua di rubinetto.
    3. Portare la soluzione a ebollizione, abbassare il fuoco e cuocere per 5 minuti mescolando continuamente.
    4. Dopo 5 minuti, aggiungere la soluzione di lievito caldo e cuocere a fuoco lento per altri 15 min.
    5. Spegnere la fonte di calore e lasciare raffreddare la soluzione a circa 60 gradi centigradi.
    6. Aggiungere 5 mL/L di 10% metil4-idrossibenzolato in etanolo, mescolare accuratamente e lasciare sofforarsi per 10 min.
      NOT: Fare attenzione con la quantità di metile 4-idrossibenzoato, dato che un'alta concentrazione di fungicidi potrebbe essere letale per le larve.
    7. Distribuisci il mezzo in fiale/bottiglie: 8 mL in ogni flacone (25 mm x 95 mm), 3 mL in ogni fiala volante (22 mm x 63 mm) e 60 mL in ogni bottiglia di mosca (250 mL).
    8. Coprire le fiale con la garza e lasciarle asciugare a temperatura ambiente (RT) per 24 ore prima dello stoccaggio.
    9. Calibrare sperimentalmente la giusta consistenza e idratazione del CM modificando la quantità di agar utilizzata e/o i tempi di raffreddamento/essiccazione.
      Nota: le fiale scollegate, confezionate e avvolte sono stabili per circa 15 giorni a 4 gradi centigradi.
  2. Per gli adulti di Drosophila, utilizzare un mezzo contenente 10% lievito in polvere, 10% di saccarosio, 2% agar, successivamente chiamato mezzo adulto (AM).
    1. Mescolare 10 g di lievito in polvere, 10 g di saccarosio, 2 g di agar in 100 mL di acqua distillata.
    2. Portare questa miscela a ebollizione due volte, con un intervallo di 3 minuti, o fino a quando agar è sciolto, utilizzando un forno a microonde.
    3. Una volta che la soluzione si raffredda a 60 gradi centigradi, aggiungere 5 mL/L di 10% Methyl 4-idrossibenzoate in etanolo, mescolare accuratamente e erogare in fiale (10 mL per fiala).
    4. Coprire le fiale con la garza e lasciarle asciugare a RT per 24 ore prima di conservarle.
      NOTA: le fiale scollegate, confezionate e avvolte sono stabili per circa 15 giorni a 4 gradi centigradi.
  3. Per il test di fecondità/fertilità, utilizzare il mezzo di farina di succo di pomodoro Drosophila.
    1. Versare 70 mL di cibo caldo di farina di mais in un becher da 100 ml e aggiungere 30 mL di succo di pomodoro (30% v/v).
    2. Mescolare accuratamente con un robot da cucina e pipet 3 mL in piccole fiale.
    3. Coprire le fiale con la garza e lasciarle asciugare a RT per 24 ore prima dello stoccaggio.
      NOTA: le fiale scollegate, confezionate e avvolte sono stabili per circa 15 giorni a 4 gradi centigradi.
  4. Per la raccolta degli embrioni, utilizzare piastre di agar, contenenti 3% agar, 30% di salsa di pomodoro e 3% di zucchero.
    NOTA: fare attenzione a non fare bolle quando si versa il mezzo nelle piastre.

2. Dosare dedco EDC

  1. Preparare una soluzione di stock appropriata sciogliendo l'EDC selezionato nel solvente adatto. Per l'EE2 (peso molecolare 296.403), sciogliere 1,48 g in 10 mL di 100% etanolo per fare una soluzione di magazzino di 0,5 M e conservare a -80 gradi centigradi.
    ATTENZIONE: Gli EDC sono considerati inquinanti ambientali e devono essere prese precauzioni nella loro gestione.
  2. Diluire la soluzione di stock EE2 in 10% etanolo in acqua (v/v) per ottenere una soluzione di 100 mM. Effettuare le prossime diluizioni (0,1 mM, 0,5 mM e 1 mM) negli alimenti CM, iniziando con la concentrazione più bassa e utilizzando la stessa concentrazione finale di solvente per ciascun gruppo di trattamento. Per le fiale di controllo utilizzare lo stesso volume del solvente da solo.
    Nota: si raccomanda di mantenere la concentrazione finale del solvente il più basso possibile, tenendo presente che la concentrazione finale di etanolo non deve superare il 2% nel cibo a mosca.
  3. Aggiungere la soluzione contenente la giusta diluizione dell'EDC selezionato al cibo a base di farina di mais prima della solidificazione, mescolare accuratamente con un robot da cucina, erogare 10 mL in fiale, coprire con garza di cotone e lasciare asciugare a RT per 16 h prima dell'uso.
    NOTA: utilizzare questo supporto immediatamente dopo la sua preparazione.
  4. Per l'allevamento degli adulti, preparare diverse soluzioni EE2 funzionanti (rispettivamente 10 mM, 50 mM e 100 mM) nel 10% di etanolo in acqua (v/v) e nello strato 100 - L di ciascuna sulla superficie dell'AM, al fine di ottenere la concentrazione desiderata dell'EE2 (0,1 mM) 0,5 mM e 1 mM). Per il controllo utilizzare solo lo stesso volume del solvente.
    NOTA: in alternativa, aggiungere la soluzione contenente la giusta diluizione dell'EDC selezionato a una piccola quantità di AM in un tubo conico da 50 mL, vortice accuratamente e stratifi1l1 mL di esso sulla superficie delle fiale AM.
    1. Coprire le fiale con una garza di cotone, lasciare asciugare a RT per 12-16 h in leggera agitazione e utilizzarle immediatamente.
      NOTA: il processo di essiccazione deve essere regolato sperimentalmente perché dipende dall'umidità ambiente.
  5. Per nutrire il test, aggiungere sia la soluzione contenente la giusta diluizione dell'EDC selezionato (EE2 0,1 mM, 0,5 mM e 1 mM) sia un alimento da colorare (ad esempio, il colorante rosso n. 40 a 1 mg/mL)35 al CM prima della solidificazione, mescolare fortemente con un robot da cucina e quindi erogare e nelle fiale.

3. Volare

  1. Utilizzare un robusto ceppo isogenico, come Oregon R, mantenuto da più generazioni in laboratorio.
  2. Tenere le mosche in un'incubatrice umidificata e a temperatura controllata, con una luce naturale di 12 h: fotoperiodo scuro di 12 h a 25 gradi centigradi in fiale contenenti cibo CM.
  3. In ogni saggio, utilizzare fiale a RT.

4. Nutrire Assay

NOT: Questo test è consigliato per verificare se la presenza dell'EDC selezionato nel mezzo potrebbe influenzare l'alimentazione delle mosche.

  1. Mettere 15 mosche giovani in fiale contenenti CM integrato con diverse concentrazioni della CED selezionata e un alimento da colorare. Lasciare che le mosche si nutrono dei supporti per 1 giorno.
    NOTA:ad esempio, utilizzare il tintura rossa n. 4035 (1 mg/mL).
  2. Mettere 15 giovani mosche in fiale contenenti CM integrato con il solvente da solo e un alimento da colorare per il controllo. Lasciare che le mosche si nutrono dei supporti per 1 giorno.
  3. Anestesizza individualmente ogni gruppo di mosche con etere.
    1. Trasferire le mosche di ogni gruppo in un contenitore di vetro cilindrico (etherizer) con un imbuto inserito nell'estremità aperta, invertendo la fiala sopra l'imbuto e toccando delicatamente i due contenitori insieme per far cadere le mosche nell'eteratore.
      NOT:  L'imbuto impedirà loro di uscire dall'eterizza.
    2. Knock vola verso il basso toccando delicatamente l'eteratore su una superficie morbida, come un mouse-pad, e rapidamente sostituire l'imbuto con un cotone imbevuto di etere e tappo di garza.
    3. Attendere circa 1 min fino a quando le mosche cadono verso il basso e smettere di muoversi.
      NOTA: non superare il tempo o le mosche moriranno.
  4. Mettere mosche immobilizzate sotto uno stereo-microscopio e confrontare la colorazione addominale di ogni gruppo di trattamento rispetto al gruppo di controllo.

5. Saggio di fecondità/fertilità

  1. Per ogni concentrazione di EDC, preparare 3 fiale di mosche, successivamente chiamate fiale parentali, con 8 femmine e 4 maschi in cibo CM/EDC da 10 mL; per il controllo preparare 6 fiale di mosche con 8 femmine e 4 maschi in 10 mL cibo integrato con solvente. La parte posteriore vola in un'incubatrice a 25 gradi centigradi.
    NOTA: evitare larve di sovraffollamento durante il loro sviluppo e cercare di utilizzare densità larve coerenti tra i trattamenti.
  2. Dopo 4 giorni, rimuovere i genitori e restituire le fiale nell'incubatrice per altri 5 giorni.
  3. Nel tardo pomeriggio del giorno 9, togliere tutte le nuove mosche dalle fiale e mettere le fiale in un'incubatrice a 18 gradi durante la notte.
    NOT: Questa rimozione deve essere fatta con molta attenzione, controllando la superficie del pozzo medio.
    1. La mattina del giorno 10, per ogni gruppo di trattamento, raccogliere le femmine vergini e giovani maschi in due gruppi, sotto l'anestesizzazione leggeradi CO 2. Suddivisione casuale di ogni gruppo di mosche in piccoli sottogruppi (10 femmine e 20 maschi per fiala) in fiale indipendenti piene di CM fresco corrispondente.
      1. Ripetere il passaggio 5.3.1 avendo cura sia per rimuovere con attenzione tutte le mosche dalle fiale 8-10 h prima della raccolta e lasciare le fiale a 18 gradi centigradi, fino ad ottenere almeno 30 femmine vergini e 30 maschi per ogni concentrazione di EDC e almeno 90 femmine vergini e 90 maschi per il controllo.
    2. Ospitano questi gruppi di mosche a 25 gradi centigradi fino a quando non sono invecchiati 4 giorni dopo l'eclosione, trasferendoli in nuove fiale contenenti mezzo fresco corrispondente ogni due giorni.
      Nota: 4 giorni è tempo sufficiente per le mosche a diventare adulti maturi, ma è molto lontano dall'inizio della senescenza.
    3. Dopo due giorni assicurarsi che non ci siano larve nelle fiale delle femmine. Se lo fanno, le mosche non sono utilizzabili perché non sono vergini e devono essere scartate.
  4. Utilizzare 20 mosche singole di ogni sesso per ogni gruppo di trattamento per impostare 20 singole croci in piccole fiale contenenti un mezzo CM-pomodoro fresco senza EDC, come descritto di seguito.
    1. Ad ogni gruppo di trattamento assegnare una serie diversa di numeri sequenziali, che lo identifica in modo univoco ed etichettano le rispettive fiale; ad esempio, group1 (solo solvente) da 1 a 20, gruppo 2 (concentrazione EDC x) da 20 a 40 e così via.
    2. Fare un foglio di calcolo della fertilità per registrare le diverse serie, ognuna corrispondente a un gruppo di trattamento.
    3. Per ogni sesso anestesizzare tutte le mosche appartenenti a ciascun gruppo di trattamento sotto luce CO2 e trasferirle casualmente come segue.
      1. Trasferire una femmina trattata con solvente in una piccola fiala contenente un mezzo CM-tomato fresco senza EDC e aggiungere un maschio trattato con solvente per la croce di controllo.
        Nota: il succo di pomodoro deve essere aggiunto al mezzo durante la sua preparazione perché il mezzo scuro aumenta il contrasto con gli embrioni bianchi.
      2. Trasferire una femmina trattata con EDC in una piccola fiala contenente CM-pomodoro fresco senza EDC e aggiungere un maschio trattato con solvente per ogni trattamento.
      3. Trasferire un maschio trattato con EDC in una piccola fiala contenente un mezzo CM-tomato fresco senza EDC e aggiungere una femmina trattata con solvente per ogni trattamento.
    4. Casa tutte queste croci singole a 25 gradi centigradi.
  5. Trasferire ogni coppia di accoppiamento in fresche fiale CM-pomodoro senza EDC ogni giorno per i successivi dieci giorni. Etichettare le fiale replicate di ogni serie in sequenza; ad esempio 1-a, 1b, 1c...... 20a, 20b, 20c e riferire questi numeri sul foglio di calcolo della fertilità.
  6. Ispezionare visivamente ogni fiala ogni giorno per le uova e segnalare il loro numero sul foglio di calcolo della fertilità.
  7. Salva ogni fiala e, quando le mosche appena iniziano ad emergere, registra anche il numero giornaliero di progenie adulte nel periodo di 10 giorni. Dopo 10 giorni dall'accoppiamento iniziale, rimuovere i genitori.
    NOTA: scartare la fiala in cui uno o entrambi i genitori sono morti; in caso di fuga di uno o entrambi i genitori, includere nell'analisi tutti i dati fino al giorno in cui sono stati persi.
  8. Sommare il numero giornaliero di uova e il numero giornaliero di progenie adulte da ciascun gruppo di trattamento, per ottenere la fecondità/fertilità totale, la produzione media di uova e progenie adulte con una mosca per dieci giorni e il rapporto tra progenie totale e numero totale di uova deposte. Calcolare le differenze in percentuale di ogni valore di trattamento rispetto al controllo.
  9. Eseguire tre esperimenti indipendenti per ogni gruppo di mosche, utilizzando un minimo di 10 mosche per ogni gruppo di trattamento.
  10. Eseguire analisi statistiche per confrontare i diversi gruppi.

6. Tempi di sviluppo

NOT: Nei due protocolli alternativi seguenti la tempistica dello sviluppo viene valutata contando sia il numero di pupe che si formano al giorno sia il numero di eclosing di progenie adulte al giorno.

  1. Eclosione analisi protocollo 1
    1. Per ogni gruppo di trattamento, allestire 10 fiale di mosche giovani (<2 giorni), mosche sane, ognuna con 6 femmine e 3 maschi in cibo da 10 mL senza CED.
    2. Lasciate che vola sul cibo per 24 h, e lasciarli accoppiare.
    3. Preparare 10 fiale parallele per gruppo di trattamento con 10 mL ciascuno di alimenti freschi di farina di mais integrati con diverse concentrazioni di EDC o il solvente da solo per il controllo. Trasferire mosche accoppiate a queste nuove fiale.
      NOTA: per ogni gruppo di trattamento assegnare una serie diversa di numeri sequenziali, che lo identifica in modo univoco ed etichettare le rispettive fiale.
    4. Crea un foglio di calcolo per lo sviluppo per registrare le diverse serie.
    5. Lasciare che le mosche depongano le uova per 16 h. Quindi rimuovere i genitori dalle fiale.
      NOT: Le mosche dei genitori possono essere utilizzate per ripetere il passaggio 6.1.5, trasferendole ad altre fiale corrispondenti.
    6. Incubare fiale per 3-4 giorni a 25 gradi centigradi, o fino a quando non si forma più pupae. Ogni giorno conta il numero di nuove pupe in ogni fiala e segnalale sul foglio di calcolo dello sviluppo. Per evitare di contare due volte la stessa pupa, scrivere un numero in sequenza ad ogni pupa con un marcatore permanente all'esterno della fiala.
    7. A partire dal giorno 9, conta ogni giorno il numero di adulti emergenti fino a quando non sono emersi più adulti e segnalalo sul foglio di calcolo dello sviluppo.
    8. Da questi dati grezzi, calcolare il periodo larvale medio, il periodo pupa medio, così come le differenze di percentuale di ogni trattamento rispetto al controllo.
    9. Eseguire tre esperimenti indipendenti per ogni gruppo di mosche, utilizzando un minimo di 5 fiale per ogni gruppo di trattamento.
    10. Eseguire analisi statistiche per confrontare i diversi gruppi.
  2. Eclosion saggio saggio protocollo 2
    1. La donna femmina giovane e sana (circa 150) e il maschio (circa 50) vola su una gabbia di raccolta (Tabella dei materiali) con mezzo agar-tomato integrato con pasta di lievito fresco (3 g di lievito di panettiere in 5 mL di acqua), successivamente chiamato vassoio di posa, per 2 giorni a 25 gradi centigradi.
    2. Durante questi 2 giorni, lasciare che le mosche si acclimati alla gabbia in un luogo buio e tranquillo, prima di iniziare la raccolta delle uova, e cambiare il vassoio di deposizione due volte al giorno.
    3. Il terzo giorno, cambiare il vassoio di posa la mattina presto. Dopo 1 h, sostituire il vassoio di posa, scartando queste uova deposte.
    4. Lasciare le mosche a deporre le uova per 2 h e sostituire con vassoio di posa fresco.
      NOT: Entro il giorno 3, un buon vassoio di posa dovrebbe produrre 100-200 uova in 2 h.
    5. Per ogni gruppo di trattamento, preparare una serie di tre piatti da 60 mm contenenti cibo di farina di mais di pomodoro integrato con la corrispondente concentrazione di EDC o con solvente da solo e segnalare ogni serie nella tempistica del foglio di calcolo dello sviluppo. In alternativa, se lo si preferisce, utilizzare fiale invece di piatti.
    6. Raccogliere delicatamente le uova al microscopio utilizzando un pennello o una sonda e trasferirle nella parte superiore del mezzo in ogni piatto / fiala. Al fine di facilitare il conteggio, sul vassoio di posa, disporre le uova in 5 gruppi di 10 ciascuno e trasferirle una alla volta.
      NOT: Ripetere il passaggio 6.2.4 tutte le volte che è necessario per ottenere un numero sufficiente di embrioni.
    7. Casa tutti questi piatti / fiale a 25 gradi centigradi. Conservare anche ogni vassoio di posa a 25 gradi centigradi e contare il numero totale di uova deposte.
    8. Dopo 24-30 h, controllare ogni piatto / fiala sotto uno stereomicroscopio e contare sia il numero di ovuli bianchi non fecondati che il numero di embrioni morti scuri.
    9. Sottrarre il numero di ovuli bianchi non fecondati dal valore di 50 ovuli trasferiti per ottenere il valore "embrioni totali" per piatto/fiala. Il numero di embrioni morti scuri può essere utilizzato per determinare potenziali effetti tossici della CED durante l'embriogenesi.
    10. Ripetere i passaggi 6.1.6-6.1.10 del protocollo Eclosion assay 1.

7. Protocollo Lifespan

  1. Impostare 20 fiale di mosche con 8 femmine e 4 maschi e casa a 25 gradi c in CM (10 mL ciascuno).
  2. Dopo 4 giorni scartare mosche e mettere fiale di nuovo in incubatrice.
    NOTA: queste mosche possono essere utilizzate per ricominciare per ottenere altre coorti sincronizzate in base all'età delle mosche.
  3. Nel tardo pomeriggio della giornata 9, rimuovere tutte le nuove mosche dalle fiale e tornare fiale all'incubatrice.
    Nota: alcuni adulti dovrebbero iniziare a chiudere già il nono giorno; scartare queste mosche permette di raccogliere un numero massimo di mosche sincronizzate, evitando l'incurante selezione dei primi emergenti.
  4. 16-24 h più tardi, trasferire le mosche adulte (1 giorno di età) di entrambi i sessi in quattro gruppi di bottiglie da 250 mL contenenti alimenti AM integrati con tre diverse concentrazioni di CED e uno con il solo solvente. Se necessario, raccogliere un altro batch il giorno successivo.
  5. Mantenere le mosche a 25 gradi centigradi per 2-3 giorni per permettere loro di accoppiarsi.
    NOTA: il giorno del trasferimento alle fiale alimentari AM corrisponde al primo giorno di età adulta.
  6. Dopo due-tre giorni, ordinare ogni coorte di mosche per sesso in due gruppi sotto anestesizzazione leggeradi CO 2. Suddivisione casuale di ogni sesso in cinque fiale per trattamento ad una densità di 20 individui per fiala, fino a quando non ci sono tre repliche di 5 fiale parallele per ogni genere per ogni trattamento.
    NOT: Lavorare con piccoli gruppi di mosche al fine di prevenire possibili problemi di salute di lunga durata a causa di lungo tempo di esposizione a CO2.
  7. Preparare un foglio di calcolo della durata della vita in cui il numero di mosche morte viene sottratto dal numero di mosche sopravvissute al trasferimento precedente, in modo da ottenere automaticamente il numero di sopravvissuti ad ogni trasferimento.
  8. Trasferimento vola in nuove fiale contenenti il cibo corrispondente ogni 3 giorni allo stesso tempo e controllare la morte.
    NOTA: il trasferimento deve avvenire senza anestesia che potrebbe avere un effetto negativo a lungo termine sulla longevità del volo.
    1. Ad ogni trasferimento, registra l'età delle mosche e il numero di mosche morte.
      NOTA: il numero di mosche sopravvissute viene calcolato automaticamente nel foglio di calcolo, ma si consiglia di controllarlo visivamente. Le mosche che accidentalmente fuggono o muoiono durante il trasferimento non devono essere considerate. Fare attenzione a non contare due volte le mosche morte trasportate alla nuova fiala che riporta questa nota nel foglio di calcolo.
    2. Ripetere i passaggi 7.8 e 7.8.1 fino a morire tutte le mosche.
  9. Per ogni gruppo di trattamento, creare una curva di sopravvivenza come illustrato nella Figura 6, al fine di visualizzare la probabilità di sopravvivenza di una mosca in un determinato momento.
  10. Eseguire tre esperimenti indipendenti per ogni gruppo di trattamento delle mosche, utilizzando 100 mosche appena echiuse per ogni esperimento.
  11. Preparare una tabella in cui segnalare la durata media della vita (giorni di sopravvivenza medi di tutte le mosche per ogni gruppo), la mezza età (periodo di tempo in giorni necessari per raggiungere il 50% di mortalità) e la durata massima della vita (quantità massima di giorni necessari per raggiungere il 90% di mortalità).
  12. Calcolare le differenze di percentuale tra ogni gruppo di trattamento rispetto al gruppo di controllo.
  13. Eseguire analisi statistiche per confrontare i diversi gruppi di trattamento.

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Risultati

In questa sezione, i passaggi chiave dei protocolli di cui sopra sono riportati sotto forma di schemi semplificati. Dato che le mosche tendono ad evitare composti sgradevoli, la prima cosa da fare è quello di testare il gusto della CED selezionata. Questo può essere fatto mescolando una colorazione alimentare (ad esempio, colorante alimentare rosso n. 40)35 con il cibo integrato con l'EDC selezionato a varie dosi o con il solvente da solo. Le mosche alimentate su questi mezzi di comunicazione sono...

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Discussione

Il fly d. melanogaster è stato ampiamente impiegato come sistema modello in vivo per studiare i potenziali effetti di EDC ambientali come DBP28, BPA, 4-NP, 4-tert-OP29, MP30, EP31, 32, DEHP33ed EE234. Diverse ragioni hanno portato il suo utilizzo come modello in questo campo di ricerca. A parte i suoi indiscussi vantaggi come sistema m...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Gli autori ringraziano Orsolina Petillo per il supporto tecnico. Gli autori ringraziano la Dott.ssa Mariarosaria Aletta (CNR) per il supporto bibliografico. Gli autori ringraziano il Dr. Gustavo Damiano Mita per averli introdotti nel mondo EDC. Gli autori ringraziano Leica Microsystems e Pasquale Romano per il loro aiuto. Questa ricerca è stata supportata dal progetto PON03PE_00110_1. "Sviluppo di nanotecnologie Orientate alla Rigenerazione e Zzie Tissutale, Implantologia e Sensoristica in Odontoiatria/oculistica" acronimo "SORRISO"; Committente: PO FESR 2014-2020 CAMPANIA; Progetto PO FESR Campania 2007-2013 "NANO PERTECNOLOGIE O SOLAVOLTAO VOLTA E MOLECOLE BIO-ATTIVE NANO".

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
17&alfa;-EtinilestradioloSigmaE4876-1G
Agar per Drosophila mediumBIOSIGMA789148
Bisfenolo ASigma239658-50G
Bisfenolo AFSigma90477-100MG
Farina di maisCA' BIANCA
Etere dietilicoSigma
Fiale di DrosophilaBIOSIGMA78900825 mm x 95 mm
Fiale di DrosophilaBIOSIGMA78900929 mm x 95 mm
Fiale di DrosophilaKaltek18722 mm x 63 mm
Gabbia di raccolta embrioniCraftsCilindro in plexiglass (12,5 mm x7 cm) con un'estremità aperta e l'altra estremità chiusa da una base rettangolare in cui una fessura consente l'inserimento di vassoi speciali per la posa
di etanoloFLUKA2860
EtherizerCraftscontenitore cilindrico in vetro con tappo in cotone
Bottiglia in vetro Bottiglieda 250 ml Fiale
in vetroMicrotechST 10024Tubo a fondo piatto 100 x 24
Frullatore a immersione PimmyArieteda cucina
Instant Lievito di successoESKALievito in polvere
Vassoio di posaArtigianatovassoi in plexiglass (11 cm x 2,6 cm) in cui versare il terreno per la posa
Metil4-idrossibenzoatoSIGMAH5501
Piastra di PetriFalco35101660x5
Colorante rosso n. 40SIGMA16035
Stereomicroscopio con luci LEDLeicaS4E
SaccarosioHIMEDIAMB025
Salsa di pomodoroCirio
robot

Riferimenti

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